荧光原位杂交(FISH)和用引物介导的原位标记(PRINS)sop

荧光原位杂交在肠道微生物学中的应用
荧光原位杂交（FISH）在肠道微生物学中的应用
一、荧光原位杂交概念
荧光原位杂交（FISH），是一种克服转录-聚合酶链反应（PCR）技术的空白，检测和定位特定部位的具体特异性的 DNA 片段的一种受控的基因扩增技术。

它具有快速、准确、实时的特点，使得它可以被用来研究微生物遗传信息以及追踪微生物感染源。

二、荧光原位杂交在肠道微生物学中得用
FISH技术通常用于识别某些特定微生物物种和检测微生物数量，从而更好地了解肠道微生物群落结构、活性和功能。

1、研究肠道微生物群落结构
FISH技术可用于在原位条件下识别和定性细菌和其他微生物，为肠道微生物群落结构的定性和定量研究提供可靠的数据。

例如通过测定不同种类的肠道细菌的相对丰度情况，FISH技术能够分析肠道细菌群落中多种微生物的形态、组成和统计结构。

2、检测微生物感染源
FISH技术能有效检测和排除肠道疾病的病原体，使获得更清晰的诊断结果，从而在确定治疗对策中发挥重要作用。

此外，它也可用于检测微生物的抗药性，以及检测重要病原微生物的致病基因表达情况。

3、用于分析肠道微生物活性
FISH技术还能用于分析肠道微生物的活性，如酶活性和代谢产物的相对��度，和肠道微生物群落复合碳源代谢（Cometabolism）潜力等。

这些信息有助于研究肠道微生物的作用以及促进人类营养和健康。

三、总结
FISH 技术在肠道微生物学中具有重要的应用，可用于研究肠道微生物群落结构和活性，检测微生物感染源以及抗药性，分析肠道微生物的代谢和功能，以及提高其营养和健康的效果。

它将可能为临床诊断提供及时有效的方法。

荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。

关键词：荧光原位杂交;1.发展荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。

荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。

1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。

2.原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。

由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。

原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。

所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。

只有这样染色体DNA才能与探针杂交。

变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。

3.关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。

灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。

如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。

荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。

是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。

尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。

1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。

1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。

由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。

随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。

操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。

三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。

通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。

什么是荧光原位杂交（FISH）？“关于FISH实验的一些内容。

”近来，有伙伴在后台咨询了荧光原位杂交(FISH)实验的相关知识，因此小编想在今天推文简单聊一聊FISH实验，也讲点新花样。

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01—什么是FISHFISH：采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显示，最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。

上一代的FISH还是采用的同位素进行标记，现在基本上都是荧光标记了。

在此，要感谢J.G.Baunlan这位大神了。

有了FISH，我们可以不再仅仅依赖分子生物学的方法来检测DNA 的表达了。

FISH技术最大的优点是可以在间期细胞核上直接观察到DNA扩增，并且荧光信号的强度直接与DNA扩增水平直接相关。

这些都大大促进了分子细胞遗传领域的科学研究，同时也是临床上诊断肿瘤的利器。

02—FISH的实验要点网上有很多关于FISH的实验步骤教程，但每个探针盒子的操作可能存在差异。

懂了原理，才能以不变应万变。

因此，本部分主要是详细讨论实验要点。

FISH的大致步骤分为探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(适用于适用生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。

要点：（1）良好的前期标本制备十分重要，这点对于采用秋水仙素刺激得到中期染色体分裂象尤为重要。

刺激时间过短或过长都会影响实验观察，因此需要耐心摸索作用时间。

（2）蛋白酶K的作用浓度。

浓度高了极易影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。

石蜡切片一般要达到10-30min，不要超过半小时，一般来说，20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。

