贴壁细胞转染条件

贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。

通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。

这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。

常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。

本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。

材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP 管。

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。

（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。

PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。

Mix。

）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。

重复。

直到需要的细胞数。

12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。

种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇。

②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，0.33， 0.66 ，1.33 ，，饱2.66， 3.99 4.66 μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2和湿度条件培养箱内孵育7天。

细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。

（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。

细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。

试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。

（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。

细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。

(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。

(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。

(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。

(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。

(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。

细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至37℃。

打开离心机。

（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。

（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。

（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。

（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。

（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。

各种转染试剂的中文转染方法FuGENE6（Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。

将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。

将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。

使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。

1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。

2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。

3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。

4. 室温孵育20分钟。

5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。

6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。

7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。

Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。

细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。

3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。

Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。

NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。

4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。

室温放置20分钟。

5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。

RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。

注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。

2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。

1 中板。

贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。

2 转染。

A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection中板密度*Culturevessel Surf.areaperwellVol. ofplatingmediumVol. ofdilutionmediumDNA Lipofectamine™2000cell/well96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul0.5-2X105cell/well24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul1-3X105cell/well12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul2-3X105 cell/well 6-well(35mm)10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul8-10X105cell/dish60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul2-3X106cell/dish10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。

一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。

以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。

（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。

2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。

8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。

三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。

转染率很高。

以下是个人经验，与大家分享。

1.细胞的状态。

这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。

有文献说传代不要超过17代。

我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。

2.细胞的融合度。

磷酸钙-DNA共沉淀法核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。

此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液(1)2×HBS 1.63g NaCl1.19g Hepes0.023g Na2PO4、2H2O加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌(3)TE：0.1mmol/L EDTA1mmol/L Tris-HCL PH8.0(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步骤[方法一]：(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。

如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。

(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。

一文包揽细胞转染那些事儿（含操作视频）作者：解螺旋·子非鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手导语细胞转染对初接触细胞实验的菜鸟而言，是一道难过的坎儿。

当科研汪们在这个坎儿上摔了无数次的跟头后，心里的阴影面积便被无限扩大，似乎只要碰到细胞转染就永无翻身之日。

然而现在就放弃该实验还为之过早。

正所谓授之以鱼不如授之以渔，同时也为了让大家成功跨过这道坎儿，小鱼这就把做细胞转染的技巧分享给大家，让你分分钟从菜鸟变成细胞转染达人！细胞转染是指将DNA或RNA导入真核细胞中，用于研究基因功能和蛋白表达分析等，可依据是否整合到细胞基因组，分为瞬时转染（24-96h）和稳定转染。

细胞转染方法类型及不同之处如下面两张图片所示，大家可以依据自己的实验需求来选择不同的实验方法。

其中，实验中应用最广泛的是脂质体介导的细胞转染。

细胞转染具体实验步骤的视频：一般影响转染效率的主要因素：细胞、血清、抗生素、核酸质量与数量、转染技术。

只要在这几个因素上多加注意，就可以避免掉进细胞转染效率低下的大坑。

细胞1. 选择传代次数较低并处于对数生长期的细胞进行转染。

对大多数细胞而言，均需要在转染当天或前一天铺板，第二天上午进行转染，48h后收集细胞进行功能检测。

对于原代细胞，可用促有丝分裂刺激物进行细胞活化。

2. 对于贴壁细胞，一般要求在转染前一日，用胰酶处理为单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，最好在转染前4小时换一次新鲜培养液。

3. 支原体污染会严重降低细胞转染的效率，且支原体不会像细菌污染那么明显，因而转染前可用环丙沙星处理细胞以除去支原体。

4. 细胞转染时需要一定的细胞密度，以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜。

核酸质量和数量1. 选择高纯度（OD260/280比值在1.8以上）且去除内毒素的DNA进行细胞转染。

如果DNA的纯度差，则其携带的少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的效率。

转染步骤111基因转染技术简介常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。

转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA 的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。

如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。

对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。

用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。

应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。

具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。

靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。

根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。

如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。

前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。

DNA转染细胞的操作方法及步骤脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。

阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA—脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体。

其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录表达。

Lipo2000是最常见的广谱脂质体转染试剂，以其操作简单、转染效率高、对细胞毒性较低等优点，在各大高校实验室、研究所等都得到广泛的使用。

下面将以24孔板对应用量为例，简单介绍DNA转染哺乳动物细胞的操作方法。

1. 实验用品1.1 主要试剂：Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent （Invitrogen 11668019）Opti-MEM® I Reduced Serum Medium（Gibco 31985-062）1.2 主要耗材：无菌枪头，一次性移液管，1.5mL EP管，15 mL离心管，细胞计数板，24孔板2.实验操作2.1 细胞准备1) 贴壁细胞：转染前一天，在500μL无抗生素的培养基中接种细胞，约0.5-2×105个/孔。

