微生物与发酵工程实验
济南大学化学与化工学院生物技术系
2007年6月
1 实验一 细菌生长曲线的测定
一、 目的要求
1． 了解比光电比浊计数法原理
2． 学习掌握光电比浊计数法的操作方法
3． 通过细菌光密度的测量，了解细菌生长特征和规律，绘制生长曲线
二、 基本原理
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的通过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池准确测出。测定细菌浊度，光波通常选择400~700nm。光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。
大多数细菌的繁殖速度很快。将一定的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数生长期、稳定期/衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同培养条件下所绘制的生长曲线也不同。测定细菌的生长曲线，了解其生长规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。
三、 试剂和仪器
1． 菌种：放射状土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)
2． 培养基：
蔗糖 2%，酵母膏 0.05%, 尿素0.05%, NaCl 0.01%, K2HPO4 0.5%，(NH4)2SO4 0.02%，MgSO4•7H2O 0.02%, pH 7.0
3． 仪器及其他用具
755型分光光度计，振荡摇床，无菌吸管等。
四、 实验步骤
1． 接种
用接种环接种一环细菌到盛有6ml液体培养基的试管中，30℃120rpm摇床振荡过夜培养。
2． 转接及取样
将上述培养液接种到盛有54ml液体培养基的三角瓶内，30℃120rpm摇床振荡培养，每隔2小时用无菌吸管取样3ml测定比浊。
1 第六章 发酵工程与食品产业
1、发酵工程概述
1.1 发酵的定义
传统发酵用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。
生理学上的发酵指微生物的有氧呼吸和无氧呼吸以外的一种生物氧化作用，通过底物水平磷酸化来获得代谢能ATP，同时将内源的有机化合物还原成发酵产物。
工业上的发酵泛指利用微生物生产有用代谢产物的一种生产方式。
1.2发酵工程的应用范围
1.3发酵工业的发展历史
天然发酵时代
发酵工业第一个转折期：纯培养技术
发酵工业第二个转折期：通风搅拌技术
发酵工业第三个转折期：代谢控制发酵技术
发酵工业第四个转折期：发酵原料的转变
发酵工业第五个转折期：遗传工程技术
1.4 发酵过程的组成部分
2、发酵设备与基本工艺过程
2.1 生物反应器
发酵罐是供微生物在灭菌后的培养基中进行生命活动和代谢的设备。
要求：能够提供微生物生命活动和代谢所要求的条件，并便于操作和控制，保证工艺条件的实现，从而获得高产。
2.1.1厌氧发酵设备
对这类发酵罐的要求：能封闭；能承受一定压力；罐内应尽量减少死角；有冷却设备
2.1.2好氧发酵设备
2.1.2.1机械搅拌式发酵罐
原理：利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促使氧在发酵液中溶解，以保证供给微生物生长繁殖、发酵所需要的氧气。
典型类型：通用式发酵罐和自吸式发酵罐。
1）通用式发酵罐
通用式发酵罐是指既具有机械搅拌，又有压缩空气分布装置的发酵罐。
它是利用机械搅拌器的作用使通入的无菌空气和发酵液充分混合，促使氧在发酵液中溶解，满足微生物生长繁殖和发酵所需要的氧气，同时强化热量的传递。
通用式发酵罐的基本要求：发酵罐罐体各部分的尺寸应具有适宜的比例；发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧；发酵罐应具足够冷却面积；搅拌器的轴封应严密，尽量减少泄漏。
发酵罐的结构：
（1）罐体的尺寸比例
（2）搅拌器
第一章 绪论
传统发酵工程：利用微生物的生长和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程理论与工程技术体系。该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离纯化制备等技术集成。
现代发酵工程：是将DNA重组及细胞融合技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、过程工程优化与放大技术等新技术与传统发酵工程融合，大大提高传统发酵技术水平，拓展传统发酵应用领域和产品范围的一种现代工业生物技术体系（新一代工业生物技术）。
采用现代工程技术手段，利用天然生物体或人工改造的生物体对原料进行加工，为人类生产有用的产品，或直接把生物体应用于工业生产的过程。
发酵工程发展史：
1900以前 自然发酵阶段 ：酿造工业
1900—1940 纯培养技术的建立 : 固体培养基，纯粹培养
1940—1950 通气搅拌纯培养发酵技术的建立 : 丙酮丁醇发酵, 标志：纯种培养深层发酵生产青霉素
1950—1960 诱变技术与代谢控制发酵技术的建立: 耗氧发酵实现规模化纯培养发酵
1960—1970 开拓发酵原料时期（石油发酵时期）
1970年以后 进入基因工程菌发酵时期，以及细胞大规模培养技术的全面发展
发酵工艺过程：
1、 菌种以及确定的种子培养基和发酵培养基的组成
2、 培养基，发酵罐和辅助设备的灭菌
3、 大规模的有活性、纯种的种子培养物的生产
4、 发酵罐中微生物最优的生长条件下产物的大规模生产
5、 产物的提纯、纯化
6、 发酵废液的处理
第二章 微生物菌种制备原理与技术
工业微生物是生物技术产品生产的关键，而菌种又是工业微生物的核心。
发酵工业常用微生物分类：细菌、放线菌、酵母、霉菌
工业微生物获得途径：
1、 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株
2、 由自然界采集样品，从中进行分离筛选
3、 从一些发酵制品中分离目的菌株
第三章 发酵培养基
培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。
作用： 促进产物的形成、满足菌体的生长
发酵培养基的要求:
① 培养基能够满足产物最经济的合成；
② 发酵后所形成的副产物尽可能的少；
③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉，且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应；
④ 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。
培养基的类型及功能
一、按组成物质的纯度
合成培养基 : 所用的原料其化学成分明确、稳定
◆适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作；
◆培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产。
天然培养基: 采用天然原料 ，其成分不那么“纯”
◆发酵培养基普遍使用天然培养基；
◆原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适合于工业化生产；
◆由于其成分复杂，不易重复，如果对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性。
二、按状态
固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。
半固体培养基:琼脂用量为0.5%～0.8% ，主要用于微生物的鉴定。
液体培养基:发酵工业大规模使用的培养基。
三、按用途（从发酵生产应用考虑）
孢子（斜面）培养基:菌体迅速生长，产较多优质孢子，不易引起菌种变异。要求：营养不太丰富、无机盐浓度适量、合适pH和湿度。常用：麸皮培养基、小米、大米、玉米碎屑、琼脂斜面培养基。
种子培养基：孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体。要求：营养丰富完全、最后一级接近发酵培养基。
发酵培养基：供菌体生长、繁殖和合成产物。
发酵培养基的成分及来源
碳源
1、作用
提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分 ；提供合成目的产物所必须的碳成分。
