桉树根系共生真菌的分离与鉴定

西北植物学报,２０１８,３８(８):１５５３－１５６１A c t aB o t ．B o r e a l ．ＧO c c i d e n t ．S i n．㊀㊀文章编号:１０００Ｇ４０２５(２０１８)０８Ｇ１５５３Ｇ０９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀d o i :１０．７６０６/j．i s s n ．１０００Ｇ４０２５．２０１８．０８．１５５３收稿日期:２０１８Ｇ０４Ｇ０９;修改稿收到日期:２０１８Ｇ０５Ｇ２１基金项目:十三五国家重点研发计划项目(２０１８Y F D ０６００８１４);国家自然科学基金项目(４１６７１２６８)作者简介:王思佳(１９９５－),女,在读本科生,就读于林学专业.E Ｇm a i l :１６２４０９３７８７＠q q．c o m ∗通信作者:胡文涛,博士,副教授,硕士生导师,主要从事森林微生物学研究.E Ｇm a i l :h u w e n t a o １９８９２６＠s i n a ．c o m桉树根系共生真菌的分离与鉴定王思佳,赖文珍,谢贤安,陈㊀辉,唐㊀明,胡文涛∗(华南农业大学广东省森林植物种质创新与利用重点实验室,林学与风景园林学院,广州５１０６４２)摘㊀要:南方土壤缺磷现象较为严重,菌根真菌等共生真菌对植物吸收磷等养分具有重要的促进作用.该研究采集尾叶桉(E u c a l y p t u s u r o p h y l l a )㊁窿缘桉(E u c a l y p t u s e x s e r t a )和尾巨桉(E ．u r o p h y l l a ˑE ．gr a n d i s )３种华南地区主要造林树种根系,采用组织分离法进行真菌分离,通过形态特征和核糖体１８Sr D N A 基因I T S 序列分析进行鉴定,经柯赫氏法则(K o c h sR u l e )确定桉树根系共生真菌,为桉树共生真菌理论研究和资源利用提供依据.结果表明:(１)３种桉树根系中,窿缘桉具有外生菌根(e c t o m y c o r r h i z a s ,E C M )和丛枝菌根(a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a s ,AM )结构,尾叶桉和尾巨桉同时具有AM 结构㊁E C M 结构和深色有隔内生真菌(d a r ks e p t a t e e n d o p h y t e s f u n g i ,D S E )结构.(２)３种桉树根系中分离鉴定出６种真菌:三色小皮伞菌(M a r a s m i u s t r i c o l o r )㊁黑柄裸脚伞(G y m n o pu s m e l a n o Ｇp u s )㊁茎点霉属(P h o m a s p ．)㊁镰刀霉属(F u s a r i u m s p ．)㊁二型伞霉(U m b e l o p s i sd i m o r p h a )和芒弗里亚拟盘多毛孢(P e s t a l o t i o p s i sm a n g i f o l i a ).(３)６种真菌回接巨桉(E u c a l y p t u s g r a n d i s )组培苗,三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞形成E C M 结构,为E C M 真菌;茎点霉属㊁镰刀霉属㊁二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢形成D S E 典型的深色有隔菌丝和微菌核结构,推测为D S E ;其中２种E C M 真菌为桉树中首次报道.关键词:桉树;外生菌根真菌;共生真菌;深色有隔内生真菌中图分类号:Q ９３Ｇ３３１;Q ９４８．１２２．３文献标志码:AI s o l a t i o na n d I d e n t i f i c a t i o no f S y m b i o t i cF u n gi i n E u c a l y p t u s R o o t s WA N GS i j i a ,L A IW e n z h e n ,X I EX i a n a n ,C H E N H u i ,T A N G M i n g,HU W e n t a o ∗(G u a n g d o n g K e y L a b o r a t o r y f o r I n n o v a t i v eD e v e l o p m e n ta n d U t i l i z a t i o no fF o r e s tP l a n tG e r m p l a s m ,C o l l e g eo fF o r e s t r y an d L a n d s c a p eA r c h i t e c t u r e ,S o u t hC h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,G u a n gz h o u ,５１０６４２,C h i n a )A b s t r a c t :P h o s p h o r u s d e f i c i e n c y i s s e v e r e i n s o i l i n s o u t hC h i n a ．S y m b i o t i c f u n g i p l a y s a n i m po r t a n t r o l e i n p l a n t su p t a k i n gp h o s p h o r u s a n do t h e r n u t r i e n t s ,s u c h a sm y c o r r h i z a l f u n g i ．I n t h i s s t u d y ,w e s a m p l e d t h e r o o t s o f t h r e em a i n t r e e s p e c i e s i n s o u t hC h i n a ,E u c a l y p t u s u r o p h y l l a ,E u c a l y pt u s e x s e r t a ,a n d E ．u r o Ｇp h y l l a ˑE ．gr a n d i s ．R o o t t i s s u e s e p a r a t i o nw a s u s e d t o i s o l a t e a n d p u r i f y t h e f u n g i ,w h i c h i d e n t i f i e db y m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d I T Ss e q u e n c e a n a l y s i s o f １８Sr D N A g e n e ,a n ds y m b i o t i c f u n gi o f E u c a Ｇl y pt u s r o o t sw e r e v a l i d a t e db y K o c h sR u l e ．