细胞免疫组化步骤1. PBS冲洗两次2. 丙酮固定10min3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃30 min4. PBS振洗2次,每次3min5. 加封闭血清,湿盒内37℃30 min6. 弃去血清7. 加一抗, 37℃30~60min (1:200 1:150稀释)8. PBS振洗3次,每次3min9. 加二抗, 37℃30 min10. PBS振洗3次,每次3min11. 加ABC复合剂, 37℃30 min12. PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min13. 浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处10~20min14. 自来水洗5min15. 染核浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精，自来水洗，过氨水，自来水洗16. 逐级脱水，70％1次，95％2次，无水3次每次1min17. 透明，过二甲苯3次，每次1min18. 封片将有细胞的一面向下封片一、免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。

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荧光原位杂交实验（FISH）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

1实验方法原理：荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。

间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。

FISH（原位杂交）SOP流程------探针直接带荧光标记一、FISH实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：将挑选好的组织切片置于切片架上放入烘箱中65℃烤片2-3h（观察组织周围石蜡是否被熔化流至切片边缘），烤片完成后将组织切片放入脱蜡机中脱蜡。

脱蜡完成后取出切片，进行抗原修复。

2、抗原修复：脱蜡完成后取出切片，进行酶修复。

稍甩净切片上水分，水平放置在孵育盒，用组化笔在组织周围画圈（过程中组织不能干片，组化笔不能碰到组织，否则会损坏组织或使抗体无法孵育到组织；不可用力按压组化笔以免笔内液体流出覆盖组织），蛋白酶K（PK）37度孵育15-20min，修复完后用PBS冲洗，再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、固定：甩去残留在片子上的PBS，滴加4%多聚甲醛，室温孵育5min。

用PBS冲洗。

再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、预杂交：滴加Hyb buffer（预杂交液）55度避光预杂交2小时。

5、准备探针：将探针原液与Hyb buffer按比例稀释，混合均匀后85℃变性3min,37℃平衡2min。

6、杂交：预杂交结束后，吸去Hyb buffer，滴加平衡后的杂交工作液，切片平放于湿盒内，37-42°C（杂交温度依据探针TM值确定）孵育过夜（湿盒内加少量水防止杂交液蒸发）。

7、洗涤：用1XSSC冲洗，浸泡2min。

（洗涤时间不宜过长，可能会洗掉表达）。

8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育20min。

9、封片：PBS冲掉DAPI，切片稍甩干后用WGA封片剂封片（封片时应避免组织上出现气泡）。

10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

（蓝光紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）二、荧光结果判读DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。

DNA荧光原位杂交（FISH）简要综述DNA荧光原位杂交（FISH）技术是70年代末80年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术，它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记（如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP），然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。

利用FISH进行DNA序列的定位具有实验周期短、灵敏度高、分辨率高、直观可见等优点。

总的说来，FISH技术的发展沿着两条路线前进：一方面是采用不同的探针，从而衍生出许多FISH新技术，如Muticolor-FISH、CGH、GISH、CISS、BAC-FISH、Chromosome Painting、Rreverse Chromosome Painting等等；另一方面则是努力提高FISH技术的分辨率，将靶目标从中期染色体发展到DNA纤维，使其分辨率由1Mb发展到1kb,这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞遗传学的一项代表技术。

A．不同探针的应用：1．以基因组为探针的GISH技术可以定位外源DNA片段在染色体上的位置、大小、插入点等。

Durnam（1985）首先将GISH应用于体细胞杂种的异源染色体检测。

本实验室采用GISH方法在小麦中成功定位了许多外源染色体、染色体片段以及染色体结构变异。

2．以不同的荧光素标记探针的Muticolor-FISH，可以同时定位不同探针序列的分布。

1990年Nederlof等创建了多色荧光原位杂交技术。

他们用生物素、AAF（氨基乙酰荧光素）和CP三种半抗原对不同探针作单、双、三标记，再用这三种半抗原相应的分别标记了异硫氰酸荧光素（FITC，绿色）、氨甲香豆素乙酸（AMCA，蓝色）和碱性蕊香红（TRITC，红色）的抗体来检测荧光，该技术最多可同时观察7个靶染色体。

