大肠杆菌病的实验室诊断之细菌的动物接种试验.ppt

动物接种实验结果分析
Байду номын сангаас• 结论：
– 试验鸡于接种后第2天死亡，说明该大肠杆菌分离株 具有致病性。
《动物微生物》
综合实训 大肠杆菌病的实验室诊断
实验室诊断结论
实验室诊断结论---大肠杆菌阳性
鉴定结论： 形态学检查、分离培养和生化鉴定的结 果均符合大肠杆菌特性，动物接种试验 显示该细菌分离株有致病性。一系列试 验结果表明送检病料中有致病性大肠杆 菌感染。
大肠杆菌病的实验室诊断
动物接种试验 主讲教师 郭洪梅
实验目标
• 验证大肠杆菌分离株是否有致病性
实验器材
• 大肠杆菌纯培养物 • 1mL注射器 • 碘酊棉球 • 酒精棉球 • 镊子等
动物接种试验方法---腹腔注射
• 助手将鸡保定，使鸡腹部 朝上，酒精棉球消毒进针 部位，使注射针头与皮肤 呈45°角刺入腹腔，拔动 针头活动自由后，注入大 肠杆菌菌液。注射量为 0.5mL/只。
大肠杆菌：+

➢ 原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基 的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细 胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
2021/4/17
三.、实验器材
➢ 菌种：大肠杆菌 DH5ɑ ➢ 培养基：LB固体培养基 ➢ 仪器材料：超净工作台，接种针，酒精灯，
封口 条，记号笔，恒温培养箱。
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灼烧接种环 灼烧接种环 灼烧接种环 灼烧接种环 灼烧接却 冷却
冷却 一区 二区 三区
挑单菌落
划线 （第一区域）
划线 （第二区域）
划线 （第三区域）
划线 （第四区域）
划线 （第五区域）
灼烧接种环
平板倒置培养
六、实验结果
• 次日观察有无单菌落出现，拍照。
培养基灭菌培养基灭菌制作平板制作平板扩大培养扩大培养划线分离划线分离菌种保存菌种保存lb液体培养基lb固体培养基培养皿高压灭超净工作台中将灭菌后冷却到60左右的lb固体培养基倒入灭菌培养皿中敞盖冷却备将大肠杆菌接种到lb液体培养基中于37摇床中震荡培养12h
实验二 LB培养基制备及 大肠杆菌的接种
一、 实验目的
菌。
制作平板 扩大培养 划线分离
菌种保存
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超净工作台中，将灭菌后冷却到60℃左右的LB 固体培养基倒入灭菌培养皿中，敞盖冷却，备 用。
将大肠杆菌接种到LB液体培养基中，于37℃摇 床中震荡培养12h。
以接种环取震荡培养后的菌液，在固体培养基 上划线，封口。培养皿倒置与37℃的恒温培养 箱中培养12~24h，观察划线末端的菌落生长情 况；用接种环挑取单菌落，用划线法接种于斜 面上，在37℃的恒温培养箱中培养24h。
2. 在灼烧接种针之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 3. 在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种针吗？为什么？ 4. 为什么每次划线操作总是从上一次划线的末端开始？

（E.c1/02/01
2
一、形态及染色特性
革兰氏阴性小杆菌，散在或成对，周毛菌，有菌毛。
2021/02/01
3
二、培养特性
1.普通培养基上生长良好，光滑、 湿润、半透明、灰白色菌落；
2. 麦康凯琼脂上形成红色菌落， 伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属 光泽菌落；
3.致病菌株在绵羊血平板上呈β 型溶血；
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三糖铁培养基
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三、抗原及血清型
（一）抗原
1 .菌体抗原（O抗原）：其成分为LPS的多糖侧链。58种，耐
热，1个菌株可含多种，以阿拉伯数字表示。
2. 荚膜抗原（K抗原）：与毒力有关，又称Vi抗原。有的菌株有，
有的菌株无。
3.鞭毛抗原（H抗原）：其成分为蛋白质，不耐热，63种,
分为两相： （1）第1相（特异相）：小写英文字母表示 （2）第2相（非特异相）：阿拉伯数字表示
（一）产肠毒素大肠杆菌（ETEC）
引起人和动物腹泻，主要毒力因子有两类：
1. 黏附素（定居因子）：菌毛，能黏附宿主的小肠上皮
细胞，虽不是直接的致病因子，却是首要的毒力因子。
2. 肠毒素：分泌到胞外的一种蛋白质性毒素。
3. （1）不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin,LT)
4.
对热敏感，可转变成类毒素，具有A和B亚单位。
5. （2）耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin,ST)
6.
耐热，分子量小，无免疫原性。
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（二）产类志贺毒素大肠杆菌（SLTEC）
引起猪水肿病，有两类毒力因子： 1. 黏附性菌毛 2. F18，有助于细菌在肠黏膜上皮细胞定居和繁

