等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点教学提纲

【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法【实验原理】等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。

当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。

蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。

当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。

当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。

这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。

利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。

【实验材料】1.实验器材小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计2.实验试剂(1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。

(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。

此蛋白溶液应无盐离子。

(3) 5%磷酸溶液(4) 2%氢氧化钠溶液(5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。

(6) 40%蔗糖溶液(7) 12%三氯醋酸溶液(8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。

【实验操作】1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。

2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。

在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。

当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。

因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。

根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

2．1％(V/V)TEMED溶液。

3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。

4．40％两性电解质载体。

5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。

6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。

7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。

8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。

9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。

10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。

11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。

12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。

食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。

相同： 1、都是蛋白质电泳 2、都用聚丙烯酰胺做载体 不同： 1、分离原理不同，IEF按pI, SDS-PAGE按分子量 分离。 2、载体形状不同， IEF-柱状， SDS-PAGE-平板。 3、IEF中聚丙烯酰胺为抗对流介质，SDS-PAGE中 聚丙烯酰胺为分子筛。

蛋白质的分离模式图 箭头代表移动方向，箭头长短代表移动速度， 右图为平衡时蛋白质的分离状态。
三、实验方法及流程
电聚焦流程： 制备载体（加样）→电泳4h→剥胶 →固定（本次省略）→测定距离 ∟ →制作pH梯度→测定（电脑作图） 实验方法： 预先准备洁净玻璃管（0.5ⅹ9cm）两根，下端封闭垂直插在管架上。 按下列配方在小烧杯内配制凝胶溶液（5mL） 1、凝胶贮备液 2.5mL 2、两性电解质载体 0.25mL（老师处） 3、2%TEMED 0.25mL 4、蛋白质样品 （经计算有1mg左右） 5、蒸馏水(超纯水） （适量） 6、10%过硫酸铵 0.05mL（最后加） 轻轻混匀，立即用滴管装管至离上端0.5cm处，再缓慢加蒸馏水 3-5mm高，静止聚合30分钟。待凝胶与水之间有明显界面时，即聚合 完毕。



聚合后，在电泳槽中电泳2-4小时。 剥胶（用长针头注射器） 量距离（整条胶长，条带至正极长度） 制作pH梯度，0.5cm从正极端切，放在细胞盘里，加1mL蒸 馏水，摇床0.5-1小时，用精密pH试纸测定。 电脑作图（找出等电点）。
SDS-PAGE和IEF的异同

凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点



一、原理:
IEF 1966年由瑞典科学家发明。
蛋白质分子由不同数量和比例的各种氨基酸组成，氨基酸侧 链在不同的pH值环境中所带的电荷不同，当蛋白质处于等电点时， 它的净电荷为零，因此可利用等电点差异分离。 凝胶等电聚焦法的关键是建立稳定的连续的pH梯度。用于建 立pH梯度的物质是两性电解质载体，它是一种多羧基多氨基的脂 肪族化合物，分子量在300-1000之间。国产和进口的两性电解质 载体均有各种规格。可以根据需要选择使用。良好的两性电解质 混合物，它的各种成分在等电点时有方法

器材：圆盘电泳槽 、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床
四、操作方法
1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易 聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)
（2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
(2) 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以 及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250 染色，加样量可为50-150 g；如用银染色， 加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30 l。
六、思考题
(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。
(2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意 事项有哪些？
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极 液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器 长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管， 推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁 与凝胶分开，凝胶条即可流出。
4 .固定染色
取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固 定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2 h， 用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰， 量出蛋白带距正极端的距离。
实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 电泳测定蛋白质的等电点
一、目的要求
1.学习和掌握圆盘电泳技术 2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白Байду номын сангаас的等
电点方法
二、原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质 pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其 中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两 性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极 到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作 用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH 值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区 带。

蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。

2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。

3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。

二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。

当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。

在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。

利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。

本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。

醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。

在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。

当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。

三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。

用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。

2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。

3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。

在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。

接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。

4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。

取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。

5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。

实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。

聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。

一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。

因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。

二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。

实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。

通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。

二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。

近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。

目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。

由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。

蛋白质分子是典型的两性电解质分子。

它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。

这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。

如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。

这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。

等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。

两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。

常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。

国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。

两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。

聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。

二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。

它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。

近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。

由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。

等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。

这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。

本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。

理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。

常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。

合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。

这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。

混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。

目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。

不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。

实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点引言：蛋白质是生物体中一类重要的生物大分子，它们的功能和性质与其结构密切相关。