荧光原位杂交实验流程英文Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Experiment Procedure.Fluorescence in situ hybridization (FISH) is an emerging molecular cytogenetic technique that has evolved from the original radioactive in situ hybridization technique in the late 1980s. It is a non-radioactive insitu hybridization method that allows for the precise localization and quantification of specific nucleic acid sequences within cells or tissue sections. The FISH experiment typically follows these steps:1. Sample Preparation: The first step involves collecting the cells or tissue samples that require analysis. These samples are then fixed and pretreated to maintain the integrity and stability of the nucleic acids. This pretreatment may include dehydration, rehydration, and protease treatment, depending on the sample type and the specific protocol being followed.2. Probe Preparation: The next step involves the preparation of the fluorescently labeled probes that will be used for the hybridization. These probes are typically oligonucleotides or DNA fragments that are specifically designed to bind to the target nucleic acid sequenceswithin the cells or tissues. The probes are labeled with fluorophores, which emit light when excited by a specific wavelength, allowing for their detection and localization within the samples.3. Probe Denaturation: Before hybridization, the probes must be denatured to separate the strands of the double-stranded DNA. This is typically achieved by incubating the probes in a hot water bath at a temperature of 75°C for 5 minutes, followed by immediate cool ing to 0°C for 5-10 minutes. This denaturation step ensures that the probes are in a single-stranded form and are ready for hybridization.4. Hybridization: The denatured probes are then applied to the prepared samples, and the samples are incubated in a humidified chamber at a temperature that promotes probe-target hybridization. The incubation time and temperature depend on the specific protocol and the type of samples being analyzed. During this step, the probes bind to their complementary target sequences within the cells or tissues.5. Post-Hybridization Washes: After hybridization, the samples are washed to remove any unbound probes and background noise. This washing step is crucial for ensuring specific and sensitive detection of the target sequences. The washes are typically performed in a series of buffers with decreasing salt concentrations.6. Detection and Imaging: Once the washes are complete, the samples are ready for detection and imaging. The fluorophores attached to the probes are excited with a specific wavelength of light, and the emitted light is captured by a fluorescent microscope. The resulting images show the localization of the target sequences within the cells or tissues, allowing for precise quantification and analysis.7. Data Analysis: The captured images are then analyzedto determine the presence, location, and quantity of the target sequences. This analysis may involve counting the number of fluorescent signals within specific regions of the cells or tissues, measuring the intensity of the signals, or analyzing the patterns of signal distribution. The results of the analysis provide valuable insights into the structure, function, and regulation of the nucleic acid sequences being studied.In summary, the fluorescence in situ hybridization (FISH) experiment is a powerful tool for the precise localization and quantification of specific nucleic acid sequences within cells or tissues. The experiment involves sample preparation, probe preparation and denaturation, hybridization, post-hybridization washes, detection and imaging, and data analysis. Each step requires careful attention to detail and strict adherence to the protocol to ensure accurate and reliable results.。

