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鼓泡式生物反应器培养人参不定根的研究作者：左北梅,高文远,王娟,尹双双,刘辉,张黎明来源：《中国中药杂志》2012年第24期[摘要] 目的：研究鼓泡式生物反应器对人参不定根培养的影响。
方法：利用组织培养技术结合高效液相色谱法和紫外分光光度法，考察不同角度的鼓泡式生物反应器对人参不定根生长及人参不定根有效成分皂苷和多糖合成的影响。
结果：不同生物反应器培养人参不定根中，适合培养人参不定根生长的最佳反应器类型为120°圆锥型鼓泡式生物反应器。
测定120°圆锥型反应器内的人参不定根生长呈典型的“S”型曲线。
人参不定根在第40 天得到最大的生物量，并且鲜重、干重、干重增殖倍数都达到了最大值，分别为113.15 g，9.62 g，63.13倍。
人参不定根总皂苷和多糖质量分数为2.25 mg·g-1和2.73%。
结论：适合培养人参不定根的最佳反应器为120°圆锥型鼓泡式生物反应器。
该实验为工业化生产人参有效活性成分奠定基础。
[关键词] 人参；不定根；鼓泡式生物反应器；人参皂苷；人参多糖[稿件编号] 20121010006[基金项目] 国家科技支撑计划项目（2012BAI29B02）；天津市科技支撑计划重点项目（09ZCKSH01100）[通信作者] *高文远，Tel/Fax：（022）87401895，E-mail： pharmgao@ 人参Panax ginseng C. A. Meyer为五加科人参属珍贵药用植物，多年生双子叶植物，其干燥根可入药，被誉为药中之王。
含有人参皂苷、人参多糖等多种物质，可增强机体对各种应激刺激的非特异抵抗力，具有抗衰老、免疫调节、降血糖、保肝、护肝、抗肿瘤多种医疗保健功效[1]。
作为中国传统名贵中药材之一的人参，其应用已经扩展到医药、保健品、美容护肤品等多个领域。
随着国际社会对中医药理论的逐步了解和认可，人参的需求将会越来越大，而当前占据市场主导的栽培人参并不能经济、合理、可持续地解决人参的资源问题。
1、生物反应器按反应器内有机体种类，可以分为微生物反应器，植物细胞反应器，动物细胞反应器，酶反应器2、高压蒸汽灭菌锅由内锅、外锅、门盖、压力表、温度计、排气阀、安全阀、电热管、蒸汽发生器等部件构成3、搅拌器的叶轮有多种形式，有涡轮式和螺旋桨式两种4、离心加速度与重力加速度之比叫离心分离因数，它是离心分离设备的重要性能指标，值愈高，离心沉降效果愈好。
5、鼓泡塔式发酵罐由塔体、筛板、空气分布器、降液管组成6、水分与物料间借助化学或物理化学力结合的水分，称为结合水分7、生物反应器按按结构特征，可以分为罐式反应器，管式反应器，塔式反应器，膜式反应器8、维持罐结构主要由筒体、夹套、进料管、出料管、排尽管和测温口组成.9、高压均质机由高压泵和均质头两部分组成10、当悬浮液流动通过多孔介质时，固体颗粒沉积在过滤介质表面形成滤渣层，这种过滤称为滤饼过滤。
11、萃取反应中，萃取剂为被萃取物在其中溶解度很高的溶剂;萃取液为大部分溶质转移到萃取剂里，得到的溶液;萃余液为经过萃取分离出某种物质或几种物质的水相12、三级错流萃取过程中，第一级的萃余液作为料液进入第二级，并加入新鲜萃取剂进行萃取。
第二级的萃余液再作为第三级的原料液，也同样用新鲜萃取剂进行萃取，将三级萃取液合并送入贮存罐贮存备用13、好氧发酵罐一般可以分为机械搅拌通风发酵罐，气升式发酵罐，自吸式发酵罐，鼓泡塔式发酵罐14、离心沉降中当颗粒处于离心场时，将受到四个力的作用，即重力、惯性离心力、向心力和阻力。
15、在机械设备挤压等操作下进行的干燥，称为机械干燥。
将物料置放在常压下进行的干燥，称为常压干燥。
将物料置放在真空环境中进行的干燥，称为真空干燥16、固体颗粒进入并沉积在多孔介质孔道内，溶液经孔道内的缝隙进入滤液的分离过程称为深层过滤。
17、在多级逆流萃取中，只在最后一级中加入萃取剂，故和三级错流萃取相比，萃取剂的消耗量较少。
随着级数的增加，萃取液中组分的浓度逐级升高。
