4蛋白质

实验四蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、实验目的1、了解蛋白质的两性解离性质。

2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。

3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

二、实验原理蛋白质是两性电解质。

在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。

当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。

不同蛋白质各有特异的等电点。

在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。

最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。

用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。

向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类：（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。

如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。

提纯蛋白质时，常利用此类反应。

（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。

加热引起的蛋白质沉淀与凝固。

蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。

因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

三、实验器材1、实验仪器1) 水浴锅2) 温度计3) 200mL锥形瓶4) 100mL容量瓶5) 吸管6) 试管及试管架7) 乳钵2、实验材料1) 新鲜鸡蛋2) 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40—50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。

第四章蛋白质的三维结构稳定蛋白质三维结构的作用力一、多肽主链折叠的空间限制从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。

从理论上讲个多肽主链能有无限多种构象但是，只有一种或很少几种天然构象，且相当稳定。

但是只有种或很少几种天然构象且相当稳定因为：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转1、肽链的二面角★只有α碳原子连接的两个键（C α—N 和C α-C ）是单键，能自由旋转。

★扭角:环绕C α—N 键旋转的角度为Φ,环绕C α—C 键旋转的角度称Ψ。

可旋转±180度，一般呈顺时针旋转。

旋转受H.O 基的限制多肽主链的构象可以用每个C 的对原子以及R 基的限制。

多肽主链的构象可以用每个a-C 的一对扭角来描述。

★当Φ(Ψ)旋转键两侧的主链呈顺式时，规定Φ(Ψ)=0°★从Cα沿键轴方向看，顺时针旋转的Φ(Ψ)角为正值，反之为负值。

2、拉氏构象图：可允许的Φ和Ψ值Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。

个相邻肽单位中非键合原间的接有Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ◆拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离（范德华距离），确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐坐标以为纵坐标在坐标图上标出该坐标图称拉氏构象图。

⑴实线封闭区域一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。

的且构象稳定⑵虚线封闭区域是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和般允许距离之间，立体化学允许，但许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。

⑶虚线外区域是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离象都是不允许的此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。

第4课时蛋白质(二)[目标导读] 1.复习蛋白质的形成过程，从多个角度归纳蛋白质具有多样性的缘由，理解蛋白质结构多样性与功能简洁性的关系。

2.在把握蛋白质结构特点的基础上，归纳有关蛋白质结构的计算规律。

[重难点击] 1.蛋白质结构多样性的缘由。

2.有关蛋白质结构的计算规律。

一蛋白质的多样性1．如图中“□”或者“○”代表不同的氨基酸，分析各图代表的含义，归纳蛋白质多样性的缘由。

图甲图乙图丙图丁(1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。

(2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。

(3)图丙说明：氨基酸的排列挨次不同，构成的肽链不同。

(4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。

2．假定20种氨基酸任意组成一个含n个氨基酸的多肽分子，这样的多肽就将有20n种，据此分析以下两种情形：(1)A、B、C三种氨基酸，每种氨基酸足够多的状况下，可形成三肽的种类为27种，可形成二肽的种类为9种。

(2)A、B、C三种氨基酸，每种氨基酸只有一个的状况下，可形成三肽的种类为6种，可形成二肽的种类为6种。

3．蛋白质的结构具有多样性与其功能有何关系？答案蛋白质的结构多样性打算了其功能多样性，两者是高度统一的。

4．蛋白质的水解和变性(1)变性：蛋白质由于高温、强酸(碱)、重金属盐等因素导致空间结构发生不行逆的转变，从而失去生物学活性的过程称为变性。

变性的过程肽键不断裂(不断裂、断裂)。

(2)水解：蛋白质或者多肽中肽键断裂，分解为氨基酸的过程称为水解，和脱水缩合的过程相反，这个过程需要蛋白酶或者肽酶的催化。

归纳总结活学活用1．人体的肌肉主要由蛋白质组成。

同样是肌肉，心肌具有自动收缩的特性，平滑肌有较强的舒张性，骨骼肌能够强有力的收缩，这些区分说明构成它们的蛋白质有区分，这些区分可能是()A．所含氨基酸的数目不同B．所含氨基酸的种类不同C．所含氨基酸的排列挨次不同D．所含氨基酸的种类、数目、排列挨次和肽链的空间结构不同答案 D解析蛋白质的多样性可以从氨基酸和肽链两个角度来分析。