2) 悬浮细胞：转染前一天，在500μL无抗生素的培养基中接种细胞，约4-8×105个/孔。

2.2 DNA—脂复合体配制1) 准备两支1.5mL EP管（标记管1和管2），加入50μL Opti-MEM® I 低血清培养基（如无，可使用其他无血清培养基代替）。

2) 取1 μg目的质粒（DNA），加入管1稀释，轻轻混匀。

3) 充分吹打混匀Lipofectamine™ 2000原液管，按照DNA（μg）与Lipo（μL）添加比例1:2-1:3，取2-3μL Lipo悬液加入管2稀释混匀，室温下静置5min。

贴壁细胞慢病毒转染步骤及方法
一、细胞培养Panc-1 细胞，常规培养使用含10% FBS (GIBCO) 的DMEM 培养基（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

二、病毒侵染实验材料及试剂DMEM培养基+ 10% FBSPBS（Life Science Products&Services）Trypsin-EDTA Solution (Gibco)24孔板（Corning）Lentivirus-NC 病毒液（GenePharma，1×109 TU/mL）
三、步骤
1. 将状态良好的Panc-1 消化后重悬，取适量细胞接种至24 孔板中，37°C培养箱中过夜；
2. 取阴性对照病毒，按1:10、1:100、1:1000 与DMEM培养基混合稀释，总体积约500 μL，并加入终浓度5 μg/mL Polybrene；
3. 吸去24 孔板中原培养基，换入阴性对照病毒梯度稀释液，37°C培养箱中培养；
4. 24h 后吸去阴性对照病毒稀释液，换入500 μL新鲜培养基，37°C培养箱中培养；
5. 48-96h 于荧光倒置显微镜下观察并记录结果。

OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击： 194次•MEM细胞培养基无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。

贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。

以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。

(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。

2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总体积250 ul)4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。

8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。

一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。

使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。

2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。

37℃孵育。

3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。

4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。

5、继续培养。

如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。

如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。

如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。

二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。

37℃孵育。

或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。

2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。

3、继续培养3-4天。

中间视细胞生长情况可传代或换液。

细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。

（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。

细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。

试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。

（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。

细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。

(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。

(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。

(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。

(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。

(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。

细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至38℃。

打开离心机。

（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。

（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。

（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。

（5） 1500r/min离心4min，弃上清液。

（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。

siRNA转染步骤—贴壁细胞
示例：使用Lipofectamine RNAiMAX和HeLa cell 用于siRNA 的在6孔板上进行的转染实验。

注：请实验前确认实验使用的细胞系是否适合转染试剂。

1、转染前一天，在6孔板中每个孔内播种 3.0 x 10^5 HeLa cells，每孔放2.5mL不含抗生素的生长培养基。

这样在转染时会有50-60%的融合率。

2、从细胞中去除生长培养基。

3、加入1.5 mL新鲜的不含血清的生长培养基。

4、对于每个转染的孔，按照如下方法准备siRNA 和Lipofectamine RNAiMAX 混合物。

4-1、在250μl的无血清生长培养基中加入100pmole siRNA，柔和混匀。

4-2、Lipofectamine RNAiMAX使用前要先混匀，然后在250μl 生长培养基中加入5μl的Lipofectamine RNAiMAX进行稀释，室温下温育5分钟。

4-3、混合稀释好的siRNA和Lipofectamine RNAiMAX，室温下温育20分钟。

5、加入混合物到含有HeLa cells的6孔板中，每孔终体积为2ML，并轻晃混匀。

6、在37℃的二氧化碳培养箱中培养细胞 5-6小时。

7、更换含有血清的培养基并培养细胞24-48小时，直到进行基因敲除实验。

细胞转染注意事项
1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。

2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。

3.培养基中的血清
在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。

其实，只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。

4.培养基中的抗生素
抗生素是影响转染的培养基添加物。

这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。

这时候可以选择英格恩生物的Entranster转染试剂，非脂质体试剂，培养基可加抗生素，避免了细胞染菌。

5.设置阳性对照和阴性对照。

6.一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。

根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。

7.如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基
因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。