1.间歇培养或分批培养：微生物在化学成分一定的培养基中进行培养..同步培养：培养基中所有细胞处于同一生长阶段;群体与个体的行为一致..2.芽孢：某些细菌在生长的一定阶段;细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形;对不良环境条件具有较强抗性的休眠体..3.伴孢晶体：有些芽孢杆菌在形成芽孢的同时;在细胞内产生晶体状内含物..4.连续培养：在对数生长期的培养容器中不断加入新鲜的培养基;同时不断放出代谢物;使微生物所需的营养及时得到补充;有害的代谢产物及时排除;菌体的生长不受影响 ..5.发酵热：发酵过程中释放出来的净热量..6.原生质体融合：通过人工的方法;使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合;并产生重组子的过程..7.营养缺陷型菌株：野生菌株经过人工诱变处理后;丧失了合成某种营养物质的能力;这些菌株生长的培养基中必需添加该种营养物质..8.接合：通过供体菌和受体菌的细胞直接接触、传递大段DNA包括质粒遗传信息的现象..整合：外来DNA片段插入染色体中的过程..9.转导：借助噬菌体;把供体细胞中DNA片段携带到受体细胞中;从而使后者获得前者部分遗传性状的现象..10.转染：将病毒的DNA或RNA人为地抽提分离出来;用它来感染感受态的受体细胞;并进而产生正常病毒的后代;是特殊的“转化”..11.转化：某一基因型的细胞直接从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA;并将它整合到自己的基因组中;造成基因型和表型发生相应变化的现象..12.巴斯德效应：指在厌氧条件下;向高速发酵的培养基中通入氧气;抑制糖酵解的现象..13.半合成抗生素：通过人工化学合成的方法对它的结构进行修饰与改造;把它的“短板”弥补上;扬长避短;发挥更好的效力..因为是基于它原有的结构作为起始原料..14.组成酶：它的合成与环境无关;随菌体形成而合成;是细胞固有酶;在菌体内的含量相对稳定..15.诱导酶：只有在环境中存在诱导剂时;才开始合成;一旦环境中没有了诱导剂;合成就终止..同工酶：催化相同的化学反应;而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶..16.初级代谢产物：对微生物的生产是必需的;与微生物细胞的形成过程同步..如氨基酸、核苷酸、乙醇等..17.次级代谢产物：对微生物的生存;生长或繁殖不是必需的;以初级代谢产物为前体;形成的高峰在微生物生长的稳定期后期或衰亡期..如抗生素、生长激素、生物碱、维生素、色素、毒素等..18.抗原：任何可诱发免疫反应的物质..19.抗体：指机体的免疫系统在抗原刺激下;由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白..20.补料分批培养：根据菌株生长和初始培养基的特点;在分批培养的某些阶段适当补加培养基;使菌体或其代谢产物的生长时间延长..半连续培养或流加培养21.活性污泥：是由污水中繁殖的好气性微生物群体组成的絮状污泥;具有很强的吸咐、凝聚和氧化分解污水中有机物质和其它物质的能力..22.生理性酸性物质：经微生物代谢后能形成酸性物质的无机氮源;如硫酸胺..23.生理性碱性物质：经微生物代谢后能产生碱性物质的无机氮源;如硝酸钾..24.气升式生物反应器：采用内环流气升式中心进气的反应器;内部无搅拌装置;是在传统的鼓泡塔中加入导流筒构成的..当气体通过气体分布器进入中心导流筒后;造成管内流体密度比管外低;在静压差和进入气体的动量作用下;使液体携带气泡在反应器内形成循环流动;从而达到良好的气液混合..25.高温短时灭菌：利用高温使微生物的蛋白质及酶发生凝固或变性而死亡..26.红曲米：以籼稻、粳稻、糯米等稻米为原料;用红曲霉菌发酵而成;棕红色或紫红色的米粒..27.半合成培养基：由天然材料和已知的纯化学药品组成的培养基..28.天然培养基：利用生物的组织、器官及其抽取物或制品配成的培养基..29.合成培养基：成分完全了解的化学药品配成的培养基..基本培养基：满足野生型菌株最低营养要求的合成培养基..完全培养基：;在基本培养基中加入富含生长因子的营养物质;满足各种营养缺陷型菌株的生长需要的培养基30.菌种复壮：在菌种发生退化后;通过纯种分离和性能测定;从退化群体中;找出未退化的个体;以达到恢复该菌株原有形状..31.光复活作用：将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下;菌体的突变率和致死率均下降..31.革兰染色法：初染草酸铵结晶紫---紫色;媒染碘液—紫色;脱色95%乙醇---无色或紫色;复染沙黄番红----无色被染成红色;紫色仍为紫色......革兰氏阳性菌为紫色；革兰氏阴性菌被染成红色..革兰氏阳性菌：垣酸磷壁酸革兰氏阴性菌：脂多糖内毒素32.放线菌主要通过无性孢子进行繁殖..33.放线菌：链霉菌；抗生素：链霉素、土霉素、博来霉素、卡那霉素34.单细胞蛋白：一类源于酵母菌或其他微生物的蛋白..SCP35.核糖体的沉降系数：原核生物70S50S/30S;真核生物80S60S/40S..36.