T h i s s t u d yp r o v i d e s s c i e n t i f i c e v i d e n c e f o r t h e o r y r e s e a r c ho n s y m b i o t i c f u n g i i n E u c a l y pt u s r o o t s a n d i t s r e s o u r c e u t i l i z a t i o n ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t :(１)t h e c o l l e c t e d r o o t s o f E ．e x s e r t a d i s p l a y e db o t he c t o m y c o r r h i z a s (E C M )a n da r b u s c u l a rm yc o r r h i z a s (AM )s t r u c t u r e s ．I n t e r e s t i n g l y ,b o t h E ．u r o p h y l l a a nd E ．u r o p h y l l a ˑE ．gr a n d i s p o s s e s s e d t h e s t r u c t u r e s o fAM ,E C M a n dd a r k s e p t a t e e n d o p h y t e s (D S E )．(２)S i x f u n g i w e r e i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d f r o mt h e r o o t s o f t h r e e s pe Ｇc i e s of E u c a l y p t u s :M a r a s m i u s t r i c o l o r ,G y m n o p u sm e l a n o p u s ,P h o m a s p ．,F u s a r i u m s p ．,U m b e l o ps i s d i m o r p h a ,a n d P e s t a l o t i o p s i s m a n g i fo l i a ,r e s p e c t i v e l y ．(３)S i x f u n g i w e r e i n o c u l a t e db a c k t o r o o t s o f E ．g r a n d i s t i s s u e c u l t u r es e e d l i n g s,M．t r i c o l o r a n d G．m e l a n o p u s a r ea b l e t of o r m E C M s t r u c t u r e i nh o s t r o o t s a sE C Mf u n g i,w h e r e a s o t h e r f o u r s p e c i e s o f f u n g i(P h o m a s p．,F u s a r i u m s p．,U．d i m o r p h a,a n d P．m a n g i f o l i a)f o r m e d t h ed a r kc o l o rm y c e l i u ma n d m i c r o s c l e r o t i a i nr o o t s,t h e t y p i c a lD S Es t r u c t u r e, w h i c hw e r e s p e c u l a t e d t ob eD S E．T h e t w oE C Mf u n g iw e r e f i r s t l y r e p o r t e d i n E u c a l y p t u s r o o t s．K e y w o r d s:E u c a l y p t u s;e c t o m y c o r r h i z a l f u n g i;s y m b i o t i c f u n g i;d a r ks e p t a t e e n d o p h y t e s f u n g i㊀㊀桉树是桃金娘科(M y r t a c e a e)桉属(E u c a l y pＧt u s)植物的统称,属常绿高大乔木,具有生长速度快㊁树干通直㊁适应性强等特点,是中国南方主要的造林树种[１].南方酸性红壤和砖红壤中磷成分主要为磷酸铝㊁磷酸铁和磷酸钙,有效磷含量低,引起桉树生长缓慢,某些组织发生畸变等现象[２].为此,大多桉树栽培区通过施用化肥来提高桉树生长量,而化肥又会导致土壤理化性质不断加剧恶化,土壤质量下降.加之南方土壤呈酸性,磷肥很难被植物吸收,最终导致桉树缺磷现象严重,长期使用化学肥料,不仅会对周围环境造成污染,还会导致土壤肥力退化[１].菌根(m y c o r r h i z a)是土壤中某些真菌与植物根系形成的共生体,具有促进植物吸收水分和磷素等矿质营养,提高植物生长量,增强植物抗逆能力和改良森林土壤结构特性等重要作用[３Ｇ５].外生菌根(e c t o m y c o r r h i z a s,E C M)和丛枝菌根(a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a,AM)是林木菌根的主要类型[５].深色有隔内生真菌(d a r k s e p t a t e e n d o p h y t i cf u n g i, D S E)广泛存在于植物根围,是一类能够定殖在植物根系的真菌类群,被认为是 特殊的菌根菌 [６],并且能够与菌根真菌共同存在于植物根系中[７Ｇ８].桉树是既可以形成AM,又可以形成E C M的树种[９].AM真菌可以在一定程度上提高桉树对磷的高效利用,并且能够缓解桉树受到土壤中铝离子的毒害[５].E C M真菌对桉树青枯病的生物防治有重要意义[１０].朱天辉等[１１]对四川省范围内的巨桉(E u c a l y p t u s g r a n d i s)㊁尾叶桉(E u c a l y p t u su r oＧp h y l l a)㊁蓝桉(E u c a l y p t u s g l o b u l u s)㊁大叶桉(E uＧc a l y p t u s r o b u s t a)E C M真菌调查,发现９科１１属１７种E C M真菌,梁洪萍[１２]在四川省内的巨桉发现７科㊁１０属㊁１７种E C M真菌,但这些E C M真菌多为野外调查发现,与桉树的共生效应研究很少.为发掘优良的桉树共生真菌资源,本研究通过对桉树根系真菌侵染率的测定和真菌的分离鉴定,将真菌回接桉树,经柯赫氏法则(K o c h＇sR u l e)确定桉树共生真菌,为进一步研究共生真菌促进桉树生长㊁增加磷素营养吸收的机制,以及应用共生真菌提高桉树造林成活率㊁生物量和木材产量提供科学依据.１㊀材料和方法１．