ELISA原理和几种方法
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ELISA方法类型及原理
ELISA方法类型及原理ELISA是一种重要的实验技术，用于检测和定量分析蛋白质、抗体、荷尔蒙、生物学分子等。
ELISA的全称是酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），它通过将目标物（如抗原或抗体）与特定的酶标记物结合，然后利用染色反应来检测、定量或分析目标物。
根据目标物的不同，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA和反向ELISA等方法。
1.直接ELISA直接ELISA是最简单的一种ELISA方法。
它将目标物直接吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体来检测目标物。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性酶标记抗体，与目标物结合；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。
2.间接ELISA间接ELISA是较常用的一种ELISA方法。
它将目标物首先吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗来检测目标物。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性的初级抗体，与目标物结合；加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。
3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于定量测定样品中目标物含量的ELISA方法。
它将目标物预先包被在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体和待测样品，测定抗体与固相载体表面的目标物竞争的程度来定量目标物的含量。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物包被在载体表面；加入特异性酶标记抗体和待测样品；通过染色反应来检测酶的活性和竞争程度来定量目标物的含量。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理。
首先将目标物吸附在固相载体上，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗和待测样品。
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测并定量测定生物样品中的抗体或抗原。
ELISA方法包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等。
下面将对这些方法的类型和反应原理进行详细介绍。
1.直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA方法之一、在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。
待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入特异性抗体，这些抗体已标记有酶，比如辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），然后加入适当的底物。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。
2.间接ELISA间接ELISA是常用的ELISA方法之一，比直接ELISA灵敏度更高。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。
待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入与待测抗体特异性的二抗，这些二抗已标记有酶，如HRP，再加入适当的底物。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。
3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的ELISA方法。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有特异性抗体，然后加入待检测样品和已标记的抗原或抗体。
待检测样品中的抗原或抗体与涂覆的抗体竞争结合，形成复合物。
然后加入特异性的抗原或抗体，这些抗原或抗体已标记有酶，比如HRP，继续竞争与涂覆抗体结合。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成反比。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的高灵敏度ELISA方法。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理：1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。
该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。
2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。
该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。
3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。
酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。
4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。