FISH-荧光原位杂交实验原位杂交实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用..掌握原位杂交技术的操作方法;熟练掌握荧光显微镜的使用方法..2. 实验原理荧光原位杂交Fluorescence in situ hybridization FISH是一门新兴的分子细胞遗传学技术;是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术..目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域..FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针;按照碱基互补的原则;与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合;形成可被检测的杂交双链核酸..由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列;因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位..与传统的放射性标记原位杂交相比;荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点;因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注..杂交所用的探针大致可以分为三类：1染色体特异重复序列探针;例如a卫星、卫星III 类的探针;其杂交靶位常大于1Mb;不含散在重复序列;与靶位结合紧密;杂交信号强;易于检测；2全染色体或染色体区域特异性探针;其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成;可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3特异性位置探针;由一个或几个克隆序列组成..探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法..间接标记是采用生物系标记的dUTPbiotin-dUTP经过缺口平移法进行标记;杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测;同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理;将荧光信号进行放大;从而可以检测500bp的片段..而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合;或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入..直接标记法在检测时步骤简单;但由于不能进行信号放大;因此灵敏度不如间接标记的方法..3. 实验用具及材料Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20..4. 实验方法及步骤1探针及标本的变性1探针变性将探针在75℃怛温水浴中温育5min;立即置0℃;5～10min;使双链DNA探针变性..2标本变性①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h..经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片..②取出玻片标本;将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min..③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水;每次5min;然后空气干燥..2杂交将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上;盖上18×18盖玻片;用Parafilm封片;置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜约15～17h..由于杂交液较少;而且杂交温度较高;持续时间又长;因此为了保持标本的湿润状态;此过程在湿盒中进行..3洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针;从而降低本底..1杂交次日;将标本从37℃温箱中取出;用刀片轻轻将盖玻片揭掉..2将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次;每次5min..3在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次;每次5min..4在室温下;将玻片标本2×SSC中轻洗一下..4杂交信号的放大1在玻片的杂交部位加150mL封闭液I;用保鲜膜覆盖;37℃温育20min..2去掉保鲜膜;再加150mL avidin-FITC于标本上;用保鲜膜覆盖;37℃继续温育40min..3取出标本;将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次;每次5min..4在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II;覆盖保鲜膜;37℃温育20min..5去掉保鲜膜;加150mL antiavidin于标本上;覆盖新的保鲜膜;37℃温育40min..6取出标本;将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中;洗涤3次;每次5min..7重复步骤1、2、3;再于2×SSC中室温清洗一下..8取出玻片;自然干燥..9取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上;盖上盖玻片..5封片可采用不同类型的封片液..如果封片中不含有Mowiol可使封片液产生自封闭作用;为防止盖片与载片之间的溶液挥发;可使用指甲油将盖片周围封闭..封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久..6荧光显微镜观察FISH结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野;然后打开荧光激发光源;FITC的激发波长为490nm..细胞被PI染成红色;而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光..由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列;因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性;即使在末分裂的细胞中;也可以观察到明显的杂交信号..照相记录实验结果图16-1..附录I FISH相关溶液的配制120×SSC：175.3g NaCl; 882.g柠檬酸钠;加水至1000mL用10mol/L NaOH调pH至7.0..2去离子甲酰胺DF：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中..电磁搅拌30min;用Whatmanl号滤纸过滤..3体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺;5mL 20×SSC;10mL水..4体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺;20mL 20×SSC;80mL水..5体积分数50%硫酸葡聚糖DS：65℃水浴中融化;4℃或-20℃保存..6杂交液：8mL体积分数25%DS; 20mL 20×SSC混合..或40mL体积分数50%DS;20mL20×SSC;40mL ddH2O混合取上述混合液50mL;与5mL DF混合即成..其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC;体积分数50% DF..7 PI/antifade溶液PI原液：先以双蒸水配置溶液;浓度为100mg/mL;取出1mL;加39mL双蒸水;使终浓度为2.5mg /mL..Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液;使其浓度为10mg/mL;用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0..取上述溶液1mL;加9mL甘油;混匀..PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀;-20℃保存备用..8DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液;按体积比1:300;以antifade溶液稀释成工作液..9封闭液I：体积分数5% BSA 3mL;20×SSC 1mL;dd H2O 1mL; Tween 20 5mL混合..10封闭液II：体积分数5% BSA 3mL;20×SSC 1mL;goat serum 250mL; dd H2O 750mL; Tween 20 5mL混合..11荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL;20×SSC 1mL;dd H2O 3mL; Tween 20 5mL 混合..12洗脱液：100mL 20×SSC;加水于500mL;加Tween20 500 mL..13TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA；pH7.6: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA；pH7.4: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA..14溶液I：25mmol/L Tris HClpH 7.4; 10mmol/L EDTA..15溶液II：10% SDS;0.2M NaOH..16溶液III：Kac 14.7g; HAc 5.8mL; 加水至50mL..17LB培养基：胰化蛋白胨10g;酵母提取物5g; NaCl 10g; 加水至1000mL;用5mmol/L NaOH 调pH值至7.0..