人参总皂苷合黄连小檗碱对慢性心衰大鼠血浆BNP_心肌细胞内钙离子浓度的影响

人参总皂苷合黄连小檗碱对慢性心衰大鼠血浆BNP、心肌细胞内钙离子浓度的影响李永民*，陈晓春，刘华，罗飞，李刚（河北北方学院中医系，河北张家口 075029）[摘要] 目的：研究人参总皂苷（ginseng total saponins，GS）合黄连小檗碱（berberine，Ber）对慢性心衰大鼠血流动力学、血浆脑钠肽（BNP）、心肌细胞内钙离子浓度[Ca2+]i的影响。

方法：连续12 d皮下注射较大量异丙肾上腺素（ISO）制备慢性心衰大鼠模型，ISO总量80 mg·kg-1，随机分为4组：模型组，每天蒸馏水灌胃；GS+Ber组（各20 mg·kg-1）、卡托普利组（45 mg·kg-1），每天灌胃1次；参麦注射液组（5 mL·kg-1），每天腹腔注射1次。

另设正常组，每天蒸馏水灌胃。

连续给药4周，测定各组大鼠血流动力学变化、血浆BNP含量，流式细胞仪测定心肌细胞内[Ca2+]i。

结果：与正常组相比，模型组左心室内压峰值（LVSP）、左心室等容收缩期压力上升最大速率（+d p/d t max）、左心室舒张期压力下降最大速率（–d p/d t max）明显下降，左心室舒张末压（LVEDP）、血浆BNP、心肌细胞内[Ca2+]i显著升高，均有显著性差异（P < 0.01）；与模型组相比，GS+Ber组LVSP，±d p/d t max明显升高，LVEDP、血浆BNP、心肌细胞内[Ca2+]i显著降低，均有显著性差异（P < 0.01，P < 0.05），治疗效果接近卡托普利组，优于参麦注射液组。

结论：GS+Ber对慢性心衰大鼠血流动力学异常、血浆BNP、心肌细胞内钙超载有良好改善作用。

[关键词] 人参总皂苷；黄连小檗碱；心力衰竭；血流动力学；脑钠肽；钙离子有研究表明，人参总皂苷GS对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用，能抗心律失常、抗休克保护心肌，能有效地改善血流动力学以达强心作用，能提高机体耐缺氧能力并可调节脂质代谢以发挥抗动脉粥样硬化等作用[1]。

黄连小檗碱Ber有稳定心肌电活动，延长心肌细胞动作电位时程和有效不应期等作用，对心力衰竭的发生和心肌的能量代谢有良好的保护作用，能改善动物和人类充血性心力衰竭的心功能，是一种有前途的中药正性肌力药[2]，并可减少血浆儿茶酚胺类物质含量，显示一定的抗交感作用，抑制心肌肥厚，抑制心肌间质纤维化而改善心室重构[3]。

笔者观察了GS+Ber对慢性心衰大鼠血流动力学、血浆BNP、心肌细胞内[Ca2+]i的影响，积极探讨防治慢性心衰的现代中药。

1材料1.1动物健康雄性Wistar大鼠50只，清洁级，体重200～[收稿日期] 2008-06-18[基金项目]河北省科技支撑计划课题（08276101D-65）[通信作者]*李永民，Tel：（0313）8355236，E-mail：Liyongmin2001@ 240 g，购自河北省实验动物中心[合格证号SCXK （冀）2003-1003]。

1.2药物GS，Ber的提取纯化[4-5]：红参、黄连市售，河北北方学院药物研究所马淑兰教授鉴定，分别为五加科植物人参Panax ginseng的干燥根和毛茛科植物黄连Coptis chinensis的干燥根茎。

红参干燥粉碎，85%乙醇回流提取2次，合并提取液，减压浓缩，乙醚脱脂，正丁醇萃取，真空干燥，得GS粗品，甲醇溶解，丙酮纯化，沉淀真空干燥，得GS，经香草醛比色法测定其含量为80.5%，人参皂苷Rb1对照品（中国药品生物制品检定所，批号110704-200420，纯度98%）；黄连，干燥粉碎，0.2%硫酸-乙醇溶液回流提取2次，合并提取液，减压浓缩，室温挥发干燥，得Ber粗品，1%醋酸溶解，过滤，滤液用盐酸调pH 2，减压过滤，沉淀真空干燥，得Ber，HPLC法测定其含量为90.7%，Ber对照品（南京替斯艾么中药研究所，批号TCM024-070618，纯度98%）；盐酸异丙肾上腺素（ISO）注射液（上海禾丰制药有限公司，批号070703）；卡托普利（常州制药厂有限公司，批号0705153）；参麦注射液（河北神威药业有限公司，批号07010921）。

1.3 试剂BNP 定量ELA 试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号20080115）；fluo-3-AM （AnaSpec Inc 公司）；胎牛血清（天津市川贝生化制品有限公司，批号060406）。

1.4 仪器FACSAria 型流式细胞仪（美国BD 公司）；高效液相色谱仪Hp1100（美国Agilent 公司）；Pclab-us 型生物信号采集系统（北京微信斯达）。

2 方法 2.1 模型制备采取皮下多点注射较大量ISO 的方法[6-7]，第1天给20 mg·kg -1、第2天给10 mg·kg -1、第3~12天给5 mg·kg -1剂量连续皮下给药，另取10只大鼠为正常组，皮下注射等量蒸馏水。