芽殖是酵母菌最常见的繁殖方式..37.假酵母：只进行无性繁殖的酵母菌..真酵母：能进行有性繁殖的酵母菌..无性繁殖：不经生殖细胞结合;由母体直接产生子代的繁殖方法..38.嘧啶比嘌呤对紫外线更敏感..嘧啶多;紫外线照射造成DNA断裂..39.有些细菌能直接利用纤维素和半纤维素发酵..40.一个物种的学名由属名字首大写+种名字首小写;学名应为斜体字..41.基因重组：两个不同性状个体内的基因转移到一起;形成新的遗传型个体..42.质粒：游离于染色体外;具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA..43.菌落：单个细胞在有限的空间中发展成肉眼可见的细胞堆..44.物理灭菌：高温灭菌法;紫外线灭菌;过滤除菌;微波灭菌;γ射线灭菌..高温引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活;导致微生物死亡..过滤除菌：绝对过滤器---拦截作用;通过控制孔的大小除去一定大小范围的颗粒;惯性碰撞、扩散、吸附等作用除去比孔径小的颗粒..缺点是流动阻力造成巨大的压力降..紫外线灭菌：作用于DNA;形成胸腺嘧啶二聚体;造成菌体死亡..对芽孢;细胞起作用;穿透力弱;不能透过普通玻璃..物体表面和空间的消毒..γ射线灭菌：密封物体;不耐热物体灭菌;不留下污染物..医用一次性塑料用品..微波灭菌：微波造成分子加速运动使细胞内部受到损害;导致微生物死亡..加热均匀;热能利用率高;穿透力强;加热时间短;用于培养基灭菌;酒类消毒..45.细菌生长曲线：调整期、对数生长期、稳定期、衰亡期..①调整期：菌体质量增加;体积增大；菌体代谢非常活跃;生产诱导酶;辅酶及某些中间代谢产物；对外界理化因素影响的抵抗能力较弱..工业指导：缩短调整期;采用适当菌龄对数生长期的健壮菌种;发酵培养基的组成应接近种子培养基..②对数生长期：菌体数高数增长；易受培养温度影响;接近最适生长温度；该阶段前期的细胞对理化环境敏感；菌体大小;形态;生理特征比较一致;大多单个存在工业指导：研究微生物遗传和代谢性能;生产接种的种子③稳定期：活菌数动态平衡;细胞分裂速度下降;细胞内开始积累内含物;产芽孢适应不利的环境；开始合成次级代谢工业指导：菌体在该阶段收获；某些代谢产物、酶的收获期④衰亡期：活菌数下降;细胞内颗粒更明显;出现液泡;细胞出现畸形;芽孢开始释放;因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用;菌体死亡、自溶;有的微生物继续产生次级代谢产物;衰亡期比其他各期时间更长..工业指导：46.抗生素：低分子质量的微生物代谢产物;能够在很低的浓度下抑制其他微生物生长..抑制蛋白质合成：链霉素、大庆霉素、四环素、红霉素大的内酯环抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类、单环内酰胺抑制DNA合成：蒽环类;道诺红霉素RNA聚合酶的抑制剂：利福霉素；抑制细胞膜合成：两性霉素B47.溶源性细菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源噬菌体不敏感;可以进入溶源性细菌;但不能增殖;不能导致细菌裂解;有免疫性..前病毒或原病毒：在动植物中;整合到细胞染色体中的病毒DNA..温和性噬菌体或溶源性使菌体：感染细胞后;并不马上引起细胞裂解;而是以原噬菌体方式整合到宿主的DNA中;随寄主繁殖而延续传代的噬菌体..带有原噬菌体的细菌称为溶源性细菌..溶源性是细菌的遗传特性..每个溶源性细菌的子细胞也有溶源性..溶源性噬菌体特点：具有产生噬菌体的潜在能力；具有抗同源噬菌体感染的免疫性；溶源性细菌的复愈；获得新的生理特性..溶原转变：当温和性噬菌体感染宿主而使它发生溶原化;因噬菌体的基因整合到宿主基因组上;使宿主获得除免疫性以外性状的现象..检测是否是溶源性细菌：将待测菌样在合适的培养基中培养;在生长的对数期进行紫外线照射;诱导原噬菌体复制..进一步培养后;将培养物滤去;除去活菌体;将滤液与指示菌混合后倒入平皿;如果有噬菌斑出现;则被测菌是溶源性细菌..指示菌是敏感的、非溶源性的菌株..48. 筛选菌株平皿快速检测法：利用菌体在特定固体培养基平皿上的生理反应;将肉眼观察不到的性状转化成可见的形态..生长圈法：工具菌为营养缺陷型菌株;筛选氨基酸、核苷酸、维生素的生产菌..生产菌周围环绕生长工具菌..透明圈法：在固体培养基中掺入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分;造成浑浊不透明的培养基背景..