操作步骤：1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。
将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。
2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。
3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。
4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。
5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。
6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。
7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。
8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。
9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。
10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。
ELISA六种方法类型及原理
ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶标检测）是用于检测免疫学反应的一种技术，全称为酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA），该技术是测定抗体及抗原的特异性相互作用的一种常用的检测方法。
ELISA通过酶联试验来灵敏地检测特异性抗体或抗原的含量。
ELISA检测方法有很多种。
常用的ELISA检测方法有以下六种：一、双抗体沉淀反应ELISA（DAP-ELISA）双抗体沉淀反应ELISA是一种比较简单的ELISA方法，该方法的原理是，在受体表面点涂两种类型的抗体，例如兔抗人IgG，而免疫反应物则是人IgG，受体与免疫反应物结合后，形成抗体-抗原复合物，其上自发形成特异性沉淀。
随着浓度的增加，抗原越多，沉淀凝固物也越多，膜上形成沉淀下降，沉淀量可以通过酶标仪测定，或者免疫发光法检测，大体上，兔抗人IgG及抗原分别点涂及酶标探针可能以1:1:2的比例，也就是在100 L的反应液中加入到受体和兔抗人IgG各10 L，抗原20 L的条件下进行反应。
二、夹心ELISA（Sandwich ELISA）夹心ELISA是一种常见的ELISA检测方法，它利用特殊的标记抗体完成免疫反应，以达到检测目的。
以IgG为例，在受体表面点涂一种特异性抗体,如兔抗人IgG，受体与人IgG结合形成复合物，在这一抗原复合物上再添加第二种特异性抗体，如抗兔IgG，第二种抗体结合复合物，并将复合物结合在受体表面，形成抗原“夹心环”，该免疫反应体系可以通过酶标仪来检测指示物的夹心量，计算受体中抗原的含量。
三、竞争ELISA（Competitive ELISA）竞争ELISA提高ELISA检测的灵敏度，竞争式ELISA也属ELISA技术范畴，该技术通过特异性抗体与抗原间竞争性结合而形成的结果来检测特异性抗原的浓度。
竞争ELISA的原理是：将偶氮羟化物体表膜点涂含有特异性抗原区域的抗体，若添加一定量的抗原（相同的特异性抗原）至反应液，则可形成抗原-抗体复合物，受体与抗原的竞争性结合，而非特异性的抗体-抗原复合物。
elisa的基本原理方法类型及应用
Elisa的基本原理、方法类型及应用概述Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用于生物化学和生物医学研究领域的实验技术。
它利用酶标记的抗原或抗体与待测物相互作用并生成可读出的信号，从而达到检测和定量分析的目的。
本文将介绍Elisa的基本原理、方法类型及应用。
基本原理Elisa的基本原理是通过特异性抗原与抗体间的结合反应来检测和定量分析待测物。
其基本步骤如下：1.固定：将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板、膜等）上，形成固定相；2.实验样本加入：加入待测物样本到固相载体中，使待测物与固定的抗体或抗原发生特异性结合；3.洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的物质；4.酶标记的抗体或抗原结合：加入酶标记的抗体或抗原，使其与待测物发生反应；5.洗涤：再次洗涤以去除未结合的酶标记的抗体或抗原；6.底物添加：加入底物，通过酶催化反应生成可检测的信号；7.信号检测：利用光度计、荧光计等仪器测量所产生的信号。
方法类型Elisa通常可以分为以下几种类型：1.间接Elisa：该方法是最常用的Elisa类型之一。
它通过在固相载体上固定抗原，然后加入待测物和酶标记的抗体，最后通过添加底物产生颜色反应来测定待测物的浓度。
2.直接Elisa：该方法直接在固相载体上固定酶标记的抗原，待测物与固定的抗原发生反应后，通过添加底物测定待测物的浓度。
与间接Elisa相比，直接Elisa节省了一个环节，因此更简单和快速。
3.竞争性Elisa：该方法适用于待测物是小分子的情况。
竞争性Elisa将待测物与酶标记的抗原竞争与固定抗原结合，通过测定底物的酶活性来测定待测物的浓度。
4.逆转Elisa：该方法常用于检测体内特定抗体的浓度。
逆转Elisa是将固定抗体或抗原加入实验样本中，之后加入酶标记的待测物，最后通过添加底物的酶活性来测定抗体的浓度。
应用Elisa在医学、生物学和生化学研究中广泛应用。
以下是Elisa的几个主要应用领域：1.临床诊断：Elisa可以用于检测和诊断人体内的疾病和感染。
ELISA六种方法类型及原理
ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定抗原或抗体的存在和浓度。
它的原理基于抗原和抗体之间的专一结合，利用酶标记的抗体或抗原来检测并定量目标物。
ELISA有多种不同的方法类型，以下将对其中六种方法类型及其原理进行详细介绍。