2.2 分组及给药造模结束后随机取2只正常大鼠、4只造模大鼠测定血流动力学指标，2组指标差异明显，确认模型成功。

随机分为模型组、GS+Ber 组、卡托普利组、参麦组，每组8只。

模型组：蒸馏水10 mL·kg -1灌胃；GS+Ber 组：参考文献[1-2]等比配伍，各以20 mg·kg -1，8 mL·kg -1灌胃，GS ，Ber 用蒸馏水溶解；卡托普利组：参考文献[3]，45 mg·kg -1，10 mL·kg -1灌胃，卡托普利用蒸馏水溶解；参麦组：5 mL·kg -1腹腔注射；正常组：蒸馏水10 mL·kg -1灌胃。

均1日1次，连续给药4周。

2.3 指标2.3.1 血流动力学测定 腹腔注射20%乌拉坦麻醉（10 mL·kg -1），手术游离右侧颈总动脉，经右侧颈总动脉插入自制的心室插管（充满1%肝素），通过左侧动脉瓣和房室瓣进入左心室，用多导生理记录及分析系统描记记录LVSP ，LVEDP ，±d p /d t max 。

2.3.2 血浆BNP 测定 右侧颈总动脉取血，低温离心，分离血浆，采用ELA 法。

2.3.3 心肌细胞内[Ca 2+]i 的测定[8] 纵向剪开左心室，从乳头肌处横切0.3 cm ×0.8 cm 的心肌组织约100 mg ，机械法剪碎组织，用200目、400目双网过滤，用预冷的D-Hank 液冲洗，网上组织剪至1 mm 3小块，将小组织块加入0.125%胰蛋白酶3 mL 消化液中，37 ℃水浴消化10 min ，加入1 mL 小牛血清混匀，用滴管轻轻吹打2~3 min ，经200目尼龙网过滤，1 500 r·min -1离心5 min 。

加入 1 mmol·L Fluo-3-AM 10 µL 和490 µL D-Hank 液，使其终浓度为20 µmol·L -1，孵育30 min ，用D-Hank 液洗2次，1 500 r·min -1离心5 min2次，加入800 µL D-Hank 液，流式细胞仪检测，共计数10 000个细胞，Fluo-3-AM 的激发光488 nm ，吸收光526 nm ，采用刺激后荧光强度（%）来反映细胞内[Ca 2+]i 的变化。

用显微镜观察心肌细胞分离情况，并经台盼蓝染色检测心肌细胞活力，活细胞>95%以上。

2.4 统计方法实验数据符合正态分布，用±x s 表示，应用SPSS 12.0进行统计学分析，用单因素方差分析进行组间比较，P <0.05为有显著性差异。

3 结果3.1 对慢性心衰大鼠血流动力学的影响与正常组相比，模型组LVSP ，±d p /d t max 明显下降，LVEDP 显著升高，均有显著性差异(P <0.01)；与模型组相比，GS+Ber 组、卡托普利组LVSP ，±d p /d t max 明显升高，LVEDP 显著降低，均有显著性差异(P <0.05，P <0.01)，参麦组LVEDP 显著降低，有显著性差异(P < 0.01)，与参麦组相比，GS+Ber 组、卡托普利组±d p /d t max 明显升高(P <0.05)(表1)。

表1 GS+Ber 对慢性心衰大鼠血流动力学的影响（±x s ）组 别 n 剂量/mg·kg -1LVSP / kPa+d p /d t max /kPa·s -1 LVEDP/kPa -d p /d t max /kPa·s -1正常 7 - 136.05±29.01 4 537.13±1013.71 -11.99±10.22 -3 191.94±994.76 模型6-73.66±12.542) 1 617.81±708.162) 35.37±10.022)-1 339.81±819.632) GS+Ber 8 20+20 99.99±12.562,3) 3 238.53±905.142,4-5) 7.81±15.052,4) -2 368.92±621.613,5) 卡托普利 7 45 113.64±24.231,4-5) 3 455.50±917.181,4-5) 1.92±11.091,4-5) -2 306.66±1348.703,5) 参麦8 589.64±10.662) 2 299.16±808.662) 17.10±10.972,4)-1 324.07±658.952)注：与正常组相比P <0.05，P <0.01；与模型组相比P <0.05，P <0.01（表2同）。

3.2对慢性心衰大鼠血浆BNP、心肌细胞内[Ca2+]i 的影响与正常组相比，模型组血浆BNP、心肌细胞内[Ca2+]i均明显升高（P<0.01）；与模型组相比，GS+Ber组、卡托普利组血浆BNP，心肌细胞内[Ca2+]i明显降低（P<0.05，P<0.01），参麦组也有明显差异（表2）。

表2 GS+Ber对慢性心衰大鼠血浆BNP，[Ca2+]I的影响（±x s，n=8）组别剂量/mg·kg-1BNP/ng·L -1[Ca2+]i/%正常- 67.82±15.02 44.01±21.38模型组- 130.71±24.022）80.50±11.582)GS+Ber 20+20 99.82±28.652,3)55.47±17.813)卡托普利45 102.81±14.992,3)58.86±18.873)参麦 5 121.80±29.712)64.74±24.001)4讨论慢性心衰的基本机制是神经内分泌介导的心室重构，现代医学积极倡导生物学治疗，β-受体阻滞剂和血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）成为治疗慢性心衰的基石。