１㊀样品采集尾叶桉㊁窿缘桉(E u c a l y p t u s e x s e r t a)和尾巨桉(E．u r o p h y l l aˑE．g r a n d i s)采自华南农业大学树木园和增城教学科研基地,位于N２３ʎ０９ᶄ１０ᵡ~２３ʎ１４ᶄ２２ᵡ,E１１３ʎ２０ᶄ２２ᵡ~１１３ʎ３７ᶄ５６ᵡ,属于亚热带季风气候和亚热带海洋性气候,土壤为赤红壤.２０１７年１１月采集样品,在树冠的投影区内取３０~４０c m范围内土层的树木侧根作为根样,将根上的大块泥土轻轻抖掉,其余泥土连同根系一起装入密封袋中,同种桉树放入同一密封袋中,封口标记.根样带回实验室后,一部分用于立即观察根系的形态结构和共生真菌的分离,另一部分用于侵染率的测定.１．２㊀试验方法１．２．１㊀共生真菌的侵染率统计㊀将采集的根样冲洗干净,采用透明压片法对根系进行透明㊁酸化㊁台盼蓝染色和脱色后,在显微镜下统计菌根侵染情况[１３],参照T r o u v e l o t等[１４]的方法统计AM真菌和E C M真菌的侵染率及侵染强度.１．２．２㊀共生真菌的分离培养㊀采用组织分离法分离真菌.将根系洗去泥土,剪成１~２c m根段,在体式显微镜下找出带有共生真菌结构的根尖,经３％次氯酸钠表面消毒２~３m i n,无菌水中冲洗后,剪成０．５~１c m的根段,置入P D A培养基内,２５ħ恒温倒置培养[５].待培养基内长出菌丝后进行纯化,经过纯化后的菌株一部分进行插片培养[１５],待菌丝长到玻片中部,用于真菌的形态学鉴定.另一部分纯化菌株接种到P D A斜面,４ħ冰箱保存,用于分子鉴定.１．２．３㊀真菌的形态学鉴定㊀观察菌落的表面特征㊁形状㊁颜色㊁大小㊁光滑度等菌落特征,记录其生长状况.显微镜下观察菌丝的颜色㊁是否分隔㊁分枝情况;观察分生孢子的形状㊁颜色㊁大小㊁细胞壁特征㊁有无子囊(担子)及子囊孢子(担孢子)等特征.根据真菌分类文献,并参阅近几年有关真菌鉴定的文献对分离菌株进行形态学鉴定[１６Ｇ１８].４５５１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷１．２．４㊀真菌的分子生物学鉴定㊀将纯化的真菌在２５ħ培养２周后,收集新鲜菌丝进行I T S 序列分析.参照Z h o u 等[１９]研究方法,采用真菌D N A 微量提取试剂盒(O m e ga 公司,D ３１９５Ｇ０１)提取D N A .I T S 序列扩增引物选择真菌I T S 区通用引物I T S １ＧF 和I T S ４(I T S １ＧF :C T TG G T C A T T T A G A G ＧG A A G T A A ;I T S ４:T C C T C C G C T T A T T G A T A T ＧG C )[２０],由生工生物技术有限公司合成.通过P C R 反应扩增真菌I T Sr D N A 基因.反应体系２０μL [１０μL P r e m i x T a p (S a n go n B i o Ｇt e c h )㊁０．５μL I T S ４㊁０．５μL I F S １ＧF ㊁１μLP C R 产物和８μLd d H ２O ].反应条件为９５ħ预变性３m i n;９４ħ变性３０s ,５５ħ退火２５s ,７２ħ延伸１m i n ,３５个循环;最终７２ħ延伸５m i n .P C R 产物进行１％琼脂糖凝胶电泳(１００V ,４０m i n ),采用胶回收试剂盒(OM E G A 公司,D ２５００)进行P C R 产物回收.回收产物采用T a K a R a 公司p M D １８ＧT 试剂盒进行T /A 连接并克隆转化.连接反应体系５μL (２μL pM D １８ＧT ㊁０．５μLI n s e r tD N A 和２．５μLS o l u t i o n Ⅰ),３７ħ培养过夜,送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序.将真菌测序所得的I T S 序列在N C B I 中运用B L A S T 工具进行比对分析,并从NC B I 中下载已知同源序列,用软件M E G A (V e r s i o n５．１)进行比对,用N e i g h b o r ＧJ o i n i n g 法构建系统发育树.使用M a x i m u m C o m po s i t e L i k e l i h o o d 方法计算B o o t Ｇs t r a p 值,估测系统发育树的置信度.１．２．５㊀共生真菌的回接㊀将沙子㊁蛭石(体积比为１ʒ１)在１２１ħ灭菌６０m i n ,装满体积为０．３L 的花盆中,参考刘茂军等[２１]的方法并做适当修改,将分离出的共生真菌回接到巨桉组培苗(来自中国林业科学研究院热带林业研究所),每株接种２０个直径５m m 的菌饼,每组３个重复.将接种好的植株套袋,在组培室内培养(温度２５ħ,湿度６０％,光强５０００L u x ),半个月后取下套袋;定期浇水,２个月后,收获接种苗,检测根系共生真菌的定殖情况并测定侵染率.２㊀结果与分析２．１㊀共生真菌侵染率统计观察到尾叶桉㊁窿缘桉和尾巨桉均能被菌根真菌侵染,其中窿缘桉的AM 真菌侵染率最高,达到５８．７５％,侵染强度１４．５４％;其次是尾巨桉,AM 真菌侵染率为５１．３３％,侵染强度１５．７４％;尾叶桉最低,侵染率为４８．６７％,侵染强度为１１．０３％(表１).与AM 真菌侵染率相比,E C M 真菌的侵染率相对较低,尾叶桉㊁尾巨桉和窿缘桉３种桉树的E C M 真菌侵染率依次为１１．０３％㊁１３．０２％和１５．００％,侵染强度为１．６４％㊁１．６０％和０．８１％(表１).经方差分析,尾叶桉㊁窿缘桉和尾巨桉３种桉树AM 真菌总侵染率差异不显著(P ＞０．０５),E C M 真菌总侵染率差异也不显著(P ＞０．０５).对３种桉树共生真菌侵染特征观察,发现尾叶桉(图１,A~C )和尾巨桉(图１,D~F )都同时具有AM 真菌结构㊁E C M 真菌结构和D S E 结构,窿缘桉具有AM 真菌结构(图１,G )和E C M 真菌结构(图１,H ㊁I ).３种桉树的AM 真菌结构和E C M 真菌结构都比较明显,典型的深色有隔内生真菌结构在尾叶桉和尾巨桉都有观察到.尾叶桉㊁窿缘桉和尾巨桉３种桉树根尖均存在外生菌根的菌套结构(图２).但３种桉树的外生菌根形态不同,其中尾巨桉为单轴分枝状(图２,A ),窿缘桉为单轴分枝和二叉分枝(图２,B ㊁C ),尾叶桉的菌根形态呈二叉分枝状(图２,D~F ).外生菌根的菌根形态特征是鉴定外生菌根真菌的依据之一,说明外界自然环境下,本研究采样点的尾巨桉和尾叶桉分别与１种外生菌根真菌形成菌根,窿缘桉与２种外生菌根真菌形成菌根.表１㊀桉树根系菌根真菌侵染状况T a b l e １㊀T h e c o l o n i z a t i o n s t a t u s o fm y c o r r h i z a l f u n g i i n E u c a l y pt u s r o o t s 宿主植物H o s t s pe c i e s AM 真菌AMf u n gi E C M 真菌E C Mf u n gi 侵染率F u n ga l c o l o n i z a t i o n /％侵染强度C o l o n i z a t i o ni n t e n s i t y /％侵染率F u n ga l c o l o n i z a t i o n /％侵染强度C o l o n i z a t i o ni n t e n s i t y /％尾叶桉E u c a l y p t u s u r o p h y l l a ４８．