植物制片的染色及显微化学鉴定方法
一、目的与要求
1、学习植物制片的一般染色方法。
2、学会并掌握常用显微化学鉴定法，即细胞壁化学组成及细胞内主要后含物性质的鉴定方法。
二、材料和用品
1、自备材料：植物叶片、芹菜叶柄、土豆块茎、花生种子等等，解剖器、剃刀或双面刀片。
2、其它材料和用品：显微镜、载玻片、盖玻片、纱布、吸水纸、蒸馏水、染色缸；0.1%番红、0.1% 固绿或1%苯胺蓝等染液、中性树胶、二甲苯、酒精、碘—氯化锌、盐酸—间苯三酚、苏丹Ⅲ、碘—碘化钾、10%氯化铁、盐酸等。
三、实验内容
1、植物制片的染色方法
2、常用显微化学鉴定法
四、实验方法
1、植物制片的染色方法
用徒手切片法切得的薄片，如果仅仅是为了临时观察，制成临时装片即可，这种临时制片不能长久保存，只能作临时观察之用，又由于没经过染色，结构显示的也不够清晰。为了求得更清晰地显示其细微结构及化学成分，并能够较长时间的保存，可以进一步染色及其它处理以至封片，从而可制成半永久或永久制片。常用的染色方法是番红—苯胺蓝（或固绿）二重染色法，具体操作方法有二：
方法一：
（1）将植物切片材料放入30%酒精中，5分钟后移入水中。
（2）用0.1%番红水溶液染色12—24小时。
（3）倒去番红液，用清水冲洗数次后，再放回50%酒精中浸泡5分钟。
（4）将材料从50%酒精中转入70%酒精中脱色，直至硬木质化的细胞壁呈现红色，其它部分呈粉红色或近于无色时为止。
（5） 1%苯胺蓝（用70%酒精配制）对染2—5分钟。若用0.1%固绿对染，则仅需半分钟左右即可。
注意：此步染色，要不时地在显微镜下检视，切忌染色过深，当木质化细胞壁呈红色，其它部分为淡蓝或淡绿色时，即可停止。
（6）用95%酒精冲去多余染液，再经无水酒精脱水5分钟。
（7）放入等量无水酒精与二甲苯溶液中及纯二甲苯中透明各3分钟。
（8）将切片材料移入载玻片上，在二甲苯未干时立即加一滴中性树胶封片，尔后将玻片平放，自然凉干或置于摄氏35度温箱中烘干。
染色结果：木质化细胞壁呈现红色，纤维素细胞壁呈现蓝色或淡绿色。
方法二：
（1）将切得的薄片移入盛有FAA固定液的小容器中，盖上盖固定半小时到1小时，24小时以上也可。材料经固定如不及时制片可移入70%酒精中长期保存。
（2）材料从固定液中移入盛有蒸馏水的小培养皿中，漂洗半小时到1小时，换水一次。
（3）将材料移入载玻片上，用吸水纸吸去多余水分，加一滴苯胺番红染色约10分钟。
（4）吸去染液，滴入95%酒精洗两次，去浮色及脱水。
（5）加一滴苯胺固绿复染约2～5秒钟，并轻轻晃动玻片，使染色均匀。（注意：此步骤要迅速，若染色时间过长会使红色全部褪去。）
（6）吸去染液，滴入无水酒精洗两次，去浮色及脱水。
（7）滴入等量无水酒精与二甲苯溶液约1分钟后吸去，再滴入纯二甲苯冲洗2次，使材料透明。
（8）擦去材料以外的残存药剂，使玻片清洁，但不使材料上的二甲苯干掉，并及时镜检。
（9）镜检后，如材料的构造清晰，红绿对比鲜明，立即加一滴中性树胶封片。
染色结果同样是木质化细胞壁呈现红色，纤维素细胞壁呈现淡绿色。这种方法更节省时间一些。
2、常用显微化学鉴定法
显微化学鉴定法即将材料经化学试剂处理后，在显微镜下检查、判定细胞壁的化学组成及细胞内含物性质的方
法。此法广泛地应用于教学和对植物器官、组织和细胞内含物的研究工作中，也应用于分辨细胞结构的观察中。下面介绍几种在植物解剖学中常用的化学鉴定法，这些方法均适用于徒手切片法切成的薄片材料的观察。切片不能太薄，否则材料中内含物太少化学反应效果则不甚明显，材料的厚度应在20～40微米较为适宜。
（1）细胞壁化学组成显微化学鉴定法
细胞壁的化学成分主要是纤维素和木质素，还有一定的栓质、角质和果胶等。本实验主要学习纤维素和木质素的鉴定方法。
纤维素化学鉴定法：是植物细胞的细胞壁最主要的成分，常用鉴定方法有两种：
（A）碘—硫酸法：先用1%碘液滴在材料上，然后再加一滴66.5%硫酸。经过这样的处理，纤维素的细胞壁呈蓝色反应。由于硫酸可将纤维素水解成胶态水解纤维素，遇碘后呈现蓝色反应。