如何用电转拯救我们难转染的细胞？当我们做转染实验的时候，总会遇到一些难转染的细胞。

恰巧课题组研究的是原代细胞、神经细胞或者是免疫细胞，化学转染方法反复试验失败，这时候就得借助电转来帮助我们推进实验进程了。

对于贴壁细胞和悬浮细胞，在电转前需要进行不同的处理。

贴壁细胞•电穿孔前一天，通过胰酶消化释放贴壁细胞，将细胞转移到含新鲜生长培养基的75cm2细胞瓶中，接种密度应保证电穿孔当天细胞能够达到50%~70％的汇合度（多数细胞系为每次电穿孔1 X 105 ~ 10 X105细胞）。

•实验当天，吸出生长培养基，PBS 洗涤细胞，胰酶消化释放贴壁细胞。

取胰酶消化的细胞悬液，用血细胞计数板计数细胞密度。

细胞悬液于室温下500g 离心5min 。

•用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~ 5 X 106细胞／mL 的密度重悬细胞沉淀。

轻轻吹打细胞获得均一悬液。

悬浮细胞•电穿孔前一天，于75cm2细胞瓶中用新鲜生长培养基稀释细胞，以保证电穿孔当天细胞能够达到指数生长中期的汇合度( 0. 5 X 106~4 X 106个细胞／mL ) 。

计数细胞并按上述离心收集细胞。

•用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~5 X 106个细胞／mL 的密度重悬细胞沉淀。

轻轻吹打细胞获得均一悬液。

电穿孔操作步骤1. 在电穿孔仪器上设置参数。

根据细胞类型选择预设程序或优化程序。

对于指数程序（即指数衰减脉冲），通常电容为1050μF , 电压在200 ~ 350V 。

一般260V 起始电压、以50V递增对大多数细胞有效。

内部阻抗设为无限大。

1.向电穿孔杯中加入10 ~ 50μg 质粒DNA 。

如有必要，可加入运载DNA，使DNA 总量达到120μg 。

2.向电穿孔杯中加入细胞，轻轻反复吹打使细胞和DNA 混匀。

3.将电穿孔杯放进电穿孔仪，盖上盖子，进行一次电脉冲。

4.立即向电穿孔杯中加入0.5mL 生长培养基，然后将电击后的细胞转移到合适大小的组织培养皿或多孔板中。

贴壁细胞传代材料：贴壁细胞（未传代，处于细胞培养瓶中）无菌细胞培养瓶（25 cm2）正方透气盖斜口无菌巴氏吸管移液枪15 mL无菌离心管无菌枪头专属培养基胎牛血清(南美特级)青霉素-链霉素溶液(双抗)DPBS缓冲溶液（优于PBS缓冲溶液）胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)-含酚红步骤：（1）进入细胞房，向超净台中放入所用耗材，打开紫外灯照射30 min。

（2）37 ℃水浴完全培养基（专属培养基：10%胎牛血清：双抗=89：10：1），胰酶和DPBS缓冲溶液10min。

（3）关闭紫外灯开始操作，点燃酒精灯。

（4）将水浴后的完全培养基，胰酶和DPBS缓冲溶液用75%的酒精消毒后放入超净台，在培养箱中取出未传代的细胞，75%酒精处理后放入超净台，打开瓶塞，微微倾斜细胞培养瓶，集中液体培养基，用巴氏吸管吸走液体培养基（细胞贴壁，不会出现大量损失），沿壁缓缓加入3 mL DPBS缓冲溶液，轻轻摇动，悬浮不再贴壁的死细胞，再次用巴氏吸管吸走DPBS缓冲溶液，去除死细胞。

（5）缓缓加入约1 mL胰酶（贴壁细胞变为圆形），消化一段时间（自己把控，应处于贴壁细胞将要悬浮但未悬浮状态，可在倒置显微镜下计时观察，室温下细胞何时悬浮，轻轻晃动培养瓶，细胞是否分离瓶壁并流动），立即倾斜细胞培养瓶，防止消化过度，影响细胞生长，加入3倍胰酶体积的完全培养基终止消化，吸取瓶内液体轻轻吹打壁上细胞，使之冲散，再吸取瓶中所有液体，将吹打下的细胞转移到15 mL无菌离心管中。

（6）将离心管离心，1000 r/min，3 min，细胞聚集于离心管底部，清晰可见。

（7）用移液枪吸去上清液，保留底部细胞沉淀，加入3 mL完全培养基，轻轻吹打重悬，在各吸取1 mL分装到3个新的无菌细胞培养瓶中，各加入2 mL完全培养基，放回培养箱中培养，传代完成。

总结及注意事项:操作人员应佩戴口罩和无菌手套；进入超净台时应用75%酒精消毒；操作过程中手不可以在开口的培养基及试剂瓶上挥过；开启瓶盖后和旋回瓶盖前要过酒精灯火焰；开启培养箱时也要进行消毒处理，培养箱门应开关及时，防止各气体比例和温度变化过大。