６７ʃ９．８７１１．０３ʃ４．４１１４．００ʃ２．６５１．６４ʃ０．８１窿缘桉E u c a l y pt u s e x s e r t a ５８．７５ʃ１３．１５１４．５４ʃ１１．５２１５．００ʃ０．０００．８１ʃ０．６７尾巨桉E ．u r o p h y l l a ˑE ．gr a n d i s ５１．３３ʃ１．１５１５．７４ʃ４．５２１３．０２ʃ１．７５１．６０ʃ０．４９５５５１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王思佳,等:桉树根系共生真菌的分离与鉴定A~C ．尾叶桉;D ~F ．尾巨桉;G~I ．窿缘桉;a ．菌套结构;b ．深色有隔内生真菌;c ．根内菌丝;d ．丛枝结构;e ．泡囊;f ．根外菌丝图１㊀桉树根系中的菌丝结构A－C ．E u c a l y p t u s u r o p h y l l a ;D－F ．E ．u r o p h y l l a ˑE ．g r a n d i s ;G－I ．E u c a l y pt u s e x s e r t a ;a ．M a n t l e ;b ．D a r k s e p t a t e e n d o p h y t e s ;c ．I n t e r n a l h y p h a e ;d ．A r b u s c u l e ;e ．V e s i c l e ;f ．E x t e r n a l h y ph a e F i g ．１㊀M y c e l i u ms t r u c t u r e i n E u c a l y pt u s r o o ts 图２㊀桉树根系外生菌根真菌的形态结构F i g ．２㊀E c t o m y c o r r h i z a s i n E u c a l y pt u s r o o t s ２．２㊀桉树共生真菌的形态特征从３种桉树根系共分离出６株共生真菌,标记为WY １㊁WY ３㊁WY ９㊁L Y １㊁W J １㊁W J ５.在P D A 培养基上培养２０d ,形成的菌落颜色呈白色㊁淡黄色或者深灰色;形状为圆形或椭圆形;菌丝致密或稀疏(图３);其中WY １生长速度最快,２５ħ恒温培养２０d 菌落直径为９c m ,最快长满平板;其次为WY ３㊁W J ５和L Y １,菌落直径分别为８．５c m ㊁８．６c m 和９c m ;WY ９和W J １则生长比较缓慢,菌落直径为５．４c m 和４．４c m .插片培养的盖玻片置于载玻片上,显微镜观察的菌丝形态(图４),菌落特征和形态特征描述见表２.从P D A 培养基的菌落特征(图３)以及显微镜下的菌丝形态观察(图４),可以看出W J ５㊁WY ３㊁WY ９和L Y １的菌落颜色呈深色,菌丝有隔,都具有典型的深色有隔内生真菌的特征,初步推断为D SE .而WY １和W J １的菌落呈白色,菌丝无色,推测属于担子菌亚门(B a s i d i o m yc o t i n a ).参照真菌形态和分类描述的特征,鉴定出WY ３为茎点霉属(P h o m a s p ．),WY ９为镰刀霉属(F u s a r i u m s p．),６５５１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷A．WY １;B ．WY ３;C ．WY ９;D ．W J １;E ．W J ５;F ．L Y １图３㊀分离菌株在P D A 培养基上生长２０d 后的菌落形态F i g ．３㊀T h e i s o l a t e d f u n g u s c o l o n i e s o nP D A m e d i u ma f t e r ２０d a ys A．WY １;B ．WY ３;C ~D ．W J ５;E ~G．L Y １;H．W J １;I ．WY ９图４㊀分离的真菌的菌丝和孢子形态F i g ．４㊀T h em y c e l i u ma n d s p o r em o r p h o l o g y o f i s o l a t e d f u n gi L Y １为拟盘多毛孢属(P e s t a l o t i o ps i s ),WY １为小皮伞属(M a r a s m i u s s p ．),W J １为裸脚伞属(G ym Ｇn o p u s s p ．),W J ５为伞状霉属(U m b e l o ps i s s p ．).２．３㊀共生真菌的分子鉴定提取根系共生真菌D N A 后,利用引物I T S １ＧF和I T S ４,对提取的D N A 菌液进行P C R 扩增,在凝胶成像系统中看到清晰的条带(图５).将真菌测序所得的I T S 序列提交到G e n B a n k 数据库后,在线运用B L A S T 工具进行比对,结果显示:WY １和W J １与G e n B a n k 中的J N ９４３６０１．１和M F １００９８８．１菌株有９５％以上的相似度,结合形态特征确定它们为担子菌亚门中不同属的２种外生菌根真菌,分别为三色小皮伞菌(M ．t r i c o l o r )和黑柄裸脚伞(G ．m e l a n Ｇo pu s );WY ３㊁WY ９㊁W J ５和L Y １分别与G e n B a n k 中茎点霉属㊁镰刀霉属㊁二型伞霉(U ．d i m o r p h a )和芒弗里亚拟盘多毛孢(P ．m a n g i f o l i a )有９４％以上的相似度(表３).将真菌测序所得的I T S 序列提交到G e n B a n k数据库,运用B L A S T 工具进行比对,并从N C B I 下载G e n B a n k 数据库内已知同源序列,用软件M E G A (V e r s i o n５．１)进行对比分析,用N e i gh b o r ＧJ o i n i n g 法构建系统发育树(图６),可以看到,６株真菌(红色ʀ标出)分为３个类群,隶属于担子菌亚门㊁接合菌亚门(Z y g o m yc o t i n a )和半知菌亚门(D e u Ｇt e r o m y c o t i n a ).其中担子菌亚门单独成一类群,包括WY １和W J １;接合菌亚门包括W J ５;WY ３㊁WY ９７５５１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王思佳,等:桉树根系共生真菌的分离与鉴定表２㊀真菌菌落特征和形态特征T a b l e ２㊀T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f c o l o n i e s a n dm o r p h o l o g y菌株编号S t r a i nN o ．