il-4 蛋白质结构
IL-4蛋白质是一种细胞因子，它由蛋白质IL-4编码并表达。

IL-
4蛋白质结构由约132个氨基酸残基组成，具有分子量大约为20 kDa。

IL-4蛋白质结构包含一个信号肽序列，该序列可被剪除，产生成熟的
功能性IL-4蛋白。

成熟的IL-4蛋白质结构主要由一个α螺旋和两个
β片层构成。

它还包括Cys2-Cys95和Cys3-Cys110之间的两个二硫键，这些二硫键对于IL-4的生物活性至关重要。

此外，IL-4还有一个可被特定受体结合的结构域，与其受体结合后触发下游信号转导途径。

IL-
4蛋白质结构不仅在免疫调节中发挥重要作用，还与许多疾病的发展有关，如免疫炎症性疾病和某些肿瘤。

蛋白质理化性质一．氨基酸的性质(1)酸碱性质和等电点(2)光学活性和光谱性质(3)重要化学反应与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定.与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）：•用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。

与茚三酮反应:用于氨基酸定量测定成肽反应：氨基酸合成肽的反应基础二，氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）pH< pI净电荷为正pH = pI净电荷=0pH > pI净电荷为负当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)。

甘氨酸盐酸盐（A+）等电点甘氨酸（A甘氨酸钠（A-）甘氨酸滴定曲线谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算三．氨基酸光学活性和光谱性质1、旋光性：除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。

2、紫外吸收光谱：参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示特征的吸max）分别为280、275和257nm。

由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。

四，芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Try,W）摩尔吸收系数TryTyrPhe的紫外吸收光谱波长氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）2，4-二硝基氟苯( DNFB)（dinitrofiuorobenzene）氨基酸+ HF(2，4-二硝基苯氨基酸）氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）+异硫氰酸苯酯 (PITC)五，氨基酸与茚三酮反应（定量）△弱酸还原性茚三酮茚三酮(无色)茚三酮还原性茚三酮幻灯片12多肽N、C-末端氨基酸的测定N端 Sanger法（二硝基氟苯反应）DNS法（丹磺酰氯反应）Edman法（苯异硫氰酸脂反应）氨肽酶法C端肼解法还原法羧肽酶法幻灯片13蛋白质顺序测定基本方法路线幻灯片14二硫键的断裂幻灯片15蛋白质一级结构测定基本策略：氨基酸顺序直测法＋片段重叠法基本步骤：(1)测定蛋白质分子中多肽链数目；(2)拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键；(3)分析每一条多肽链的氨基酸组成；(4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基；(5)裂解多肽链成较小的片段；(6)测定各肽段的氨基酸顺序；(7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构；(8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。

第三章第4节蛋白质工程的原理和应用课前自主探究一.蛋白质工程的概念理解①基础：蛋白质分子的及其与的关系。

②手段：改造或合成。

③结果：对现有蛋白质进行或制造出。

二、蛋白质工程崛起的缘由1.基因工程的实质和不足：(1)实质：将一种生物的基因转移到,后者可以产生它本不能产生的，进而表现出。

(2)基因工程存在的不足：原则上只能生产自然界的蛋白质。

2.蛋白质工程的崛起：(1)理论和技术条件：、晶体学以及计算机技术的迅猛发展。

(2)天然蛋白质存在不足：天然蛋白质的符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合的需要。

(3)实例：玉米中赖氨酸的含量比较低，将赖氨酸合成过程中两种酶的替换，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍。

三、蛋白质工程的基本原理1.目标：根据人们对功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。

2.方法：或。

3.流程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的→推测应有的序列→找到并改变相对应的序列（基因）或合成新的→获得所需要的蛋白质。

四、蛋白质工程的应用1.在医药工业方面的应用(1)研发速效胰岛素类似物：科学家通过改造使B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了，研发出速效胰岛素类似物。

(2)提高干扰素的保存期：将干扰素分子上的一个变成，提高了干扰素的保存时间。

(3)改造抗体：将小鼠单克隆抗体上“嫁接”到人的抗体上，降低了诱发人体免疫反应的强度。

2.在其他工业和农业方面的应用(1)改进酶的性能或开发新的工业用酶：利用蛋白质工程获得蛋白酶的多种。

(2)改造某些重要的酶：利用蛋白质工程改造参与的酶，以提高植物光合作用的效率。

易错易混辨析(1)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。

（）(2)蛋白质工程以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础。

（）(3)基因工程在分子水平对基因进行操作，蛋白质工程在分子水平对蛋白质进行操作。

（）(4)蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。