微生物限度检验培养基质量控制文稿演示

碳源——CO2为唯一或主要碳源 能源——光能 例： CO2 + H2O [CH2O] + O2 2CO2 + H2S + 2H2O 2[CH2O] +H2SO4 CO2 + 2H2S CH2O] + H2O + 2S 藻类和蓝细菌
（1）产氧光合作用 ----藻类和蓝细菌细胞内含有叶绿素，能与高 等植物一样利用光能分解水产生氧气并还原 CO2为有机碳化物，其反应通式为： CO2 + H2O ----------［CH2O］+ O2↑ 叶绿素
四、Nutrient
营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可 以将它们区分成六大类。
1. Source of carbon （碳源） 2. Source of Nitrogen （氮源) 3.Inorganic salt（无机盐） 4. Growth factor（生长因子) 5.Water（水分） 6. Energy source（能源)
藻类的叶绿体中含有叶绿素a和类胡萝卜素，其它光合色素 随类群而异。藻类多数水生， 只要环境中有光照、少量氮素 和无机盐就能生长
（2）不产氧光合作用
----光合细菌(紫色细菌和绿色细菌)与蓝细菌不同，细
胞内含有类似于叶绿素的菌绿素，但不能进行以H2O 为供氢体的非环式光合磷酸化作用，也不产生氧气。 光合细菌吸收光能，以还原态无机硫化物(H2S、S或 S2O3-2等)为氢或电子供体同化CO2，代表性反应为：
二、营养物质的功能
参与微生物细胞的组成 提供微生物机体进行各种生理活动所需 的能量 形成微生物代谢产物的来源
营养物质是微生物新陈代谢和一切生命 活动的物质基础，失去这个基础，生命 也就停止
三、化学成分

详细记录。
•
6、菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证明和登记登
记，并包装严密。菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。
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文件
• 文件应当充分表明实验是在实验室按可 控的检查法进行的
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文件
• 人员培训和资格确认 • 设备验收；验证；检定（或校准期间核查）和维修 • 设备使用中的运行状态（设备的关键参数） • 培养基制备、储存和质量控制 • 检验规程中的关键步骤 • 数据记录与结果计算的确认 • 质量责任人对实验报告的评估 • 数据偏离的调查
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国外的菌种保藏机构
• 世界菌种保藏联合会（WFCC） • 美国标准菌种收藏所（ATCC） • 美国农业部北部地区研究实验室（NRRL） • 英国 国立标准菌种收藏所（NCTC） • 英国 国际真菌研究所（CMI） • 荷兰真菌中心保藏所（CBS） • 日本微生物菌种保藏联合会（JFCC）
量控制试验是提供优质培养基的保证。
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培养基
• 培养基的制备 • 培养基的储藏 • 质量控制实验
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菌种
• 微生物实验过程中，实验菌株可能是最敏感 的，因为它们的生物活性和特性依赖于合
适的 试验操作和贮藏条件。
• 实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化， 使 尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。 按统 一操作程序制备菌株是微生物试验结果一 致性 的重要保证。
菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。
•
4、由专人按操作规程和有关要求定期
进行传代，并定期对保存的菌种进行检查，
一般每年1～2次，（或定期更换冻干菌种）。

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3、培养基的促生长和抑制性能试验
⑴无菌检查用培养基 适用性试验 无菌性检查和灵敏度检查
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灵敏度检查
参照 2010年版《中国药典》中培养基灵 敏度检查试验
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微生物限度检查(计数培养基)
培养基的适用性检查
促生长、抑制及指示能力检查
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菌种
大肠埃希菌 [CMCC（B）26003] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 枯草芽孢杆菌「CMCC(B)63501」 白色念珠球菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（F）98003]
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二、培养基的质量控制
目前，许多实验室为了操作方便，多使用脱水 培养基进行配制或购买已制备好的分装于培养皿 或玻璃容器的商业培养基。 经实验室配制或由生产厂生产的培养基的质量高 度依赖于其如何制备，采用不适宜方法制备的培 养基将影响微生物的生长或复苏，从而影响试验 结果的可靠性。
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所有配制好的培养基均应进行验证，验证 方法参照《中国药典2010年版》附录无 菌检查或微生物限度检查项下有关规定进 行。实验室配制的培养基的常规监控项目 是外观、性状、pH、促生长试验、定期 的稳定性检查以及培养基有效期的确定。
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一些用于进一步鉴定微生物的诊断试剂， 如革兰染色、氧化酶试验试剂等。它们与 培养基相似点可能是质量控制试验。在试 剂用于未知样品鉴定前，选择正确的标准 质控菌，按使用说明上的要求进行质控试 验。
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用于环境监控的培养基应特别小心防护。 20
1、测定PH值 2、一般性状
⑴制成平板或分装于试管的培养基应检查 ⑵固体培养基 ⑶液体培养基 ⑷ ⑶其他
曙红亚甲蓝琼脂 或麦康凯琼脂 培养基
促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌

（二)外部质量控制
a.实验室应参加外部的质量控制活动,对其开展的每 一项检测均应参加相应的室间质量控制。
b.对有关实验室或管理机构发出的测试样品应严格 地当作普通样品一样处理,这样一种方法有助于实验 室每天测试的准确性和重复性,是对实验室所用的方 法,试剂,设备,人员能力的测试。
C.从室间样品测试中的错误可以发现实验室的 不足之处,对工作人员的教育改进可以提高实 验室的检测质量。
7、微生物的生长
1.个体生长很不明显，持续很短时间就繁殖。
被后人尊为细菌学鼻祖，传染病的克星，细菌学的奠基人和开拓者 传染病是人类健康的大敌。从古至今，鼠 疫、伤寒、霍乱、肺结核等许多可怕的病 魔夺去了人类无数的生命。人类要战胜这 些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第 一个发现传染病是由病原细菌感染造成的 人就是罗伯特· 科赫。
2003年，经过全球10个国家的科学 家的共同努力，终于确认了冠状病毒 是SARS的病原体。最终判定这种冠 状病毒是否真正的元凶，依靠的是 100多年前德国伟大的细菌学家科赫 提出的“科赫原则”。
微生物
金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 沙门氏菌 酵母菌 霉菌
热死 时间 温度( ℃) 时间( 分)
63 60 60 50~60 60 7 5~30 5 10~15 5~10
消毒与灭菌方法 a、干热灭菌法
1.火焰灭菌（酒精灯） 2.干热灭菌（电热干燥箱） b、湿热灭菌法 1.巴氏消毒 2.煮沸消毒 3.间歇灭菌法 4.加热蒸汽灭菌法（高压灭菌锅） c、辐射 d、过滤 e、化学方法
微生物检验技术
讲授:周慧恒
目录
一、第一讲 二、第二讲 三、第三讲 四、第四讲 五、第五讲 六、第六讲 七、第七讲 八、第八讲 九、第九讲 十、第十讲

• 非必要品禁止带入实验室，必要资料和记录应消毒后进入并应远离操作 台。
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。

适用菌种
病毒 支原体 各类细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌 蓝藻 动物细胞
液体石蜡覆盖保存法
传代保存的变相方法 能够适当地延长保存时间 优质石蜡121℃高压灭菌2小时，160℃
干燥箱中灭菌1—2小时，放冷备用 液体石蜡的深度以1cm左右 保存期通常6个月至一年
适用菌种
霉菌、酵母菌、放线菌、部分细菌。如： 大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌 等需氧性细菌
目标菌的生长指标G大于6时，培养基可
接受
定性测试方法
用3mm接种环取测试菌培养物，在测试 培养基表面划平行直线。可同时在一个 平板上接种多个菌株，但划线不能交叉
按标准中规定的培养时间和温度对接种 后的平板进行培养
结果解释
培养后按以下方法计分：
0表示无生长 1表示微弱生长 2表示生长良好
不能用于低温冷冻保存的微生物（如孢 子形成能力极差的丝状菌）
不适于用菌种：固氮菌、乳酸杆菌、明 串珠菌、分枝杆菌、沙门法：菌种悬浮在10％(体积分数)甘油蒸 馏水中。置于低温(-70)保藏。
注意事项：所要保藏的菌种，最好先培养至对 数期；使用液体培养基时，可直接加到已灭过 菌的甘油中，并使甘油的终浓度在l0％～30％ 左右。为避免反复冻溶，可分装于小离心管中， 置低温保藏。
性能评价 所用测试菌株
实验室验收：
产品标签：
名称和批号 有效期
接收日期 包装及其完整性
SN/T1538.1-2005中4.1;对应 CNAS/CL01 4.6.2内容,通常要 记录(采购服务和供给)
储存要求
例行常规检查内容:
容器密闭性复查 首次开封日期 内容物的感官检查
使用前检查(即用型培养基):
方法和螺旋平板涂布法效果较好。

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（二）操作手册
①各级人员的职责和权限； ②实验室安全措施； ③标本采集和处理指南； ④本室开展的检验项目及最低鉴定要求； ⑤培养基和试剂的配制方法； ⑥质量控制方案； ⑦常用参考数据； ⑧其他制度。
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（三）培养基的质量控制
培养基是分离培养微生物的必需品。培养基质量的好 坏，直接关系到分离培养的成败。目前大多数实验室都使 用干粉培养基配制或使用成品培养基。对来自著名的微生 物培养基生产公司的培养基，质量比较稳定。只要按照说 明书的要求贮存，在有效期内使用可获得满意效果。
标本鉴定正确数－平均实验室正确数 /实验室平均正确数 的标准差，高于平均值得正分，低于平均值得负分。如果 得分低于－1．96，则表示水平差，需进行学习和帮助。
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谢谢！
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（二）一般性检查项目
包括有否制定各种制度及其执行情况。 ①培养基和试剂的配制记录、培养基的保存方法、灭菌 质量、有效期。 ②室内全面质量控制的建立，室内工作人员的熟练程度 的考核和盲点试验的进行情况，细菌检验的操作手册及操 作的规范性。 ③设备的操作卡，操作人员的操作水平，设备的使用保 养、维修记录。
微生物检验 的质量控制
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微生物检验的质量控制，包括室内 质量控制和室间质量控制评价。

室内质量控制是由实验室内部 制定并实施的，是质量保证的 核心和基础。

室间质量控制评价是由实验室 外部的组织或机构对实验室进 行的质量评价。
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室内质量控制
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（一）人员与组织管理
①经过广泛的基础训练教育，包括微生物学、基础医学临 床医学知识的学习，专业化的实验技能培训。 ②参加医务人员的继续教育。 ③配有一名经严格训练并长期从事于微生物检验的技术人 员，全面负责实验室的工作。

回收率测定法（定量和定性）
➢例1：XLD培养基
回收率测定法
选取适宜的3-4个连续稀释度接种于9mL待检测培养基中，每个稀释度3管，35℃-37 ℃培养3d。
➢ 例2：沙门氏菌显色培养基 分类：物理状态、功能和制备工艺
养基质量控制应该形成的记录 C：斜面变碱/大量H2S/气体+
• 沙门氏菌：紫红色菌落 定义：按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需要的各种营养物质，由人工配置的营养基质，专供微生物培养及分离鉴别、研究和保
菌种鉴定记录
菌毒株入库登记表
菌毒株使用记录
食品检测记录
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- 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及 对微生物的生长和存活无影响。
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
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稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
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验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
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验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件