等电点是指蛋白质在溶液中存在时呈电荷中性的pH值。

当蛋白质的溶液中pH等于它的等电点时，蛋白质的正电荷和负电荷相等，从而净电荷为0。

等电点测定是一种常用的方法，用于确定蛋白质的等电点。

实验目的：1.掌握等电点聚焦技术的原理和操作方法。

2.利用等电点聚焦技术测定其中一种蛋白质的等电点。

材料与方法：1.实验仪器：等电点聚焦仪。

2.实验试剂：蛋白质样品、等电点聚焦凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、溶液缓冲液等。

3.样品制备：取适量的蛋白质样品，加入等电点样品溶液缓冲液，使其浓度适当。

4.等电点聚焦凝胶制备：根据实验需要，选择适当的pH梯度，制备等电点聚焦凝胶。

5.实验操作：将已制备好的等电点聚焦凝胶放置于等电点聚焦仪中，按照仪器操作说明进行调试和操作。

将样品加载到凝胶上，通过电场力使其在凝胶中聚焦移动，最终形成pH梯度。

根据蛋白质的等电点，蛋白质在凝胶中会聚焦在对应的位置。

6.凝胶分离与染色：等电点聚焦结束后，取出凝胶，根据需要进行分离和染色。

结果与讨论：等电点聚焦技术是一种高效、准确的测定蛋白质等电点的方法。

它利用电场力将蛋白质在凝胶中聚焦，根据蛋白质在不同pH条件下的电荷变化，最终确定其等电点。

该方法操作简便、结果可靠，适用于各类蛋白质的等电点测定。

结论：本实验利用等电点聚焦技术成功地测定了一种蛋白质的等电点，并通过凝胶分离和染色展示了等电点聚焦的结果。

等电点聚焦技术在蛋白质等电点测定中具有重要的应用价值，可以为蛋白质结构和功能的研究提供重要的参考。

[1]赵海洋.蛋白质等电点聚焦技术[J].广西科技大学学报，2024[2]张桂泉,王运青,刘晓东.蛋白质等电点聚焦的实验教学及质量考察[J].高等教育化学研究，2024。

1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。

2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。

3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。

二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。

其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。

蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。

在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。

在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。

三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。

2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。

四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。

2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。

3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。

4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。

5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。

6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。

五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。

2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。

1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。

2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。

3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。

b. 避免气泡产生，影响实验结果。

c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。

等电点聚焦测蛋白质等电点一、实验原理在稳定的pH梯度中，按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳的方法。

蛋白质分子由于其表面电荷在稳定的pH梯度中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为零的区带，这时的pH则是这种分子的pI。

二、操作步骤1 圆柱体凝胶制备，用封口膜将玻管的一端封口，将玻管套上橡胶塞，加入凝胶混合液至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，静置待其聚合（1hr）。

2 聚焦电泳将电泳下槽注入0.2%硫酸600ml，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽【注意塞紧所有的孔，以防电极液漏下】。

将上槽连同电泳管置于下槽上，此时凝胶下端与电极液接触，注意排除凝胶下表面的气泡。

上槽注入0.5%乙醇胺1000ml，注入注意不要搅拌样品层和隔离层。

接上电源，正极接酸，负极接碱。

恒定在160V至电流降至0（或不变）为止。

取胶将聚胶后的含样品的凝胶借助长注射器针头注水取出。

加入2ml 10%三氯乙酸于10只小玻璃瓶中，将预测pH梯度的胶条置于玻璃上，用刀片平分成10小段，按顺序放入有标号的小玻璃瓶中，盖好橡皮塞，将聚胶段在室温下浸泡过夜，次日用pH计测定每支小瓶中浸泡液pH值。

将所得pH值对凝胶长度作图，得标准曲线。

有条件时，应用已知等电点的标准蛋白做对照测等电点。

将剩下的样品胶用10%三氯乙酸固定，使胶里的蛋白质变性，几分钟后即可看见蛋白质条带。

测定出染色蛋白带的位置，在pH梯度曲线上求出相应pH值即使此样品的pI。

三、试剂单体储液1ml10%过硫酸铵0.02ml水 2.73ml两性电解质0.15ml样品液0.05ml（浓度10mg/ml,BSA）TEMED 0.02ml将以上试剂加入一支管内，再将每管内的胶平均装三支玻管，其中1-3号玻管里加入了牛血清蛋白50μl，4-6号玻璃管加入了人血清蛋白100μl，7-9号试管加入了牛血清蛋白50μl和人血清蛋白100μl，且其中加入的两性电解质为0.2 ml，其它条件与其它玻管保持一致。

一、原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。

因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。

脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。

充分溶解后，离心去除不溶杂质。

2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。

3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。

在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。

实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]一、实验目的2. 掌握测定蛋白质等电点的方法。

二、实验原理1. 蛋白质的两性反应蛋白质是一种复杂的高分子有机化合物，其分子中有许多含酸、含碱基的氨基酸残基。

因此，蛋白质具有两性反应。

当 pH 低于一个特定值时，氨基酸上的氨基质子化，成为带正电荷的离子型，蛋白质带正电；当 pH 高于另一个特定值时，氨基酸上的羧基失去质子，形成带负电荷的离子型，蛋白质带负电。

