大肠杆菌表达系统总结
随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列 、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）
菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。表达载体也是影响外源基因表达的重要因素，它是表达系统中最关键的元件，包括启动子、目的基因、抗性基因和终止子等，表达载体需具有高拷贝数、产量高、应用范围广、表达产物易纯化及稳定性好等特点，应用在大肠杆菌中的载体包括融合表达型载体、分泌型表达载体和共表达载体等，常用的表达载体为pET、pUC、pSC、pPBB、pBV220、 pRK1、pRLK14等，常用的启动子有Ptrp、 Ppho、PL、PR、Ptac、Plac、T7 噬菌体启动子、 trp-lac 杂合启动子等。
外源基因在动物细胞中的表达
随着基因工程技术的不断发展，外源基因的应用范围也越来越广泛。其中，外源基因在动物细胞中的表达，为研究生物学、医学等领域提供了很多帮助和便利。
一、外源基因的引入和表达
在外源基因的引入和表达中，主要有两种方法：转基因和转染。
1. 转基因
转基因是将外源基因直接引入动物细胞的染色体或质粒中，并整合到宿主细胞基因组中。这种方法的好处是可以实现长时间的稳定表达，但是其过程较为复杂，需要进行较多的实验操作。同时，还有一定的安全性问题需要考虑。
2. 转染
转染是将外源基因通过化学、物理等手段引入到细胞内。这种方法的优势在于操作简单，效率高。但表达时间较短，需要反复转染才能实现长时间的表达。
二、外源基因的表达系统
外源基因的表达主要分为两种系统：原核表达系统和真核表达系统。其中原核表达系统是应用较多的一种，包括细菌表达和酵母表达等。
1. 原核表达系统
细菌表达是利用大肠杆菌等细菌对外源基因高效表达的一种方法。其主要优势在于速度快、表达量大，同时可以大规模制备蛋白质。但其缺点也比较明显，外源蛋白可能被别的蛋白降解，所得的蛋白酶解产物活性也可能较低。
酵母表达主要是利用酵母对外源基因高效表达的特点来制备目标蛋白。相比细菌表达，酵母表达的外源蛋白在折叠和修饰方面更加接近哺乳动物细胞的翻译后修饰，因此适用于制备复杂、大分子量的蛋白质。
2. 真核表达系统
真核表达系统是指利用哺乳动物细胞对外源基因表达的一种方法。它具有结构相对复杂、修饰更接近哺乳动物细胞的翻译后修饰的特点。
常用的真核表达系统包括：哺乳动物细胞的原代细胞、转染细胞、稳定细胞系等。它们也各自有其优缺点：哺乳动物细胞的原代细胞表达效率高，但生长速度较慢、易受污染；转染细胞操作简单，表达效率较高，但表达时间有限、稳定性差；稳定细胞系可以长时间表达，并且表达和生存稳定，但难度较大。
三、外源基因的应用
1. 科学研究
原核表达系统的工作原理
原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成
原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：
（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程
原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：
（1）制备表达载体
将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞
将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译
转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化 将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点
-原核表达系统
一．表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。
据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达载体系统：
将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达合
成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达。
二．原核生物基因结构和表达特点
1． 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续
进行。
2． 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。（图）
多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的
mRNA。
3． 一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。
4． 原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗
传单位。
1） 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。共同协调作用，
完成某一多肽的表达调控。
2） 包括 调控区：调节基因，启动基因，操作基因。 结构基因：
5． 原核生物中参与转录的基因结构：
1） 启动子：是DNA上的一段序列，是RNA聚合酶识别并结合部位。
。各种不同的原核细胞其启动子各有不同，但均含有下列两个高度保守区（富
含AT：易变性解离为单链，为RNA合成提供模板） （1） TATA box（-10区，pribnow box）：转录启始点上游10bp处一
段富含AT的碱基 TATATTA
（2） -35区：长度和顺序个体间差别很大，富含AT是RNA聚合酶
识别位点。
转录的启始：RNA聚合酶首先识别启动子的-35区并结合至启动子上，然后开始滑向转录起始点，到-10区时，RNA聚合酶与启动子结合更牢
固，并继续向前滑行，大约6-7bp后开始转录（转录起始位点）。
。即RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不转录（图）
