基因工程复习资料

第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。

第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3′或5 ′),逐个水解核苷酸。

核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′，5′磷酸二酯键。

限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。

1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制——修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageλKR-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。

保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M 系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA 则会被降解。

个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。

限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。

由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。

2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。

基因工程复习指导第一章绪论1、基因：就是存在于DNA上承载遗传信息的核苷酸序列，是位于染色体上呈直线排列的遗传物质的最小单位，也是携带遗传信息的结构单位和控制遗传性状的功能单位。

2、基因工程：又称重组DNA技术，分子水平进行遗传操作，将任何生物体（供体）的基因或基因组提出来，或通过人工合成的目的基因，按照先设置好的蓝图，插入质粒或病毒复制子（载体），而形成一杂合分子（DNA重组体），然后将重组体转移到复制子所属的宿主生物体复制，或转移到另一生物体（受体）的细胞内（原核或真核），使之在受体细胞内遗传并使受体细胞获得新的性状。

3、基因工程的三要素：供体、载体、受体4、基因工程的基本流程：（1）DNA的制备包括从供体生物的基因组分离或人工合成，以获得带有目的基因的DNA片段。

（2）在体外通过限制性核酸内切酶分别分离得到的外源DNA和载体分子进行定点切割，使之片段化或线性化（3）在体外将含有外源基因的不同来源的DNA片段通过DNA连接酶到载体分子上，构建重组DNA分子。

（4）将重组DNA分子通过一定的方法引入到受体细胞进行扩增和表达，从培养细胞中获得大量细胞繁殖群体。

（5）筛选和鉴定转化细胞，剔除非必需重组体，获得引入的外源基因稳定高效表达的基因工程菌或细胞，即将所需要的阳性克隆挑选出来。

（6）将选出的细胞克隆的基因进一步分研究，并设法使之实现功能蛋白的表达。

第三章基因工程工具酶1、基因工程中常用的工具酶：限制酶、连接酶、聚合酶、修饰酶2、细菌的限制—修饰系统（简称R—M体系）：细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统R-M体系说明的问题和作用：R-M系统是细菌安内御外的积极措施。

细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。

个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。

3、限制性内切酶的切割方式（识别哪种末端）（1）平齐末端：（切割位点在识别序列中心轴处）（2）5’黏性末端：（DNA片段末端的5’端比3’端长）梅园复印店打印复印只要一毛打好后送货上门。

基因工程复习资料（已修改）基因工程复习资料一、基因工程：概念：基因工程是指采用类似于工程设计的方法，根据人们事先设计的蓝图，人为地在体外将外源目的基因插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合即重组载体DNA分子，并将这种含有目的基因的重组载体分子转移到原先没有这类目的基因的受体细胞中去扩增和表达，从而使受体或受体细胞获得新的遗传特性，或形成新的基因产物。

基本流程：（1）目的基因的分离、获取与制备（2）目的基因与载体连接构建成为重组载体分子（3）重组DNA分子导入到受体细胞（4）外源目的基因阳性克隆的鉴定和筛选（5）外源目的基因的表达二、基因工程的发展简史1、基因工程诞生的背景：（1）发现了生物的遗传物质DNA而不是蛋白质。

（2）明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制。

（3）遗传密码子的破译。

2、技术上的三大发明：（1）利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶体外切割和连接DNA 片段。

（2）质粒改造成载体以携带DNA片段克隆。

（3）逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条道路。

3、基因工程的诞生标志（P4）三、工具酶1、限制性核酸内切酶常见的类型：BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HindⅡ、PstⅠ、SalⅠ、SamⅠ。

2、DNA连接酶常用的类型：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。

3、DNA聚合酶类4、碱性磷酸酶5、末端脱氧核苷酸转移酶6、其他工具酶四、限制性核酸内切酶依来源分类1、同位酶：即识别相同的序列但切割位点不一样。

2、同尾酶：即识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。

3、同裂酶：即识别位点和切割位点均相同的酶。

五、影响限制性核酸内切酶酶切的反应条件1、温度：大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37°C，但也有例外，如SamⅠ的反应温度为25°C.降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。

2、盐离子浓度：不同的限制性核酸内切酶对盐离子强度有不同的要求，一般按离子浓度不同分为低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。

第一章绪论1 •基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA）,转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。

2•基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3 •基因工程的基本步骤（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

（2）重组体的制备：将冃的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。

（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞川。

（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。

（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。

4 •基因工程的意义（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。

（2）基因工程在工业中的应用：1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素來生产葡萄糖，发酵成酒。

2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。

或用酿酒酵母生产蛋白质等。

（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物；用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。

（4）基因工程在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌〃分解油（烷怪类）、有机农药污染。

（5）基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1. 质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离，复性快。