在这两个特定的 pH 值之间，蛋白质带有等量的正离子和负离子，呈等电点状态。

（1）等电聚焦法等电聚焦法是一种利用直流电场将蛋白质分离的方法。

在等电点时，蛋白质的总电荷为零，不受电场作用，停留在等电点位置，实现蛋白质的分离。

这种方法分辨率高、分离效率好，但设备复杂、操作难度大。

（2）等电点电泳法等电点电泳法是一种利用凝胶电泳原理测定蛋白质等电点的方法。

该方法在凝胶中涂上不同 pH 值的缓冲剂，形成不同 pH 值的电泳区，通过一定时间的电泳分离，观察蛋白质的运动位置，即可确定其等电点。

该方法比较简单、直观，分辨率较低。

三、实验步骤1. 预处理（1）将新鲜鸡蛋清取下，放在常温下静置 30 min，去除蛋清表面的泡沫和浮沫。

（2）采用冷环境离心机，将鸡蛋清离心 10 min，离心后取上清。

（1）将 1 mL 蛋清溶液分别加入 7 个不同 pH 值的缓冲溶液中，分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。

（2）观察各实验管中的蛋清溶液的颜色变化。

（1）将 0.2 mL 蛋清溶液加入 4 mL 聚丙烯酰胺凝胶缓冲液中，混合均匀倒入凝胶板中。

（2）试管中加入 3 mL 结晶紫染色溶液（10^-3 M），将凝胶板浸泡在染色溶液中，染色 30 min 后，倒掉染色溶液，用蒸馏水清洗凝胶板几次，至染色液流出凝胶板没有颜色为止。

（3）取出凝胶板，用透明胶带覆盖红色刻度线，用间隔开的两条直线将凝胶板对折，压平，用剪刀从中央向两侧剪开，取下其中一块凝胶，放入测定盒中，插上电极进行电泳。

水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100图毫升聚容量丙瓶烯、吸酰管胺、试凝管胶、试圆管盘架、电乳泳钵 示意图
(A为正面,B为剖面)
四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
10%过硫酸铵
最常用的方法是：
凝胶贮液
2.
①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ％酪蛋白醋酸钠溶液
水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵
10%TEMED
0.
②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH
蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝 胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋 白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值 等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的 区带。
三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。

10 min
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保 证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为0，则可关闭电源。
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
6.75
10%过硫酸铵
0.05
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
Байду номын сангаас0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
• 有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大 的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度， 故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸 到碱逐步变化。

四 实验操作
1. 凝胶柱的制备 配方如下: 凝胶液 2.5ml 40%Ampholine 0.5ml 蛋白样品 100ul TEMED 10ul 水 6.74ml 10%AP 0.15ml 10ml
10ml可灌6个凝胶柱
2.
装管 每个学生装1支管，每组装六支（其中五只为）。 将圆盘电泳槽的玻璃管洗净晾干，底端用塑料 薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用胶 头滴管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管 的容量约为~2ml），液面加至距管口5mm处， 用注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消 除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约50 分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。



4. 剥胶 取下胶管，用H2O 将胶管和两端洗2次， 用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶 管和内插针头的同时分别向胶管两端注入 H2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可 用洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内， 记住正极端为“头”，负极端为“尾”， 若分不清时，可用pH试纸鉴定，酸性端为 正，碱性端为负。


5. 染色 每组取五支胶条置于一个小培养皿内，倒 入染色溶液至没过胶条，进行染色脱色， 约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的蓝 色沉淀带。倒出脱色液，用直尺量出胶条 长度“L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带 中心（即聚焦部位）的长度“L’”。
6.
测定pH梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直 尺量出待测pH胶条的长度“L1”。按照由正 极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条 切成10mm长的小段，分别置于小试管中， 加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用 仔细校正后的pH试纸测出每管浸出液的pH 值。
1克AP至10毫升
4 5 6 7

蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。

初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。

二、原则：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以选择性地吸附溶液中的一些离子，或者由于固体分子本身的电离作用，这些离子可以进入溶液，从而使固相和液相分别具有不同的符号电荷。

由于电中性的要求，在靠近带电表面的液体中，必须有与固体表面电荷数量相同但符号相反的多余反离子。

在界面处，带电表面和反离子形成双电层结构。

在两种不同物质的界面上，正负电荷排列成一个表面层。

对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。

最早于1879年helmholz提出平板型模型；1910年gouy和1913年chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来stern又提出了stern模型。

O.stern认为，一些反离子由于电引力或非电特性引力（如范德华力）与表面紧密结合，形成吸附层（或致密层，stern层）。

剩余离子扩散分布在溶液中，形成双电层的扩散层（或滑动面）。

由于带电表面的吸引力，扩散层中的反离子浓度远大于相同离子的浓度。

离表面越远，多余的反离子越少，直到溶液中的反离子浓度等于相同数量的离子浓度。

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。

其余反离子则构成扩散层。

滑动面：指固液两相相对运动的界面，是一个不平整的表面。

滑动面和溶液体之间的电位差称为ζ电位。

固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ只有当固液两相相对移动时，电位才会出现。

ζ电位的大小用ζ电位表示，其值反映了带电胶体粒子的程度。

该值越高，带电胶体颗粒越多，扩散层越厚。

一般来说，pH值为横坐标，zeta电位为纵坐标，zeta电位为零的pH值为等电点。

对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶体颗粒的范围内，约为1~100微米。