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和分布情况.阳性细胞以拟标记的细胞为前提,
阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在
抗原所在部位的阳性表达和非目标细胞即使
阳性也不应作为判断依据.根据抗原在细胞中
分布和阳性颗粒沉淀部位可分5种类型：
-
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⑴ 胞膜型 阳性颗粒主要分布于细胞膜表 面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞.此类 型常见于某些膜抗原,如上皮膜抗原（EMA） 、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞 、粒细胞相关抗原（GAA）
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ELISA试验用耗材、试剂及仪器
耗材:移液器、吸头、酶标板、滤纸 试剂:酶标抗体、抗体稀释液、封闭液、底物
溶液、终止液 仪器:酶标仪
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ELISA结果分析
1.根据标准品的含量及检测OD值结果,应用线
性回归方程进行统计分析,可求得待测样品
的定量值
2.上机前将标准品的数量及含量按要求在酶
标仪上进 行设置,机器自动计算打印出标准
c.加入可能含特异性抗原的待检液
d.温育后清洗
e.加入酶标记特异性抗体
f.温育后清洗
g.加入酶作用底物
h.测定颜色反应深浅
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8
竞争法
a、将已知抗体吸附于载体上 b、温育后清洗 c、加入可能含特异性抗原的待检
液和酶标记的已知抗原液 d、温育后清洗 e、加入酶作用底物 f、测定颜色反应深浅
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生物素-亲和素系统
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Ⅰ.ELISA Ⅱ.免疫组化 Ⅲ.荧光抗体标记 Ⅳ.荧光原位杂交（FISH） Ⅴ.分光光度法
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5
Ⅰ.酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应.
酶结合物具有双功能:高度特异的免疫反应、
生物催化放大作用
曲线及各待测样品的定量结果
-
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Ⅱ.免疫组织化学技术
免疫组化是组织化学的一种,是利用已知的
抗体或抗原能特异性结合的特点,通过化学反
应使结合在特异性抗体上显示剂(酶、金属离
子、同位素等)显示一定的颜色,在显微镜下观
察颜色的变化,在抗原抗体结合部位确定组织
、
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1.阳性标记色度特征
免疫组化细胞阳性程度与抗原含量、分布密
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25
3.阳性标记组织学特征
根据免疫组化阳性细胞的组织学特点, 免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下类 型排列:局灶型 弥漫型 片块型 网状型 腺 管型 腔缘型 菊团型
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4.阳性标记强度特征
细胞免疫组化标记的阳性强度根据显 色程度分为弱阳性、阳性和强阳性;也可依 据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为:弱 阳性,阳性细胞≤25%;阳性,阳性细胞25%~ 50%;强阳性,阳性细胞>50%
度、标记方法有关. 一般抗原含量越多、密度
越高、标记方法越敏感,阳性显色则越强.淡黄
色,弱阳性;黄色,阳 性;棕黑色,强阳性 .结果判
断中,后两者有意义,前者除标本处理和方法学
因素外,与细胞轻度异常表达及某些细胞摄取
了周围组织抗原有关 -
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-
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2.阳性标记细胞学特征
免疫组化阳性细胞反映抗原在细胞中的定位
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27
5.非特异着色特征
下面情况可干扰免疫组化结果的观察和判断 ： （1）抗体交叉反应:是由于该抗原决定簇同
时存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在 于星形胶质细胞和唾液腺肌上皮.S-100蛋白 则更为严重,可表达于多种组织细胞.因此应 全面了解和认识该抗体- 的功能和标记范围28
（2）肿瘤细胞异常表达:可选用多种标记证 实或排除,鉴别其真正组织来源或向某一组织 细胞分化 （3）肿瘤细胞吞噬组织抗原:某些恶性肿瘤 细胞摄入周围正常组织细胞成分,虽然后者也 存在某些抗原,但不属于瘤细胞固有成分,胞浆 内抗原定位较模糊,因此应该区别
基本方法:间接法、双抗体夹心法、竞争法、
生物素-亲和素系统
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间接法
a.将已知可溶性抗原吸附于载体 b.温育后清洗 c.加入可能含特异性抗体的待检液 d.温育后清洗 e.加入酶标记的二抗 f.温育后清洗 g.加入酶作用底物 h.测定反应颜色深浅
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双抗体夹心法
a.将已知抗体吸附于载体上
b.温育后清洗
内分布通常为弥漫性或局限性.弥漫性是阳性
颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆,局限性
是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细
胞浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧
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⑷ 微绒毛型 抗原颗粒主要分布于腺癌细
胞的微绒毛,胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表
达.此形最常见于各种腺癌,如甲状腺、乳腺、
胃肠、胆道、卵巢浆液性腺 癌等.特点是阳性
生物素-亲和素系统（biotin-avidin system）
生物素:一种维生素H,经活化后可与抗体、抗原、
酶以多 配一方式共价结合,且不影响它们的活性
亲和素:从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,可与
酶偶合,以一配多的方式对生物素有很强的亲和力
BAS用于检测的基本方法：BAB法或BRAB法/BA
法/ABC法
免疫学实验技术
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1
免疫学技术--抗原抗体反应
可对抗原或
抗体进行定性
、
定量、定位的
检测
影响因素:
电解质、温度
酸碱度
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2
免疫标记技术:
是指用荧光素、放射性同位素、 酶、 发光剂或电子致密物质等作为示踪剂,标 记抗体或抗原进行的抗原抗体反应
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3
特点:高度灵敏、特异、快速, 定性、定量、 定位
分类:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射 免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶 体金技术和发光免疫测定
颗粒靠近腔面,基底部可呈阴性反应.在肿瘤标
记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原
、结肠相关抗原、卵巢癌抗原等,甲状腺腺癌
中甲状腺球蛋白常以该形式出现
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⑸ 复合型 常规免疫组化标记中,同一种 抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞 浆、微绒毛和胞浆,很少发现胞膜和胞核同时 表达.应注意组织标本固定不及时造成抗原移 位
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⑵ 胞核型 阳性颗粒定位于细胞核,呈均匀 分布位于核膜下,有的呈小斑块状不规则分布. 多见增殖细胞核抗原、Ki-67及激素受体中雌 激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和基因 p53等
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⑶ 胞浆型 阳性颗粒主要分布于细胞浆.大
部分抗原均属此型,如细胞角蛋白、波形蛋白
、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶 及前列腺特异性抗原（PSA）等.抗原在胞浆-10源自BAS法与常规酶法-
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ELISA操作注意事项
1.待检样品不应反复冻融 2.加样前充分混匀样品 3.洗板:保证洗涤次数,确保冲洗干净 4.加完终止液在要求时间内上机检测,反 应温度最好在37℃
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ELISA检测标本
1.血清或血浆 2.尿液 3.脑脊液、关节液等体液 4.细胞培养上清等
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