菌落特征C h a r a c t e r o f c o l o n i e s培养２０d 后菌落直径２０d a y s o l d c o l o n y of i s o l a t e d f u n gi /c m 形态特征C h a r a c t e r o fm y c e l i u ma n d s po r e WY １菌落呈白色,绒毛状,生长速度快,菌落环纹不明显T h e c o l o n y w a sw h i t ea n dv i l l o u s ．I t g r e w f a s t a n d t h e c o l o n y r i n g sw e r e n o t o b v i o u s ９．０菌丝无色,无隔,直径约３μm ;孢子无色或近无色T h em y c e l i u m w a s c o l o r l e s s a n d a s e p t a t e ．T h e d i Ｇa m e t e r w a s a b o u t ３μm ;T h e s p o r e s w e r e n e a r l y c o l o r l e s s WY ３菌落呈黄棕色,细绒状,生长速度较快,菌落环纹均匀T h ec o l o n y w a s y e l l o w Ｇb r o w na n dv i l l o u s ．I t g r e w al i t t l ef a s ta n dt h ec o l o n y r i n g s w e r e u n i f o r m８．５菌丝通直,深色有隔,直径２~４μm ;孢子小,近球形T h em y c e l i u m w a s s t r a i g h tw i t hd a r ks e p t a ．T h e d i a m e t e rw a sa b o u t２－４μm ;T h es p o r e s w e r e s m a l l a n dn e a r l y s p h e r i c a l WY ９菌落呈淡黄棕色,绒毛状,生长速度缓慢,菌落环纹不明显T h ec o l o n y w a s y e l l o w Ｇb r o w na n dv i l l o u s ．I t g r e ws l o w l y a n d t h e c o l o n y r i n g sw e r e n o t o b v i o u s ５．４菌丝细长而直,深色有隔,分枝,直径３~４μm ;分生孢子镰刀形或者梭形T h em y c e l i u m w a ss t r a i g h t w i t hd a r ks e p t aa n d b r a n c h e s ．T h e d i a m e t e rw a s a b o u t ３－４μm ;T h e s p o r e sw e r e s i c k l e o r s pi n d l e W J １菌落白色,细绒状,生长速度缓慢,菌落环纹不明显T h ec o l o n y w a s w h i t ea n d v i l l o u s ．I t g r e w s l o w l y a n d t h e c o l o n y r i n gsw e r e n o t o b v i o u s ４．４菌丝白色,直径２~３μm ;未见孢子T h em y c e l i u m w a sw h i t e a n d t h ed i a m e t e rw a s a Ｇb o u t ２－３μm ;T h e s po r e sw e r e n o t f o u n d W J ５菌落土黄褐色,菌丝致密,生长速度快,外围菌落环纹明显T h e c o l o n y w a s y e l l o w Ｇb r o w n l i k e s o i lw i t h d e n s em y c e l i u m．I t g r e wf a s t a n dt h eo u t e r c o l o n y r i n g sw e r e o b v i o u s ９．０菌丝深色有隔,直径３~４μm ;孢子圆球形㊁椭圆形或不规则T h em y c e l i u mw a s d a r k a n d s e pt a t e ．T h e d i a m e t e r w a sa b o u t ３－４μm ;T h es p o r e sw e r es ph e r i c a l ,e l l i p t i c a l o r i r r e g u l a r L Y １菌落呈深灰色,有粉状物,菌丝致密,菌落环纹密集T h ec o l o n y w a sd a r k g r a y w i t h p o w d e ra n d d e n s em y c e l i u m．T h e c o l o n y r i n gsw e r e d e n s e ９．０菌丝通直,深色有隔,直径３~５μm ;分生孢子纺锤形或圆球形,多孢T h em y c e l i u m w a s s t r a i g h tw i t hd a r ks e p t a ．T h e d i a m e t e rw a sa b o u t３－５μm ;T h es p o r e s w e r e s p i n d l e o r s ph e r i c a l 表３㊀桉树根系共生真菌r D N AI T S 序列B l a s t 比对结果T a b l e ３㊀B l a s t r e s u l t s o f s y m b i o t i c f u n g u s r D N AI T S i n E u c a l y pt u s r o o t s 菌株编号S t r a i nN o ．G e n B a n k 相似菌株N e a r e s t t y pe s t r a i n 相似菌株G e n B a n k 登录号A c c e s s i o nN o ．相似度I d e n t i t y/％WY １三色小皮伞菌M a r a s m i u s t r i c o l o r三色小皮伞菌M a r a s m i u s t r i c o l o r J N ９４３６０１．１K X ０５８０７０．１９５９５WY ３茎点霉属P h o m a s p ．茎点霉属P h o m a s p ．K F ３６７５４９．１G U １８３１１６．１９８９５WY ９镰刀霉属F u s a r i u m s p ．镰刀霉属F u s a r i u m s p．K U ０５９８４５．１KM ９７９８０４．１９９９９W J １黑柄裸脚伞G y m n o p u sm e l a n o p u s 黑柄裸脚伞G y m n o p u sm e l a n o p u s M F １００９８８．１N R１３７５３９．１９９９９W J ５二型伞霉U m b e l o p s i sd i m o r p h a 伞状霉属U m b e l o ps i s s p ．