1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法，适用于寻找目标抗原。
在这种方法中，被测抗原直接吸附在固相或表面上，然后与特异性酶标记的抗原特异性结合。
最后，通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。
2.间接ELISA：间接ELISA也是常用的方法，适用于寻找目标抗体。
首先，将被测抗原吸附在固相或表面上，然后加入待测抗体。
之后，特异性结合的第二抗体（酶标记的）被加入用于识别和检测第一抗体。
最后通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。
3.竞争ELISA：竞争ELISA用于检测样品中的特定抗原或抗体。
在这种方法中，特异性酶标记的抗原或抗体与待测样品中的抗原或抗体竞争结合。
通过测定酶标记物的信号强度，可以确定待测样品中目标物的含量。
4.间接竞争ELISA：间接竞争ELISA是一种用于定量测定目标抗原的方法。
首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入特异性抗体。
该抗体与样品中的目标物竞争结合。
接着，再加入另一特异性抗体，该抗体与前面结合的抗体有竞争关系。
最后通过测定酶标记物的信号强度，可以确定目标物的浓度。
5.间接夹心ELISA：间接夹心ELISA用于寻找样品中的特定抗体。
首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入待测抗体。
随后，特异性酶标记的第二抗体被加入，用于识别和检测待测抗体。
最后通过测定酶标记物的信号强度，可以定量测定目标抗体的浓度。
6.双抗体ELISA：双抗体ELISA常用于寻找特定抗原。
首先，在固相或表面上吸附被测特异性抗体，然后加入样品。
目标抗原与抗体特异性结合。
接着，酶标记的第二抗体被加入，该抗体与目标抗原结合。
ELISA的原理和基本类型
ELISA的原理和基本类型ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫测定技术，通过测定抗原或抗体与其相应配体之间的特异性反应来检测目标物质的存在和浓度。
这项技术具有高灵敏度、高特异性和高通量性的优势，已广泛应用于医学、生物学、环境科学和食品安全等领域的研究和临床诊断中。
1.直接ELISA：直接ELISA是最简单的ELISA形式之一、在直接ELISA中，适量的抗原被吸附在固相（如微孔板）上后，样本中的抗体与其结合。
接着，通过与该抗体特异性结合的酶标记抗体检测目标物质的存在与否。
最后，加入底物使酶催化发生彩色反应，根据颜色的强度来确定抗原浓度。
2.间接ELISA：间接ELISA是最常用的ELISA形式之一、在间接ELISA中，抗原被吸附在固相上，然后与试样中的抗体结合。
随后，加入与试样中抗体结合的酶标记抗体，再加入底物以进行酶催化的彩色反应。
该方法的优势在于，只需要极少量目标抗原即可进行检测。
3.竞争ELISA：竞争ELISA用于测定抗体或抗原浓度，是一种定量分析的方法。
在竞争ELISA中，抗原或抗体与固相相结合的抗体或抗原发生竞争结合，测定竞争反应的结果来确定目标物质的浓度。
4.夹心ELISA：夹心ELISA又被称为“双抗体夹心ELISA”。
该方法可用于检测样品中特异的抗原或抗体。
在夹心ELISA中，首先将一种抗体吸附在固相上，样品中的抗原与之结合。
然后加入酶标记的第二抗体与抗原再次结合。
最后，加底物使酶发生催化反应，并测量酶催化发生的信号。
总而言之，ELISA是一种高灵敏度、高特异性的免疫测定技术，可以通过测定抗原和抗体之间的特异性反应来快速、准确地检测目标物质的存在和浓度。
在不同类型的ELISA中，抗原或抗体通过固相吸附、结合特异性的酶标记抗体、进行酶催化反应的彩色反应来实现检测。
ELISA技术在医学、生物学和环境科学等领域的研究和诊断中发挥了重要作用。
elisa常见实验方法
elisa常见实验方法摘要：1.ELISA实验原理简介2.ELISA实验步骤概述3.常见ELISA实验方法分类4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景5.提高ELISA实验效果的方法6.ELISA实验中常见问题及解决策略正文：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于生物医学领域，用于检测蛋白质、抗原和抗体等生物分子的方法。
ELISA实验通过特异性抗体与待检测物结合，再通过酶标记的二抗检测结合物，从而实现对目标分子的定量分析。
以下是ELISA常见实验方法的详细介绍。
1.ELISA实验原理简介ELISA实验基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，待检测样品中的目标分子与固定在载体上的抗体结合，再加入酶标记的二抗，与结合在载体上的抗原或抗体发生反应。
最后，通过底物显色反应，根据颜色的深浅判断待测物含量。
2.ELISA实验步骤概述ELISA实验一般分为以下四个步骤：（1）抗原或抗体固定：将抗原或抗体吸附在固相载体（如酶标板）上；（2）样品处理：对待测样品进行适当处理，使其与实验体系相适应；（3）加样：将处理后的样品和酶标记的二抗加入酶标板，incubate；（4）底物显色：加入底物，酶标记的二抗与抗原或抗体结合后，底物被酶催化显色；（5）读数：用酶标仪测定显色程度，换算成待测物浓度。
3.常见ELISA实验方法分类根据实验过程中抗原抗体结合的方式，ELISA实验可分为以下几类：（1）双抗原夹心法：待测物为抗原，实验中使用两种针对抗原不同表位的抗体；（2）竞争法：待测物为抗体，与固定抗原竞争结合酶标抗体；（3）间接法：待测物为抗体，通过酶标记的二抗检测；（4）免疫共沉淀法：利用抗原抗体结合后形成的免疫复合物与底物结合。
4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景（1）双抗原夹心法：优点为特异性高、灵敏度高，适用于抗原含量较低的检测；缺点为操作复杂，易出现交叉反应。
（2）竞争法：优点为操作简便，适用于抗体含量较低的检测；缺点为特异性相对较低，易受其他物质干扰。
