琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳步骤

实验前准备及注意事项：

将所要用到的制胶锥形瓶、胶槽、梳齿等物品清理干净，如有残胶，需将残胶尽量去除。

注意：所有用来跑核酸胶的物品，只要接触过核酸染料，一定要专门放置，专物专用，不要再将污染过的物品随意放置，以免污染其他物品。接触过核酸染料的手套不要再碰非污染区的物品。制胶和拿取核酸胶时佩戴一次性PE手套，再操作其他地方时将一次性手套丢弃。

实验步骤：

1.按每100ml 1×TAE/TBE缓冲液中加入1g琼脂糖（1%的胶，根据核酸大小选择制胶的浓度，一般情况用1%-2%的胶）的比例，称取琼脂糖，加入专门制琼脂糖凝胶的250ml-500ml的锥形瓶中。

2.按比例量取适量的1×TAE/TBE缓冲液，加入到锥形瓶中的琼脂糖一起，适当摇晃锥形瓶初步混匀。

3.将混合液放入微波炉中，用中高火加热，加热总时间可根据制胶总量调整，一般40ml左右的胶量加热90s左右。如果制胶量大，记得每加热1min左右将瓶从微波炉中取出，轻轻晃匀后，再继续加热，以免局部过热导致胶溢出。

注意：取出加热后的瓶时，记得垫上纸，防止烫手！

4.待胶加热好，完全溶解后，稍晾凉至45-55℃左右（以基本不太烫手为宜）按照1:10000的比例加入核酸染料（如100ml胶加10ul染料），迅速摇匀。

5.将胶槽和梳齿准备好，梳齿可以预先插好，将上一步摇匀的胶倒入胶槽中，一般厚度以60mm左右为宜，具体要根据梳齿的厚度以及样品量来定。

6.待胶变白，基本表示胶已凝好，此时可以将梳齿拔出，一定要竖着往上拔梳齿，不要摇晃，以免样品孔被破坏。

7.在电泳槽中倒入1×TAE/TBE缓冲液，将制好的胶放入缓冲液，以缓冲液没过样品孔为宜。

8.点样：根据样品孔的大小决定上样量，每一排样品孔至少有一个孔用来点DNA

Marker。（上样前确定每个样品和Marker里都已经加了Loading buffer，Loading buffer的终浓度为1×）

1 琼脂糖凝胶电泳

1.原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

2操作流程

准备干净的配胶板和电泳槽

琼脂糖凝胶电泳：水平电泳

注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

(1)电泳方法 2 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

(2)凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

琼脂糖凝胶电泳注意事项和常见问题

核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但操作过程中仍有不少要注意的问题。

1 凝胶制作

1．1 凝胶浓度 配制凝胶的浓度据实验需要而变 ，一般在0．8％ ～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g／ml；也可在电泳结束后染色。

1、2 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下：

1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.

2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加

1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.

3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).

4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.

(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20

min,再用清水漂洗10 min.

(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存

实验原理

闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。

实验材料和试剂

（一）实验样品