L C ２０６６６４．１J Q ９１２６７１．１９９９９L Y １芒弗里亚拟盘多毛孢P e s t a l o t i o p s i sm a n g i f o l i a 拟盘多毛孢属P e s t a l o t i o ps i s s p ．K U ２０４６６０．１J Q ９０５６４４．１９４９６图５㊀分离真菌D N A 的P C R 产物１％琼脂凝胶电泳F i g ．５㊀P C R p r o d u c t s o f i s o l a t e d f u n g i o n１％a ga r g e l e l e c t r o ph o r e s i s 和L Y １同属半知菌亚门,其中L Y １和WY ９有极高的相似度.综合形态特征和I T S 序列分析,确定６种真菌隶属３亚门５目６科６属.其中,半知菌亚门㊁瘤座孢菌目(T u b e r c u l a r i a l e s )㊁瘤座孢菌科(T u b e r c u l a r i a c e a e )㊁镰刀霉属,分离自尾叶桉;球壳孢目(S p h a e r o p s i d a l e s )㊁球壳孢科(S ph a e r i o i d a c e a e )㊁茎点霉属,分离自尾叶桉;黑盘孢菌目(M e l a n c o n i a l e s )㊁黑盘孢菌科(M e l Ｇa n c o n i a c e a e)㊁拟盘多毛孢属㊁芒弗里亚拟盘多毛孢,分离自窿缘桉.担子菌亚门㊁伞菌目(A g a r i c a l e s )㊁８５５１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷图６㊀基于１８S r D N AI T S 序列构建的系统发育树F i g ．６㊀N e i g h b o r Ｇj o i n i n gp h y l o g e n e t i c t r e eb a s e do n１８S r D N AI T Ss e qu e n c es A~B ．三色小皮伞菌;C ~D ．芒弗里亚拟盘多毛孢;E ~F ．二型伞霉;G．镰刀霉属;H．黑柄裸脚伞;I ．茎点霉属a ．根外菌丝;b ．深色有隔内生真菌;c ．微菌核;d ．根内菌丝图７㊀分离的真菌在回接根系上形成的菌丝结构A－B ．M ．t r i c o l o r ;C －D ．P ．m a n g i f o l i a ;E －F ．U ．d i m o r p h a ;G．F u s a r i u m s p ．;H．G ．m e l a n o pu s ;I ．P h o m a s p ．a ．E x t e r n a l h y p h a e ;b ．D a r ks e p t a t e e n d o p h y t e s ;c ．M i c r o s c l e r o t i a ;d ．I n t e r n a l h y ph a e F i g ．７㊀M y c e l i u ms t r u c t u r e s o f i s o l a t e d f u n g i f o r m e d i n r e Ｇi n o c u l a t e d r o o t s a f t e r ６０d a ys A~D ．三色小皮伞菌;E ㊁F ．黑柄裸脚伞图８㊀回接根系上的外生菌根形态A－D ．M ．t r i c o l o r ;E －F ．G ．m e l a n o pu s F i g ．８㊀E c t o m y c o r r h i z a s f o r m e d i n r e Ｇi n o c u l a t e d r o o t s o f E u c a l y pt u s a f t e r ６０d a y s ９５５１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王思佳,等:桉树根系共生真菌的分离与鉴定小皮伞科(M a r a s m i a c e a e)㊁裸脚伞属㊁黑柄裸脚伞,分离自尾巨桉;白蘑科(T r i c h o l o m a t a c e a e),小皮伞属㊁三色小皮伞菌,分离自尾叶桉.接合菌亚门㊁毛霉目(M u c o r a l e s)㊁伞状霉科(M u c o r a c e a e)㊁伞状霉属㊁二型伞霉,分离自尾巨桉.２．４㊀真菌回接桉树的侵染效应２．４．１㊀真菌与桉树共生效应㊀６种真菌回接巨桉组培苗后菌丝侵染情况显示,茎点霉属㊁镰刀霉属㊁二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢４种真菌形成深色有隔菌丝和微菌核(m i c r o s c l e r o t i a)结构(图７),推测它们为D S E,微菌核丰富度分别为４６．８％㊁４２．３％㊁５６．７％和６２．３％.三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞２种真菌形成外生菌丝及菌套结构,确定为桉树外生菌根真菌(图８).２．４．２㊀回接后侵染率统计㊀６种真菌回接无菌巨桉组培苗,测定侵染率发现,６种真菌均能在巨桉根内侵染,其中茎点霉属的侵染率最高(５２．２％),其次为黑柄裸脚伞(侵染率为４５．３％),三色小皮伞菌㊁镰刀霉属㊁二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢的侵染率分别为３０％㊁３２．２％㊁３３．２％和２２．１％.３㊀讨㊀论桉树是典型的既可以形成丛枝菌根(AM),又可以形成外生菌根(E C M)的树种[５],甚至外生菌根㊁丛枝菌根和两者混合菌根同时存在[２２],本研究在尾叶桉㊁窿缘桉和尾巨桉３种桉树除了观察到有E C M结构和AM真菌结构,同时,在尾叶桉和尾巨桉中还观察到典型的深色有隔内生真菌结构,说明桉树菌根真菌具有多样性,不仅是前人报道的可以与AM真菌㊁E C M真菌形成混合菌根,还可以和D S E形成共生体系.本研究在桉树根系中首次报道２种E C M真菌,三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞.弓明钦等[２３]对华南地区桉树E C M真菌的调查发现１１种,优势菌为多根硬皮马勃(S c l e r o d e r m a p o l y r h i z u m P e r s);朱天辉等[１１]和梁洪萍[１２]分别发现四川桉树有１７种E C M真菌,都与本次分离到的２种E C M真菌不同,不同树种㊁不同生态环境会影响菌根真菌的种类和多样性.三色小皮伞菌具有产漆酶的特性,漆酶属于木质素降解酶类,可参与植物细胞壁的形成,还可去木质素,在环境修复㊁农业生产等领域用途广泛[２４];黑柄裸脚伞为中国新纪录种[２５],其生物学特性有待进一步研究.在桉树根系中分离得到４种内生真菌,回接后均观察到D S E典型的深色有隔菌丝和微菌核结构,推测它们为桉树根系中的D S E,有待于进一步的研究.