ELISA的原理和类型
ELISA的原理和类型ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测体液中的特定蛋白质或其他分子。
ELISA可用于诊断疾病、监测药物治疗效果、研究疾病发病机理等。
本文将介绍ELISA的原理和类型。
##ELISA的原理1.涂覆：将待测物质（抗原或抗体）固定在微孔板上。
2.结合：加入样本液，待测物质与样本中的目标分子结合。
3.探针：加入与目标分子结合的第二抗体，或标记有酶的第二抗体。
4.显色：加入底物，酶与底物发生反应，形成可见的颜色变化。
5.检测：通过测量颜色强度或荧光强度来定量检测目标分子的浓度。
根据酶与抗体/抗原结合的方式，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同类型。
###直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA类型之一、在直接ELISA中，待测物质被直接固定在微孔板上，然后加入与待测物质特异性结合的第一抗体。
随后加入与第一抗体结合的酶标记的第二抗体，最后通过显色反应来检测目标分子的浓度。
###间接ELISA在间接ELISA中，待测物质被固定在微孔板上，然后加入与待测物质特异性结合的第一抗体。
接着加入与第一抗体结合的未标记的第二抗体，最后再加入与第二抗体结合的酶标记的第三抗体。
通过酶与底物的反应来检测目标分子的浓度。
###竞争ELISA竞争ELISA是一种测定待测物质浓度的方法。
在竞争ELISA中，待测物质与酶标记的抗体结合时，用于检测的抗体与酶标记的抗体之间存在竞争。
通过测量酶的活性来确定待测物质的浓度。
###间接竞争ELISA间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理。
在此类型的ELISA中，待测物质被固定在微孔板上，然后加入抗体，抗体与待测物质结合。
接着加入酶标记的抗体，酶标记的抗体与待测物质结合。
通过测量酶的活性来确定待测物质的浓度。
ELISA的基本原理和方法
ELISA的基本原理和方法ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生物医学领域的免疫分析方法，被用于检测体内或体外的抗原或抗体。
其基本原理是利用酶标记技术和免疫反应原理来定量测定样品中特定抗原或抗体的浓度。
1.固相吸附：将特定的抗原或抗体固定于具有高亲和性的固相载体，如微孔板。
在微孔板表面以共价键或非共价键结合，确保其稳定性和固定性。
2.样品加入：待测样品中的抗原或抗体与固相载体上的抗体或抗原进行特异性结合。
3.洗涤：通过洗涤步骤，去除非特异性的结合物，保留特异性结合物。
4.酶标记：加入特异性抗体或抗原与被测物结合，并经过化学或酶反应与酶结合或直接偶联。
常用的酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），它们能够产生可见的信号。
5.洗涤：再次进行洗涤，以去除非特异性的结合物。
6.底物加入：加入酶底物，使其与酶结合发生化学反应，生成可见的信号。
例如，HRP酶作用于染色底物，产生可见的颜色。
7.反应终止：通过加入酸或碱，停止酶反应，并停止信号产生。
8.读取结果：使用酶标仪或颜色比较法测定样品中特定抗原或抗体的浓度，根据信号的强度来定量分析。
根据不同的检测目的和所用的抗原或抗体，ELISA可以分为以下几种常见的方法：1.间接ELISA：通过固相吸附将抗原固定于微孔板上，再加入待测样品，样品中的抗体与固定抗原结合，再加入酶标记的二抗结合到抗体上，经过洗涤和底物加入后，酶反应发生，生成可见的信号。
2.直接ELISA：将酶标记的抗体直接与待测抗原结合，而无需预先固定。
该方法简单快捷，但灵敏度较低。
3.间接竞争ELISA：通过共同的固相抗原和酶标记二抗与待测样品中的竞争抗原或抗体结合，竞争性质绑定，样品中特异性结合物的浓度与酶标记物结合信号强度呈负相关关系。
4.半定量ELISA：通过标准曲线法，将已知浓度的标准样品与待测样品的酶标特异性蛋白或抗体进行竞争，通过样品和已知浓度标准之间的关系，来确定待测样品中特异性结合物的浓度范围。
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（六）应用亲和素和生物素的ELISA
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
基本原理
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体
（四）竞争法
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
（二）双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS
（五）捕获法测IgM抗体
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
（三）பைடு நூலகம்接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
方法类型和操作步骤
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
基本原理
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体
（四）竞争法
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
（二）双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS
（五）捕获法测IgM抗体
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
（三）பைடு நூலகம்接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
方法类型和操作步骤
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：