蛋白质提取与分离纯化生化实验设计讲解共16页文档

实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。

二、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。

该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。

此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。

三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。

2、器材：滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。

四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml 无水乙醇后，再加入100 ml 85%的磷酸，加MiliQ水定容至1 L，过滤备用。

2、标准蛋白溶液的稀释取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。

每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。

未知样品的编号为8、9、10号管。

3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

蛋⽩质分离纯化技术实验讲义实验⼀蛋⽩质含量分析（Bradford检测法）⼀、实验⽬的1、制作蛋⽩质浓度标准曲线；2、测定未知蛋⽩质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋⽩质的浓度。

⼆、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋⽩质浓度是1976年由Bradford建⽴的，是最常⽤的蛋⽩质快速定量⽅法。

该⽅法根据蛋⽩质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红⾊，最⼤光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋⽩质结合后变为青⾊，蛋⽩质-染料结合物在595nm波长下有最⼤光吸收，且光吸收值与蛋⽩质含量成正⽐，因此可⽤于蛋⽩质含量的定量测定。

蛋⽩质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应⼗分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

Bradford法的突出优点是：灵敏度⾼；测定快速、简便，只需加⼀种试剂；⼲扰物质少。

此法的缺点是：仍有⼀些物质⼲扰此法的测定，主要的⼲扰物有去污剂、Triton X-100、SDS 和0.1N的NaOH。

三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml ⽜⾎清蛋⽩（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；⽆⽔⼄醇；85%磷酸；MiliQ⽔。

2、器材：滤纸；烧杯；漏⽃；可见分光光度计；试管。

四、实验⽅法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml ⽆⽔⼄醇后，再加⼊100 ml 85%的磷酸，加MiliQ⽔定容⾄1 L，过滤备⽤。

2、标准蛋⽩溶液的稀释取10⽀试管，按表中顺序排列，分别加⼊考马斯亮蓝溶液、⽔和样品。

每加完⼀管，⽴即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产⽣⼤量⽓泡⽽难于消除）。

未知样品的编号为8、9、10号管。

3、加完试剂2-5min后，即可⽤⽐⾊⽫，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。

注意：不可使⽤⽯英⽐⾊⽫（因不易洗去染⾊），可⽤塑料或玻璃⽐⾊⽫，使⽤后⽴即⽤少量95%的⼄醇冲洗，塑料⽐⾊⽫不可⽤⼄醇或丙酮长时间浸泡。