茎点霉属㊁拟盘多毛孢属和镰刀霉属是桉树中具有一定抗菌作用的内生真菌[２６],谢玲等[２７]在甘蔗(S a c c h a r u mo f f i c i n a r u m)根围发现深色有隔内生真菌茎点霉属,韦继光[２８]从南山茶(C a m e l l i a s e m i s e r r a t a)和短叶罗汉松(P o d o c a r p u sm a c o rＧp h y l l u s)中分离出芒弗里亚拟盘多毛孢;格希格图等[２９]在桉树根系中发现镰刀菌(F u s a r i u m)的存在,徐超等[３０]发现二型伞霉可提高铁皮石斛生长速度和增强抗旱能力.参考文献:[１]㊀任忠秀,包雪梅,于家伊,等．中国桉树人工林施肥现状㊁存在问题及对策[J]．桉树科技,２０１３,３０(４):５２Ｇ５９．R E NZX,B A O X M,Y UJY,e t a l．C u r r e n t s t a t u s,p r o bＧl e m sa n dc o u n t e r m e a s u r e so f E u c a l y p t u s p l a n t a t i o nf e r t i l i z aＧt i o n p r a c t i c e s i nC h i n a[J]．E u c a l y p t S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y,２０１３,３０(４):５２Ｇ５９．[２]㊀苏英吾,李向阳．华南土壤肥力特征与桉树施肥[J]．中南林业调查规划,１９９７,(３):３５Ｇ３８．S U Y W,L IXY．C h a r a c t e r i s t i c s o f 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p t a t e f u n g i i n a q u a t i cm a cＧr o p h y t e s i n a t r o p i c a l r i v e rＧf l o o d p l a i n s y s t e m[J]．A q u a t i c B o tＧa n y,２００９,９１:１３Ｇ１９．[７]㊀WU LQ,LÜYL,M E N GZX,e t a l．T h e p r o m o t i n g r o l e o f０６５１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷a n i s o l a t eo fd a r kＧs e p t a t ef u n g u so ni t sh o s t p l a n t S a u s s u r e a i n v o l u c r a t a K a r．e t K i r[J]．M y c o r r h i z a,２０１０,２０(２):１２７Ｇ１３５．[８]㊀胡玉金,高春梅,刘杏忠,等．保护地黄瓜根内和土壤中丛枝菌根真菌和深色有隔内生真菌多样性研究[J]．菌物学报,２０１７,３６(２):１６４Ｇ１７６．HU YJ,G A OC M,L I U XZ,e t a l．D i v e r s i t y o f a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g ia n dd a r ks e p t a t ee n d o p h y t e s i nt h e g r e e nＧh o u s ec u c u m b e rr o o t sa n ds o i l[J]．M y c o s y s t e m a,２０１７,３６(２):１６４Ｇ１７６．[９]㊀MA L A J C Z U K N,G A R B A Y EJ．I n f e c t i v i t y o f P i n e a n d E uＧc a l y p t i s o l a t e s o f P i s o l i t h u s t i n c t o r i u s o nr o o t so f E u c a l y p t u su r o p h y l l a i nv i t r o．１．m y c o r r h i z a f o r m a t i o n i nm o d e l s y s t e m s [J]．N e wP h y t o l o g i s t,１９９０,１１４:６２７Ｇ６３１．[１０]㊀弓明钦,陈㊀羽,王凤珍,等．外生菌根对桉树青枯病的防治效应[J]．林业科学研究,１９９９,１２(４):３３９Ｇ３４５．G O N G M Q,C H E N Y,WA N G F Z,e ta l．T h ec o n t r o le f f e c t o f e c t o m y c o r r h i z a l f u n g i o n P s e u d o m o n a s s o l a n a c e a r u mo f E u c a l y p t u s[J]．F o r e s t R e s e a r c h,１９９９,１２(４):３３９Ｇ３４５．[１１]㊀朱天辉,张㊀健,胡庭兴,等．四川桉树外生菌根真菌的研究[J]．四川农业大学学报,２００１,１９(２):１３７Ｇ１４０．Z HU T H,Z H A N GJ,HU TX,e t a l．S t u d y o n e c t o m y c o rＧr h i z a l f u n g i o f E u c a l y p t[J]．J o u r n a l o f S i c h u a nA g r i c u l t u rＧa lU n i v e r s i t y,２００１,１９(２):１３７Ｇ１４０．[１２]㊀梁洪萍．四川巨桉外生菌根研究[D]．四川雅安:四川农业大学,２０１０．[１３]㊀P H I L L I P SJ M,H A YMA N D S．I m p r o v e d p r o c e d u r e s f o rc l e a r i n g a nd s t a i n i n g p a r a s i t i c a n d ve s i c u l a rＧa r b u s c u l a rm y c o rＧr h i z a l f u n g i f o rr a p i da s s e s s m e n to f i n f e c t i o n[J]．T r a n s a cＧt i o n s o f t h eB r i t i s hM y c o l o g i c a l S o c i e t y,１９７０,５５:１５８Ｇ１６１．[１４]㊀T R O U V E L O T A,K O U G HJL,G I A N I N A Z Z IＧP E A R S O N V．M e s u r e d u t a u xd em y c o r h i z a t i o nV Ad u n s y s t e m e r a d i cＧu l a i r e．