培养？
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实验准备（2个样品/组）
培养皿：10套/组 无菌水：10支（9毫升/支） 乳糖胆盐发酵培养基： 100ml 18支试管、5ml/支 伊红美蓝琼脂培养基（EMB）:
200ml 8-10个平板
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下周实验
实验八 化学药剂对微生物生长的影响
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2
完整最新1版100课0 件
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≥24000
10 30
30 70
40 100
40 70 150
70 140 300
150 300 350
360 710 1500
360 370
440 890
470 1500
1200 1300 3800
2100 2300 3800
3800 4400 4700
13000
24000
样品中大肠菌群系以100mL（g）检样内大 肠菌群最大可能数（MPN)表示。
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3
细菌学检验程序
细菌总数
水样稀释或不稀释
倾注平板培养 37 ℃ 24小时
样品
大肠菌群
水样稀释或不稀释
第一步------ 初步发酵试验 （乳糖发酵）
37℃ 24小时
菌落计数 （取平均数报告）
第二步------ 平板分离培养 （转种鉴别培养基） 37℃ 24小时 革兰染色镜检
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8
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置 36℃±1℃温箱内，培养18h—24h，然后取出，观察菌 落形态并做革兰氏染色和证实试验。
4.证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰 氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃的温箱内 培养24h±2h，观察产气情况。

（三）肠致病性大肠杆菌 （Enteropathogenic E.coli,EPEC）
婴幼儿腹泻 致病机制 黏附到小肠上皮细胞，破坏刷状缘，导致邻近微绒 毛破坏，A/E组织病理损伤，引起严重水样腹泻。
Brett Finlay, University of British Columbia
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（四）肠出血性大肠杆菌
菌株 ETEC EIEC EPEC EHEC EAEC
作用部位 小肠 大肠 小肠
疾病与症状
致病机制
旅水低热行样者便，腹恶泻心；，婴呕幼吐儿，腹腹泻痛；，质泌液粒体介和导电LT解和质ST；肠黏毒附素素， 大 量 分
水样便，继以少量血便，腹 质粒介导侵袭和破坏结肠粘膜上皮
痛，发热
细胞
婴儿腹泻；水样便，恶心， 呕吐，发热
37
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（五）抵抗力
•对热的抵抗力较其他肠道杆菌强 •胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用 •对磺胺类、链霉素、氯霉素、庆大霉素等
敏感，但易耐药。
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二、致病性和免疫性
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致病物质
1．黏附素
定植因子抗原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(CFA/Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ) 、集聚黏附菌毛Ⅰ、Ⅲ（AAF/Ⅰ/Ⅲ）、束形成 菌毛(Bfp)、紧密黏附素、P菌毛、Dr菌毛、Ⅰ 型菌毛、侵袭质粒抗原(Ipa)蛋白等。
传染源:牛肉、牛奶是EHEC感染的重要传染源。
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（五）肠集聚型大肠杆菌 （Enteroaggregative E.coli,EAEC）
婴儿、旅行者持续性水样腹泻 致病机制
- 黏附肠细胞表面聚集，形成砖状排列。 - 导致微绒毛变短，单核细胞浸润和出血 - 产生肠毒素
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三、微生物学检查法
6.易变异

56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
大肠杆菌病-动物传染病-课件（PPT精）
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左