染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起, 在离心的时候沉淀下去。

第一章一．名词解释1、基因工程：按工程学原理，将外源基因切割，及载体结合，导入受体细胞，使其稳定表达的过程。

2、目的基因：开发人们特殊需要的基因产物或及优良性状相关的基因。

3、工具酶：体外进行合成、切割、连接、修饰等过程需要的酶。

4、药物：在受体细胞内表达产物有药理作用或通过定位整合直接抑制致病基因的。

二．基因工程理论依据（1）基因具有相同的物质基础（2）基因可以切割（3）基因可以转移（4）基因及多肽有对应关系（5）基因的密码是通用的（6）基因可以通过复制遗传给下一代三．基因工程研究内容（1）克隆载体的研究（2）受体的研究（3）工具酶的研究（4）目的基因的研究（5）新技术的研究第二章一．名词解释1、变性：在较高温下，双链间氢键断开，形成单链的过程。

2、复性：变性的，降温时恢复为双链的过程。

3、解链温度：让达到50%变性的温度。

4、复制子：从复制起点开始复制出一个分子或片段的核苷酸序列。

5、启动子：不转录，是聚合酶的识别结合位点。

6、转录区：能转录相应，包括编码区和终止子。

7、操纵子：原核生物中两个以上基共用一个启动子。

8、内含子：真核生物转录区中的非编码间隔序列。

9、限制性核酸内切酶：使一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。

10、稀切酶：有较长的识别序列和富含或的识别序列的限制性核酸内切酶。

11、同裂酶：不同的酶有相同的识别序列。

12、同尾酶：切割不同识别序列产生相同末端的不同酶。

13、黏性末端：两条链断开位置是交错的，叫黏性末端。

14、平末端：两条链断开位置是平齐的，叫平末端。

15、位点偏爱：某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。

16、酶活单位：限制酶最适条件下60分钟切割1所需的酶活性。

17、容积活性：1酶活单位所具有的酶活性。

18、限制酶的活性：一些特定条件下，可以切断及原来识别序列不同的碱基序列，这个现象叫活性。

1、基因工程（genetic engineering）：就是在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质（基因），在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA 分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给下代。

2、基本技术路线：分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（入宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）3、基因工程的基本要素：目的基因、克隆载体、工具酶、受体细胞4、载体(vector)：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

5、作为克隆载体必须具备的条件：至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。

应有一个或几个限制性内切酶的单一识别位点，以供外源DNA的插入。

应有一个或多个利于检测的遗传表型，易于识别和筛选。

如抗药性、显色表型等，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。

适当的拷贝数。

6、载体的分类：按载体的来源分：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、植物病毒载体、动物病毒载体、人工染色体等。

按用途分：克隆载体（clone vector）：主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简单的载体，其上有复制子即可。

表达载体（expression vector）：用于一个基因的蛋白表达，是在常规载体的基础上衍生而来，这类载体既有复制子，更要有强启动子。

穿梭载体（shottle vector）：含有两个不同的复制子，能在两类不同的受体细胞中复制。

7、质粒载体的生物学特性：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的双链共价闭合的环状DNA分子，依赖宿主细胞的存在。

8、pBR322的优点：1、具有较小的分子量，4363bp 。

2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号：Tetr Ampr 插入失活效应3、具有较高的拷贝数。

9、pBR322质粒的结构来源：来自pSCl01 的四环素抗性基因Tetr ；来自ColEl 的衍生物pMBl 的松弛复制起点ori ；来自pSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。

第一章绪论1.基因工程（genetic engineering）按照人们预先设计的蓝图，将一种生物的遗传物质绕过有性生殖导入另一种生物中去，使其获得新的遗传性状，形成新的生物类型的基因操作（genetic manipulation）。

2.基因工程诞生的基础理论上的三大发现：DNA是遗传物质、DNA双螺旋模型和半保留复制机理、遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。

技术上的三大发明：限制性核酸内切酶的发现与 DNA 的切割、DNA 连接酶的发现与 DNA 片段的连接、基因工程载体的研究和应用3.基因工程研究的主要内容基础研究：基础研究、克隆载体研究、受体系统的研究、目的基因的研究、生物基因组学的研究、应用研究4.基因工程的基本操作程序✓分离获得目的基因✓限制性核酸内切酶将切割源 DNA 和载体✓DNA 连接酶将外源 DNA 和载体连接，组成重组 DNA 分子。

✓将重组 DNA 分子引入受体细胞✓带有重组体的细胞培养扩增，获得大量的细胞繁殖群体✓筛选和鉴定转化细胞✓进一步研究分析，实现功能蛋白的表达第二章工具酶根据工具酶催化的反应类型分为四大类：①核酸酶，用于切割或降解核酸分子：②连接酶，可以把核酸分子连接起来：③聚合酶，用于核酸分子的扩增或拷贝：④修饰酶，能够给核酸分子添增或除去核甘酸或某些化学基团。

常用基因工程工具酶：限制性内切酶、甲基化酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、磷酸激酶和磷酸酶、核酸酶、核酶。

一、限制性内切酶1.R-M 系统：细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。

细菌 R-M 系统的限制酶可以降解 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。

2. 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。

基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。

2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。

如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。

并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。

3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。

种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。

4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。

②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。

③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。

5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。

基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。

粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。

Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。

转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。

基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。

目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。

连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。

转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。

停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。

逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。

PCR: 即聚合酶链式反应。

在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。

α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。