R e c h e r c h e d em e t h o d e s d e s t i m a t i o n a y a n t u n e s i g n i f iＧc a t i o n f o n c t i o n n e l l e[M]．P h y s i o l o g i c a l a n dG e n e t i c a lA s p e c t so fM y c o r r h i z a e．P a r i s,F r a n c e:I N R A,１９８６:２１７Ｇ２２１．[１５]㊀杨㊀勇．放线菌气生菌丝插片培养方法[J]．生物学通报,１９８７,(１１):４１,２７．Y A N G Y,C u l t i v a t i o nm e t h o d o f a e r i a l h y p h a e o f a c t i n o m y c eＧt e s[J]．B u l l e t i n o f B i o l o g y,１９８７,(１１):２９,４３．[１６]㊀戴芳澜．真菌的形态和分类[M]．北京:科学出版社,１９８７．[１７]㊀魏景超．真菌鉴定手册[M]．上海:上海科学技术出版社,１９７９．[１８]㊀邵力平,沈瑞祥,张素轩,等．真菌分类学[M]．北京:中国林业出版社,１９８３．[１９]㊀Z H O UJ Z,B R U N SM A,T I E D J E JM．D N Ar e c o v e r y f r o m s o i l s o f d i v e r s e c o m p o s i t i o n[J]．A p p l i e da n dE n v i r o n m e n t a lM i c r o b i o l o g y,１９９６,６２(２):３２１６Ｇ３２２１．[２０]㊀WH I T ETJ,B R U N ST,L E ES,e t a l．A m p l i f i c a t i o n a n d d iＧr e c t s e q u e n c i n g o f f u n g a l r i b o s o m a lR N A g e n e s f o r p h y l o g eＧn e t i c s[J]．P C RP r o t o c o l s:A g u i d e t oM e t h o d s a n dA p p l i c aＧt i o n s,１９９０,１８:３１５Ｇ３２２．[２１]㊀刘茂军,李㊀涛,赵之伟．一种快速建立D S E与植物共生培养体系的方法及其应用,C N１０１２６３７７８A[P]．２００８．[２２]㊀朱天辉,张㊀健,胡庭兴,等．四川桉树菌根类型及林分密度对菌根真菌的影响[J]．四川农业大学学报,２００１,１９(３):２２２Ｇ２２４．Z HU T H,Z H A N GJ,HU TX,e t a l．E f f e c t s o fm y c o r r h iＧz a t y p e s a n d s t a n d d e n s i t y o nm y c o r r h i z a l f u n g i o f E u c a l y p t u si nS i c h u a n[J]．J o u r n a l o f S i c h u a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,２００１,１９(３):２２２Ｇ２２４．[２３]㊀弓明钦,陈㊀羽．华南地区松㊁桉树种外生菌根调查[J]．林业科学研究,１９９１,(３):３２３Ｇ３２７．G O N G M Q,C H E N Y．I n v e s t i g a t i o no f e c t o m y c o r r h i z a s p eＧc i e s o f P i n e a nd E u c a l y p t u s i nS o u t hC h i n a[J]．F o re s tR eＧs e a r c h,１９９１,(３):３２３Ｇ３２７．[２４]㊀芦光新,陈秀蓉,王军邦,等．高寒草地土壤三色小皮伞菌产漆酶特性的研究[J]．草地学报,２０１４,２２(５):１０８０Ｇ１０８５．L U G X,C H E NXR,WA N GJB,e t a l．P r o d u c i n g l a c c a s eＧc h a r a c t e r i s t i c s o f M a r e s m i u s t r i c o l o r i s o l a t ed f r o mt he s o i l o fa l p i n em e a d o w[J]．A c t a A g r e s t i a S i n i c a,２０１４,２２(５):１０８０Ｇ１０８５．[２５]㊀邓树方．中国南方裸脚伞属分类暨小皮伞科真菌资源初步研究[D]．广州:华南农业大学,２０１６．[２６]㊀单体江,王小晴,毛子翎,等．桉树内生真菌及其抗菌活性最新进展[C]//中国植物保护学会第十二次全国会员代表大会暨学术年会,２０１７．[２７]㊀谢㊀玲,刘㊀斌,覃丽萍,等．甘蔗根围深色有隔内生真菌(D S E)的分离及接种效应[J]．西南农业学报,２０１４,２７(２):６３５Ｇ６４０．X I EL,L I U B,Q I N L P,e t a l．I s o l a t i o na n di n o c u l a t i o ne f f e c t o f d a r k s e p t a t e e n d o p h y t e s(D S E)f r o ms u g a r c a n e r h iＧz o s p h e r e[J]．S o u t h w e s t C h i n aJ o u r n a l o f A g r i c u l t u r a lS c iＧe n c e,２０１４,２７(２):６３５Ｇ６４０．[２８]㊀韦继光．罗汉松科㊁山茶科和红豆杉科植物内生拟盘多毛孢的多样性及拟盘多毛孢属分子系统学研究[D]．杭州:浙江大学,２００４．[２９]㊀格希格图,胡鸢雷,慈忠玲,等．桉树根部内生菌与青枯病相关关系研究[J]．林业科技通讯,２００９,(８):４２Ｇ４３．G EXGT,HU YL,C I ZL,e t a l．S t u d y o n t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e ne n d o p h y t e a n d P s e u d o m o n a s s o l a n ac e a r u m i n E u c aＧl y p t u s R o o t[J]．J o u r n a l o f F o r e s t r y S c i e n c ea n dT e c h n o l oＧg y,２００９,(８):４２Ｇ４３．[３０]㊀徐㊀超,史㊀俊,席刚俊,等．一种二型伞霉及其在铁皮石斛促生与抗旱中的应用,C N１０４１９５０５４B[P]．２０１６．(编辑:潘新社)㊀㊀１６５１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王思佳,等:桉树根系共生真菌的分离与鉴定。