1）粘附性菌毛：在1990年Bertsching等首次报道，从 致猪水肿病的大肠杆菌分离出F18，是猪水肿病的 SLTEC菌株的一个重要的毒力因子，它有助于细菌 在猪肠黏膜上皮细胞定居和繁殖。
2）致水肿病2型类志贺毒素 (SLT-2e或SLT-2v)：系引 起猪水肿病的SLTEC所产生的一种蛋白质性细胞毒 素。
兽医生物制品学-分论
大肠杆菌
小组成员：余兆鸿 罗洪瑶 胡国帅 黄荣浩
精选ppt课件
1
第一章 大肠杆菌
大肠杆菌是革兰氏阴性杆菌。
多数是肠道的正常菌群，少数为病原菌。
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2
埃希菌属 （Escherichia)
埃希菌属有5个种，其中最重要的 是大肠埃希菌俗称大肠杆菌（E.coli)， 是最常见的临床分离菌。
高达数万种。
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鞭毛抗原（H） K或Vi抗原 菌体抗原（O）
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12
血清型的表示：
根据对大肠杆菌抗原的鉴定，可用O:K:H排列 表示其血清型（抗原结构式）。
如O8:K23（L）:Hl9，即表示该菌具有O抗原8， L型K抗原23，H抗原为19。对含有蛋白质性黏附 素抗原的菌株，其黏附素抗原应并列K抗原之后。 如O8:K87，K88:Hl9中K88即为黏附素抗原F4。
于断奶后仔猪，生长快，体况健壮的仔猪常见。
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23
羔羊大肠杆菌病
流行特点
主要是通过消化道感染， 其次是通过脐部感染，也有 部分是通过呼吸道感染。
发病特点及临床症状
羔羊发生一种以口鼻流沫、呼吸困难和胸膜肺炎为 主要特征的疾病。发病的羔羊据统计有121只，病羊多为 4～20日龄的羔羊，死亡54只，死亡率约44.6%，病程短， 如不及时治疗，约30min到数小时便死亡。发病的羔羊在 刚开始时体温升高，达41～42℃，精神委顿，食欲不振， 腹部胀气，继之出现呼吸困难，脉搏快而弱，口流白沫， 鼻流黏液，运动失调，卧地磨牙，头弯向一侧，最后在 昏迷中死亡，很少见有腹泻病羔。

04
实验结果与分析
大肠杆菌分离结果
分离方法
通过选择性培养基，如伊红美蓝 培养基，从样品中分离大肠杆菌
。
分离结果
成功分离出若干疑似大肠杆菌的菌 落，菌落呈圆形、湿润、表面光滑 ，呈蓝黑色或深棕色。
分离结论
根据菌落形态和颜色等特征，初步 判断从样品中成功分离出大肠杆菌 。
大肠杆菌纯化结果
纯化方法
采用划线法或稀释法对分离得到 的大肠杆菌进行纯化。
。
兼性厌氧
大肠杆菌既能在有氧条 件下生长，也能在厌氧
条件下生长。
发酵乳糖
大肠杆菌能发酵乳糖并 产生大量酸和气，这一
特性常用于鉴别。
大肠杆菌的分离和纯化原理
选择性培养基
利用大肠杆菌的生物学特性， 选择特定的培养基，如伊红美 蓝培养基，使其与其他菌种区
分。
划线分离法
通过在固体培养基上划线，使 单个菌落得以分离，从而获得 纯培养。
致病性
某些血清型的大肠杆菌可 引起人类腹泻、败血症、 脑膜炎等。
学习并掌握大肠杆菌的分离和纯化技术
分离技术
通过选择性培养基从粪便、食品 、水源等样品中分离出大肠杆菌 。
纯化技术
通过划线分离或液体培养使大肠 杆菌纯化，获得单菌落。
掌握大肠杆菌的鉴定方法
形态学鉴定
观察分离纯化后的大肠杆 菌的革兰氏染色特性和菌 落形态。
THANKS
感谢观看
鉴定结论
根据生化试验和血清学试验结果，可以确定该菌为大肠杆 菌。
05
结论
对实验结果的评价与总结
实验结果准确
01
通过实验，我们成功地分离出了大肠杆菌，并对其进行了纯培
养，证明了实验结果的准确性。