附录II DNA探针的制备质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定..1用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌;接种于5mL LB培养基中;37℃剧烈震荡过夜..2将收集到的菌液3000r/min离心10min;弃掉上清液..3向菌体沉淀中加入溶液I300mL; 溶液II 350mL;混匀后将其置于冰浴中片刻;再加溶液III 350mL混匀;加酚和氯仿混合液体积比为1：1500mL 后充分混匀..412000r/min离心10min..5取上清液;向其加入600mL异丙醇;充分混匀后以12000r/min离心15～30min;弃掉上清液..6用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次;晾干..7用TE缓冲液溶解DNA沉淀..8加水至200mL;以Rnase A终浓度200mg /mL在50℃水浴中消化30min..9加入酚、氯仿和异丙醇三者体积比25：24：1溶液200mL混匀;12000r/min离心2min..10取上清液;再加入氯仿和异戊醇溶液体积比为24：1200mL混匀;12000r/min离心2min..11取上清液;以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA..12可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA;然后用12000r/min离心15min..13将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗;自然晾干..14用TE缓冲液溶解DNA..15取1～2mL上述纯化的DNA溶液;于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度..16取1mg DNA;用相应限制性内切酶4～5单位;BSA100～200mg /mL;于37℃水浴中酶解2～4h..17电泳观察;根据酶切片段数量及大小;估计DNA克隆插入片段大小..附录III 探针的生物素标记探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备;但多数情况下采用缺口平移法来制备..该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗;即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成..在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入;从而复制出带有生物素标记的探针..本实验采用缺口平移法;按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP标记探针..标记好的探针可以在-20℃下长期保存..总反映体积50mL; DNA 1mg;10×dNTP 5mL; 10×Enzyme Mix 5mL..其中10×dNTP为：500mmol/L Tris·HClpH 7.850mmol/L MgCl2100mmol/Lβ-硫基乙醇100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白0.2mmol/L dCTP; 0.2mmol/L dGTP; 0.2mmol/L dTTP0.1mmol/L dATP; 0.1mmol/L biotin-14-dATP10×酶混合为：0.5units/mL DNA聚合酶I0.075untis/mL Dnase I50mmol/L Tris·HClpH 7.55mmol/L醋酸镁1mmol/L β-硫基乙醇0.1mmol/L苯甲基磺酰氟体积分数50%甘油100mg /mL牛血清白蛋白将上述混合液于16℃作用1h..用8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物..以DNA片段长约300～500bp为宜..如片段较大;则应加适量Dnase I继续酶切;直至DNA片段长度适中后;加5mL终止缓冲液300mmol/L EDTA终止反应..用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开..一、荧光原位杂交FISH是一种简单、敏感、而容易操作的方法;结果迅速;并能在同一标本上检测多个不同的基因;可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片..FISH技术是利用特异的DNA探针;标记了生物素;地高辛、或荧光素;对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交;并用荧光法显示..FISH实验步骤试剂配制：1变性液70%甲酰胺+ 2×SSC;pH7.0：4 ml 20×SSC；8 ml 蒸馏水；28 ml 甲酰胺..每次新鲜配制..2杂交后洗涤液：20×SSC 4 ml；蒸馏水16 ml；甲酰胺20 ml..每次新鲜配制..调节pH前升至室温..1. 用硅化玻片;石蜡切片;60℃烤片过夜..二甲苯脱蜡至酒精;斜置切片;空气中干燥..2. 蛋白酶处理：1每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液;配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管;在水浴槽中预热..将消化酶液加入管内;摇动直到酶溶解..2 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液..37℃孵育20 min..3 2×SSC在室温下漂洗切片3次;每次1 min..4梯度酒精脱水-20℃预冷;空气中干燥..3. 变性：1每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；278℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；378℃孵育8 min；4 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min;再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内;每缸2 min；5空气干燥..4. 杂交：1准备探针；2取一个较大的湿盒;交叉放置切片；3滴10 μl 探针在切片的组织上;加盖玻片；4盖上湿盒盖;37℃孵育12~16 h..杂交后水洗：5镊子小心去除盖玻片；643℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min；72×SSC37℃洗两次;每次10 min；8切片放人染色缸的1×PBS内待检测;勿使切片干燥..检测：9从1×PBS中取出切片;除去过多的水分;避免标本干燥..把切片放入湿盒内;同时处理4张切片..10每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素;室温下孵育20 min；11去掉塑料盖膜;把切片放入含1×PBS的染色缸..1×PBS室温下洗3次;每次2 min..扩增：12从1×PBS中取出切片;斜置切片使液体排出；13每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体;加塑料盖膜;室温孵育20 min；14去掉塑料盖膜;把切片放入含1×PBS的染色缸..1×PBS室温下洗3次;每次2 min；15从1×PBS中取出切片;斜置切片使液体排出；16每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体;加塑料盖膜;室温孵育20 min；171×PBS室温下洗3次;每次2 min..5. 细胞核染色：1张切片加10~20 μl DAPI;覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5 ml；2尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱..切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察..二、用引物介导的原位标记PRINS是PCR和荧光原位杂交FISH的结合; PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列;在聚合酶的驱动下;带有标记的脱氧核苷酸FITC-dUTP或半抗原-dUTP和dATP、dCTP、dGTP的延伸;依赖标记;新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC;用荧光显微镜观察..PRINS实验步骤1. 常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS；2. 用0.2 mol/L 盐酸处理5min；3. 蛋白酶K25 μg/ml消化37℃15 min；4. 分别用80%;95%和100%酒精脱水;室温干片；5. 加PCR混合液25 μL10 mmol/L Tris-HCl;50 mmol/L KCl;1.5 mmol/L MgCl2;各加200 μmol/L dATP;dCTP;dGTP;1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl;引物250 ng;Taq DNA 聚合酶2 U;加盖片；6. 94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min；7. 用0.1×SSC液;65℃洗5 min；8. 片于65℃10~20 s；用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min;2次；9. 经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min；10. 加地高辛抗体复合物1：500室温下2 h；11. BufferⅢ液洗5 min；12. 用BCIP-NBT显色1~2 h;在镜下控制;终止显色；13. 用中性红或核固红衬染;酒精脱水;二甲苯透明;树脂封片..。