提示：1%碘液配法：将1.5克碘化钾溶于100毫升蒸馏水中，待溶解后，加入1克碘。
66.5%硫酸的配法：7份硫酸加3份水即可。
（B）氯化锌—碘法：纤维素细胞壁在碘氯化锌溶液的作用下呈现紫蓝色。
提示：碘氯化锌溶液的配法：A液：碘化钾 1克，碘 0.5克，蒸馏水 20毫升。
B液：氯化锌 20克，蒸馏水 8.5毫升。
将B液加微温，使其溶解后冷却，再将A液一滴一滴的加入到B液，至显示碘的沉淀物（摇荡后也不消失）为止（大概用A液1.5毫升）。此试剂配好后须置入暗色玻璃瓶中避光保存。
在大多数情况下，应用“氯化锌—碘”法比用“碘—硫酸”法更为方便。可是由于组成此种试剂的各种成分的浓度不同以及材料性质不同，反应也常常不同，在有些情况下不一定有良好的效果。
木质素化学鉴定法：某些植物的细胞壁中含有木质素，特别是输导组织中的导管和管胞以及机械组织中的纤维和石细胞等细胞木质化程度更甚。
鉴定木质素最常用的方法是盐酸间苯三酚反应法，滴一滴盐酸间苯三酚于材料上，木质化细胞壁经盐酸间苯三酚试剂处理后呈现紫红色或桃红色。
提示：盐酸间苯试剂配制方法是：2克间苯三酚溶解于95%酒精100毫升中，过滤后加入40毫升浓盐酸。注意间苯三酚为白色粉末，易氧化变性，若已呈灰褐色或溶液呈黄褐色即失效。另外，此法并非是木质素的专一染色反应，故应用时须注意。
木质素鉴定的硫酸苯胺法和氯化锌—碘法见教材。
至于栓质、角质和果胶的鉴定法见教材。
（2）细胞内含物的化学鉴定法
淀粉的鉴定：淀粉是植物中最主要的储藏物质，它们在各种不同植物的细胞中呈各种不同形状的颗粒。用碘液处理时，淀粉引起碘反应形成碘化淀粉，呈现蓝色，是唯一的一种淀粉颜色显微化学反应剂。
提示：碘液的配制方法是：先取3克碘化钾溶于100毫升蒸馏水中，再加入1克碘配成原液（保存于棕色瓶中）。使用时用蒸馏水稀释10倍或100倍。医用碘酒稀释2倍亦可应用。
蛋白质的鉴定：植物细胞内储存的蛋白质常呈固体颗粒——糊粉粒。常用的鉴定方法有碘试剂法和曙红—酒精苦味酸法。本实验采用碘试剂法，此法简单，且可与鉴定淀粉同时进行。在切片材料上滴上碘试剂后（用未经稀释的原液），蛋白质被染成黄色，而淀粉则成蓝紫色。另外，除蛋白质以外，有些其它物质也可以染成黄色，但是，这些物质经水洗后均可除掉。至于曙红—酒精苦味酸法参见实验教材。
脂肪和油的鉴定：鉴定脂肪和油常用的方法是用苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ酒精溶液染色，脂肪和油遇苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ酒精溶液被染成橘红色（染色时微微加热可以加速染色）。
注意：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ除了能染脂肪呈红色外，它还能使树脂、挥发油、栓质化的细胞壁与角质化细胞壁染色，因而不能作为脂肪存在与否的证据。但脂肪经苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色后呈红色，更为明显。
苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ酒精溶液的配制同前栓质和角质的鉴定法。
关于单宁、晶体、菊糖的鉴定见实验教材。
固定液配制：F.A.A固定液，又称标准固定液,万能固定液.适用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植物形态解剖究上应用极广,此固定液最大优点是兼有保存剂作用,但对染色体的观察效果较差.配方:福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收缩;还可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬.
