固体荧光分析实验报告

荧光分光光度法

一、 实验目的

1、学习荧光分光光度法的基本原理；

2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法；

3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。

二、 实验原理

荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。荧光（fluorescence）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。由此可见，荧光是一种光致发光。

任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和发射光谱（emission spectrum）或称荧光光谱（fluorescence spectrum）。激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。

荧光强度（F）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即

该式即荧光分光光度法定量分析的依据。使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。

三、 仪器与试剂

F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL）；牛血清白蛋白（BSA）

四、 实验内容

1、 开机准备：接通电源，启动电脑。打开光谱仪主机电源，预热15分钟。

2、 运行FL solution软件，设定检测方法和测量参数：

固体酒精的配制

一、 实验目的:

固体酒精的配制原理和实验方法

二、 原料：

1、酒精： 工业酒精 》95%。

2、硬脂酸钠： 不溶于水，但溶于热乙醇

3、虫胶片： 是一种天然树脂，不溶于水，受热软化，冷却后固化，在本实验中作粘结剂使用。主要成分是一些羟基酸内酯和交酯的混合物。

4、石蜡：固体烃的混合物。本实验中，石蜡作为固化剂使用，但本身可以燃烧，加入量太多时，燃烧不充分时，产生烟雾和不愉快的气味。

三、实验原理

硬脂酸与氢氧化钠混合后将发生下列反应：

C17 H35C00H + NaOH = C17H35C0ONa+ H2O

反应生成的硬脂酸钠是一个长碳链的极性分子，室温下在酒精中不易溶．在较高的温度下，硬脂酸钠可以均匀地分散在液体酒精中，而冷却后则形成凝肢体系，使酒精分子被束缚于相互连接的大分子之间，呈不流动状态而使酒精凝固，形成了固体状态的酒精．

四、实验操作：

取0.4g氢氧化钠，加入烧瓶中，加入0.5g虫胶片，40mL酒精和数粒沸石，加热，冷凝回流，只至固体充分溶解。在烧杯中加入2.5g硬脂酸和10mL酒精，加热至硬脂酸充分溶解，加入上述的溶液中，摇动，使其混合均匀，回流10min，移去水浴，开始冷却。待降温到60度时，导入模具中，加盖，防止酒精蒸发，冷却固化，从模具中取出成品。切一块样品，在坩埚上，直接用火点燃，观察燃烧情况。

五、实验现象：

反应完全；反应液混合后pH=7；倒出时已有部分固体酒精生成，导致部分产物挂壁，造成损失，成品为土黄色透明固体，硬度大；燃烧时火焰呈黄色，表面形成膜状物，不流淌；燃烧后有少量残渣。

六、讨论：

1、不同固化剂制得的固体霜精的比较：

以醋酸钙为固化剂操作温度较低，在40~50 C即可．但制得的固体酒精放置后易软化变形，最终变成糊状物．因此储存性能较差．不宜久置。

以硝化纤维为固化剂操作温度也在4O～ 50 c，但尚需用乙酸乙酯和丙酮溶解硝化纤维．致使成本提高．制得的固体酒精燃烧时可能发生爆炸，故安全性较差。

荧光素酶报告实验

1 扩增目的片段

扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：

第一种方法：

第二种方法：

1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。酶切产物进行胶回收。

酶切体系 连接体系

Component Volume (μl) Component Volume (μl)

H2O 16-x H2O 8-m-n

Vector or DNA x Vector m

NEB Buffer I或IV 2 DNA n

Spe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1

Pme I 1 T4 DNA Ligase 1

Total voloume 20 Total voloume

10

1.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。并扩繁阳性克隆。重组 Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组 Luc-3’UTR-Mut 原理相同）：

pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建

4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h；

5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞；

一、实验目的

1. 掌握荧光检测的基本原理和实验方法。

2. 熟悉荧光光度计的操作步骤和注意事项。

3. 学习如何通过荧光光谱分析物质的性质和浓度。

4. 提高实验操作技能和数据分析能力。

二、实验原理

荧光检测是利用物质在特定波长光照射下，吸收光能后发射出特定波长光的现象。当分子吸收光子后，外层电子从基态跃迁到激发态，激发态的分子不稳定，会通过辐射跃迁的方式返回基态，同时发射出与激发光波长不同的光辐射，即荧光。

本实验采用荧光光度计对样品进行检测，通过测量激发光谱和发射光谱，可以确定样品的荧光特性，进而对样品进行定性和定量分析。

三、实验仪器与试剂

1. 仪器：荧光光度计、紫外-可见分光光度计、比色皿、移液器、烧杯、蒸馏水等。

2. 试剂：罗丹明B标准溶液、罗丹明B样品溶液、无水乙醇、氢氧化钠溶液等。

四、实验步骤

1. 样品制备：将罗丹明B标准溶液和罗丹明B样品溶液分别用无水乙醇稀释至一定浓度，制备成待测溶液。

2. 激发光谱测定：

a. 将待测溶液置于比色皿中，放入荧光光度计样品室。

b. 设置激发光谱扫描范围和步长，进行激发光谱扫描。

c. 记录激发光谱曲线。

3. 发射光谱测定：

a. 将待测溶液置于比色皿中，放入荧光光度计样品室。

b. 设置发射光谱扫描范围和步长，进行发射光谱扫描。

c. 记录发射光谱曲线。 4. 数据分析：

a. 利用Origin软件对激发光谱和发射光谱进行拟合处理，得到最佳激发波长和发射波长。

b. 根据罗丹明B标准溶液的浓度和荧光强度，绘制标准曲线。

c. 利用标准曲线对罗丹明B样品溶液进行定量分析。

五、实验结果与讨论

1. 激发光谱和发射光谱：通过实验得到罗丹明B标准溶液和样品溶液的激发光谱和发射光谱。激发光谱表明，罗丹明B在530 nm左右有较强的激发峰；发射光谱表明，罗丹明B在590 nm左右有较强的发射峰。