蛋白质提取与分离纯化生化实验设计讲解共16页文档
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实验一蛋白质含量分析(Bradford检测法)一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线;2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。
二、实验原理Bradford法(考马斯亮蓝法)测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的,是最常用的蛋白质快速定量方法。
该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计,考马斯亮蓝G-250(CBB G-250)在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收,且光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质含量的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是:灵敏度高;测定快速、简便,只需加一种试剂;干扰物质少。
此法的缺点是:仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材1、试剂:1mg/ml 牛血清蛋白(BSA)母液;考马斯亮蓝G-250;无水乙醇;85%磷酸;MiliQ水。
2、器材:滤纸;烧杯;漏斗;可见分光光度计;试管。
四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于47.5 ml 无水乙醇后,再加入100 ml 85%的磷酸,加MiliQ水定容至1 L,过滤备用。
2、标准蛋白溶液的稀释取10支试管,按表中顺序排列,分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。
每加完一管,立即振荡混匀(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后,即可用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇冲洗,塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
蛋⽩质分离纯化技术实验讲义实验⼀蛋⽩质含量分析(Bradford检测法)⼀、实验⽬的1、制作蛋⽩质浓度标准曲线;2、测定未知蛋⽩质浓度样品的吸光度,根据标准曲线计算出蛋⽩质的浓度。
⼆、实验原理Bradford法(考马斯亮蓝法)测定蛋⽩质浓度是1976年由Bradford建⽴的,是最常⽤的蛋⽩质快速定量⽅法。
该⽅法根据蛋⽩质与染料相结合的原理设计,考马斯亮蓝G-250(CBB G-250)在游离状态下呈红⾊,最⼤光吸收在488nm;当它在酸性溶液中与蛋⽩质结合后变为青⾊,蛋⽩质-染料结合物在595nm波长下有最⼤光吸收,且光吸收值与蛋⽩质含量成正⽐,因此可⽤于蛋⽩质含量的定量测定。
蛋⽩质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应⼗分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是:灵敏度⾼;测定快速、简便,只需加⼀种试剂;⼲扰物质少。
此法的缺点是:仍有⼀些物质⼲扰此法的测定,主要的⼲扰物有去污剂、Triton X-100、SDS 和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材1、试剂:1mg/ml ⽜⾎清蛋⽩(BSA)母液;考马斯亮蓝G-250;⽆⽔⼄醇;85%磷酸;MiliQ⽔。
2、器材:滤纸;烧杯;漏⽃;可见分光光度计;试管。
四、实验⽅法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于47.5 ml ⽆⽔⼄醇后,再加⼊100 ml 85%的磷酸,加MiliQ⽔定容⾄1 L,过滤备⽤。
2、标准蛋⽩溶液的稀释取10⽀试管,按表中顺序排列,分别加⼊考马斯亮蓝溶液、⽔和样品。
每加完⼀管,⽴即振荡混匀(注意不要太剧烈,以免产⽣⼤量⽓泡⽽难于消除)。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后,即可⽤⽐⾊⽫,在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意:不可使⽤⽯英⽐⾊⽫(因不易洗去染⾊),可⽤塑料或玻璃⽐⾊⽫,使⽤后⽴即⽤少量95%的⼄醇冲洗,塑料⽐⾊⽫不可⽤⼄醇或丙酮长时间浸泡。