在待测菌落周围会形成透明圈;透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力..检测菌株产淀粉酶;蛋白、酸的能力..变色圈法：将指示剂直接掺入固体培养基中;进行待筛选菌培养;变色圈越大;菌落产酶能力越强..判断水解产物的情况抑制圈法：春雷霉素生产菌的筛选..49.衣原体对四环素、红霉素、氯霉素;磺胺类药物敏感..对NISIN不敏感..50.霉菌：在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝体的真菌..霉菌的无性孢子：孢子囊包子、分生孢子、厚垣孢子、节孢子；霉菌的有性孢子：卵孢子、接合孢子、子囊孢子51.突变：染色体数目变化;染色体结构的变化、染色体局部座位内的变化..最后一种即;基因突变;点突变..分为碱基置换、移码突变、缺失、插入..碱基置换：错义突变、无义突变、同义突变、沉默突变..52.支原体、衣原体、病毒可通过细菌过滤器；细菌、立克次体不能通过细菌过滤器..53.菌株退化的原因及防治方法：菌种退化：生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失..产生原因：控制生产性状的基因发生负突变基因突变..由于诱变;后代发生分离现象分离现象防止方法：1.菌株选育——使用孢子或单核菌株;诱变处理后;进行充分的后培养及分离提纯;保证菌株纯度;增加突变点位的筛选..2菌种保藏——控制菌种的传代次数;采用斜面保藏;采用沙土管、冻干管和液氮管等能长期保藏的手段..3菌种培养——控制碳源、氮源、PH值和温度;避免出现对生产菌不利的环境4菌种管理——定期使菌种复壮..54.工业微生物的特点：遗传性状稳定；生长速度快;不易被噬菌体等污染；目标产物的产量接近理论转化率；目标产物最好能分泌到胞外;以降低产物抑制并利于产物分离..；尽可能减少产物类似物的产量;以提高目标产物的产量及利于产物分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度;pH、离子强度等环境因素不敏感；对溶氧的要求低;便于培养及降低能耗..55.微生物营养类型：光能自养型：绿硫细菌、红硫细菌、蓝细菌光能异养型：红螺菌化能自养型：氢细菌、硫细菌、铁细菌、硝化细菌化能异养型：真菌、大多数细菌、放线菌56.pH:细菌7-8；放线菌7.5-8.5；酵母菌3.8-6；霉菌4-5.857.生长因子：氨基酸、维生素、碱基、脂肪酸固醇、胆碱、肌醇58.放线菌的基内菌丝功能是吸收营养物质..59.细胞壁的主要成分细菌：肽聚糖、脂多糖、脂蛋白、垣酸磷壁酸为革兰氏阳性菌特有..酵母菌：甘露聚糖;葡聚糖霉菌：几丁质60.培养基的配制原则：营养物质应满足微生物的需要：菌种对各营养要素的不同要求进行配制..营养物的浓度及配比应恰当;碳氮比;考虑避免培养基中各物质之间的相互作用..物理化学条件适宜;pH根据培养目的：培养菌体;或积累菌体代谢产物;产物是初级代谢产物还是次级代谢产物..培养基各成分的来源和价格;优先选用来源广泛、价格低廉的培养基..61.微生物发酵过程中;引起pH改变的原因：大多数微生物分解糖;产生酸性物质;造成pH下降；少数微生物分解尿素生产氨;使pH上升..过酸：加氢氧化钠、碳酸钠治标；加尿素、硫酸铵、蛋白质;提高通气量治本过碱：加硫酸;盐酸治标；加糖、乳酸、油脂;降低通气量治本在培养基中加入磷酸缓冲液或碳酸钙..62.分批发酵、补料分批发酵、连续发酵的优缺点：分批发酵：优点-对温度的要求低;工艺操作简单；比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；对营养物的利用效率较高;产物浓度也比连续发酵要高..缺点-人力、物力、动力消耗较大；生产周期较短；生产效率低补料分批发酵：优点-可以消除底物抑制；达到高密度细胞培养；延长次级代谢产物的生产时间；稀释有毒代谢产物；降低染菌和避免遗传不稳定性..缺点-对补料过程中加入的物料无菌要求高;如果这个过程中有处理不当;之前的过程全部作废;发酵倒罐..连续发酵：优点-可连续运行;生产周期缩短;提高设备利用率和生产效率;便于自动化控制;产品的质量稳定..缺点-长时间连续操作;较易受杂菌污染;发酵设备复杂容易染菌..菌体收率和产物浓度相对较低;不利于下游的提取..连续培养的营养利用率较低;会增加成本..对设备要求高需要复杂的检测和控制系统..更易受菌种退化的影响..63.噬菌体抗性菌株的筛选：用紫外线照射对噬菌体敏感的出发菌株;使其发生变异;然后在该菌悬液中大量接入含有噬菌体的培养液;噬菌体数应大于菌体细胞数..