精选ppt课件2021
实验方法 （一）接种肉汤培养基 （二）菌液均匀涂抹平板培养基 （三）分别夹取青霉素、链霉素、庆大
霉素和头孢拉定四种抗生素纸片贴在平 板上进行培养
精选ppt课件2021
实验结果
精选ppt课件2021
● 实验结果
三种菌对链霉素和庆大霉素敏感，但对青霉素和头孢拉定耐药。
精选ppt课件2021
肠杆菌科细菌一般性鉴定程序
菌未 知 肠 杆
分 离 培 养
落挑 取 可 疑 菌
养纯 培
检革 兰 染 色 镜
定生 化 实 验 鉴
药血 敏清 试学 验试
验
精选ppt课件2021
一.分离培养
• 无菌操作用接种环提取可疑肠道杆菌，在EMB上分区划线 接种。送37℃培养24小时。
精选ppt课件2021
（一）确定可疑菌落。 1.观察EMB表面的菌
落特征： （1）.凡紫黑色的单
个菌落可初步定为 可疑大肠杆菌菌落， 标号为。 （2）.凡光滑无色透 明的单个小菌落可 初步定为痢疾杆菌 属菌落或伤寒杆菌 属菌落，标号为。
精选ppt课件2021
二.纯培养
（二）.可疑菌落纯化培养 无菌操作用接种针挑取已编号可疑菌落，分别接种在双 糖铁高层琼脂斜面和半固体培养基上，送37℃温箱培 养24~48小时。
红色为吲哚试验阳性阳性无变化为无变化为阴性阴性红色为甲基红试验红色为甲基红试验阳性阳性桔黄色桔黄色为为阴性阴性吲哚试验吲哚试验i甲基红试验甲基红试验mrmr试验试验2021精选pptvp试验枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验c斜面上有菌苔且变成深蓝斜面上有菌苔且变成深蓝色为阳性阳性
肠杆菌科细菌鉴定
组员：李木生，颜大钧，郑伟坛，朱 俊林，胡思妙，王荣迎，陈琳蔓

仔猪黄痢： 新生仔猪从脱离母猪子宫到吸奶的期间，接触严 重污染的环境，导致吞入来自于母猪肠道菌群的 细菌。致使新生仔猪大肠杆菌性腹泻的暴发。 无明显的季节性，一年四季均可发生，尤其在产 仔高峰期常呈地方性流行，常 以1-5日龄多见。
2021/4/22
广西钦州农业学校养殖教研室
四、发 病 特 点
2021/4/22
广西钦州农业学校养殖教研室
小结：
由于大肠猪血清型多，变异大，抗原复杂， 加上耐药性菌株的产生，给大肠杆菌病的 防制带来一定困难。
因此，采用本地优势菌株灭活苗免疫（或 本场小猪粪便返饲母猪），结合使用少量 敏感抗菌素，配合加强饲养管理等综合措 施，是防治规模化猪场大肠杆菌病最为经 济有效的方法。
第四节 猪大肠杆菌病
广西钦州农业学校 韦惠峰
2021/4/22
广西钦州农业学校养殖教研室
教学目的： 1、大肠杆菌病的诊断方法 2、大肠杆菌病的综合防治措施
2021/4/22
广西钦州农业学校养殖教研室
一、疾病种类
1、仔猪黄痢：出生后一周内发生， 以3日龄左右最为常见。
2、仔猪白痢：发生于10-30日龄的 仔猪，以2-3周龄最常见。
病程长短不一，死亡率高。
2021/4/22
广西钦州农业学校养殖教研室
2021/4/22
广西钦州农业学校养殖教研室
病猪大多数营养状况良好，皮肤略显苍白。 全身多处组织水肿。
2021/4/22
广西钦州农业学校养殖教研室
五、病 理 变 化
仔猪黄痢：皮肤干燥、皱缩，口腔粘膜苍白、干燥 脱水。最为显著的病变为肠道急性卡他性炎症，其 中以十二指肠最为严重。 仔猪白痢：剖检尸体外表苍白消瘦，肠粘膜有卡他 性炎症变化，有少量粘液性分泌液，胃见有食滞。 猪水肿病： 胃粘膜下的水肿具有特征性，常位于近 胃大弯及贲门的区域， 水肿液一般为浆液性，有时 在粘膜附近有血染。

蓝琼脂平板） 培养物涂片革兰氏染色 生化试验 动物接种试验
大肠杆菌病纤维渗出物中的细菌
伊红美蓝培养基、麦康凯培养基 上大肠杆菌菌落Βιβλιοθήκη 大肠杆菌培养物涂片革兰氏染色
大肠杆菌生化特性
动物微生物应用技术
大肠杆菌病实验室 诊断方案
大肠杆菌病实验室诊断方案
病料 病料中细菌的形态学检查
病料中细菌的分离培养 18小时后
涂片革兰氏染色 糖发酵试验
纯培养 生化试验
H2S试验
MR试验
动物致病性试验
10日龄小鸡，皮下注 射0.2ml/只
大肠杆菌病实验室诊断结果
剖检（采集病料） 纤维素渗出物的涂片染色 分离培养（麦康凯或伊红美