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。

其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。

试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。

（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。

（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。

（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。

称量试剂勺也要干烤。

塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。

若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。

（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。

2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。

简便、快捷、准确－临床诊断中的FISH检测FISH（即荧光原位杂交）技术作为分子诊断的重要工具，在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。

FISH检测是利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA 探针与样本DNA进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，以此作为诊断的依据。

FISH的操作简便快捷，结果直观准确，因此FISH成了许多疾病诊断的首选工具。

下面我们将从探针的设计，样本的制备，原位杂交和检测结果的观察等几个方面简单介绍FISH的操作。

探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。

FISH检测的准确性来源于探针的设计。

FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。

用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。

而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。

荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结探针的预备1.让探针加热至室温，降低探针的粘度，使用合适的移液管2.振荡混合。

用微型离心机将内容物离心（1-3秒）至底部。

轻轻振荡再次混匀3.注意：该探针已经经过变性可直接与样本片子反应。

若探针是非降解型，需进行73℃5分钟的变性杂交1.在片子上，将10μL的CEP18/X/Y混合探针加到一个反应区，将10μ的LLSI13/21混合探针加至另一个反应区。

将22mm×22mm的盖玻片立刻覆盖反应区，使探针溶液弥漫整个覆盖区。

气泡会干扰杂交，因此必须排除气泡果的检测方式。

以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb－400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号，而无需抗原－抗体反应对荧光信号进行放大。