此时出发菌株全部死亡;而变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中继续生长繁殖..通过平板分离即可得到纯的抗噬菌体菌株..64.在菌体生长的培养基中加入甘氨酸;可以是菌体较容易被酶解..65.青霉素中;1mol的葡萄糖经糖酵解和三羧酸循环后共产生32 ATP..66.蓝细菌是光合作用微生物;进行非环式光合磷酸化作用..67.生长谱法确定营养缺陷型菌株的生长必需物：将待测菌与融化的固体培养基混合均匀后倒入培养皿;待培养基凝固后;在平板上分区域放置酪素水解液、水溶性维生素、核酸水解液、酵母水解液并保温培养..观察四个区域的细菌生长情况..酪素水解液——氨基酸缺陷;水溶性维生素——维生素缺陷性、核酸水解液——碱基缺陷性..第二步;进一步确定哪种核苷酸缺陷性..四种核苷酸：腺嘌呤核苷酸;鸟嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸..分成四组：1腺嘌呤核苷酸;鸟嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸；2鸟嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸；3腺嘌呤核苷酸;胸腺嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸；4腺嘌呤核苷酸;鸟嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸..123胸腺嘧啶；12胸腺嘧啶、鸟嘌呤……………68.噬菌体污染的特征：碳源和氮源的消耗减慢;发酵周期延长;pH值异常变化;泡沫骤增;发酵液色泽和稠度改变;出现异常臭味;菌体裂解和减少;光密度降低;产物减少..污染原因：发酵菌种是溶源性细菌;能产生噬菌体..发酵菌种不纯或混有噬菌体;因此保藏的菌株和新分离的菌株在用于工业生产前应做产生噬菌体的试验;以确保发酵生产不被噬菌体污染..防治措施：杜绝噬菌体的各种来源；控制活菌体的排放；使用抗噬菌体菌株和定期轮换生产菌株；污染后的补救..69.大肠杆菌F因子的四种结合类型：F++F-接合后;都成为F+；Hfr+F-接合后;Hfr成为Hfr;F-成为F’；。
生物反应器动物细胞大规模培养概述近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着生物制品的需求猛增，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
采用玻璃瓶静置或转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。
通过动物细胞大规模培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
所谓动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（Bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
上世纪60-70年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。
自70年代以来，细胞培养用生物反应器有了很大的发展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。
八十年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。
1983年，英国Wellcome公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。
美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。
英国Wellcome公司采用8000L Namalwa细胞生产α干扰素。
英国Celltech公司用气升式生物反应器生α、β和γ干扰素；用无血清培养液在10000L气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
美国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生长激素等。
目前可利用生物反应器大规模培养的动物细胞有：鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等。
