谷胱甘肽_二茂铁的合成及其与牛血清白蛋白的相互作用

酞菁铁Ⅱ与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究钟平;刘海东【摘要】研究酞菁铁Ⅱ与牛血清白蛋白的相互作用，测定了二者相互作用的荧光光谱和紫外可见光谱•荧光光谱分析表明，随着酞菁铁Ⅱ浓度的增加，后者在345 nm处荧光有规律的发生猝灭现象•根据Stern▬VoLmer方程可以计算得到两者相互作用的猝灭常数为1•25×104，结合位点数为1•由紫外可见光谱可知，随着酞菁铁Ⅱ浓度的增加，牛血清白蛋白在210 nm处吸光度有所上升，峰位发生红移•%The fluorescence spectrum and UV▬visible spectrum are tested by the interaction of Iron Phthalocyanine II and Bovine Serum Albumin• The fluorescence spectrum shows that with the increase of the density of Iron Phthalocyanine,the latterˊs fluorescence quenches regularly at 345 nm• Calculating by the Stern▬VoLmer equation,the quenching constant of the interaction is 1•25 × 10,and the number of binding sites is 1• UV▬visible spectrum shows that with the increase of the density of Iron Phthalocyanine,Bovine Serum Albuminˊs absorbance increa ses at210nm,itˊpeak position red shifts•【期刊名称】《赣南师范学院学报》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】3页(P39-41)【关键词】酞菁铁Ⅱ;牛血清白蛋白;光谱研究【作者】钟平;刘海东【作者单位】赣南师范学院化学化工学院，江西赣州 341000;赣南师范学院化学化工学院，江西赣州 341000【正文语种】中文【中图分类】TS201•1光动力治疗［1］在癌症及其它疾病的治疗中具有独特的优势，光敏剂是光动力治疗中的关键因素．具有理想的光物理化学性质和组成结构明确等特点．酞菁配合物［2］作为新一代抗癌光敏药物的应用引起了广泛的关注．白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，研究酞菁光敏剂与白蛋白的结合情况，对于深入了解光敏剂的作用机理有重要意义，同时也可为光敏剂的结构化提供指导．而目前两者的相互作用的研究很少见报道．对称的酞菁化合物与白蛋白发生的是非共价相互作用［3］．本文用荧光光谱研究了二者相互作用，得到酞菁铁Ⅱ对牛血清白蛋白的Stern-VoLmer［4］猝灭常数和结合位点数，并且用紫外可见光谱分析了酞菁铁Ⅱ对牛血清白蛋白的吸收强度和吸收波长的影响．1 材料与方法1．1 仪器和试剂牛血清白蛋白(BSA，98%)上海化学试剂公司;酞菁铁Ⅱ自制;N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、邻苯二甲酸酐、尿素、氯化铁、四水钼酸铵均为分析纯，上海试剂总厂;蒸馏水．WGY－10分子荧光光度计天津市港东科技发展有限公司;UV－4510S紫外可见分光光度计天津市港东科技发展有限公司．1．2 实验方法1．2．1 酞菁铁Ⅱ合成［5－7］称取5 g邻苯二甲酸酐、12 g尿素、5 g氯化铁和0．3 g四水钼酸铵，置于研钵中研细并混合均匀后，加入到干燥的三口烧瓶中，三口烧瓶中间口接冷凝管，侧口通入氮气保护．缓慢加热至140℃时，苯酐与尿素熔化，充分搅拌后再继续升温至220℃，恒温2 h，然后冷却至室温．将产物依次用盐酸、去离子水和氢氧化钠溶液浸渍洗涤，再用布氏漏斗抽滤压干，最后用乙醇洗洗涤滤饼，抽滤后于100℃烘干，得到蓝黑色的固体产物，即为酞菁铁Ⅱ．1．2．2 溶液的配制室温下，称取0．056 8 g酞菁铁Ⅱ溶解于DMF中，定容于100 mL容量瓶中，浓度为1．0×10－3mol/L，并保存在试剂瓶中待用．再取10 mL该溶液于100 mL容量瓶中，以DMF定容，得到1．0×10－4moL/L的酞菁铁Ⅱ溶液．分别称取3．763 0 g Na2HPO4、0．884 5 g KH2PO4和2．992 0 g NaCl用蒸馏水溶解定容于500 mL容量瓶中，得到Na2HPO4－KH2PO4－NaCl缓冲溶液，pH 为7．4．将配好的缓冲溶液保存在试剂瓶中待用．称取0．6640 g BSA固体，用缓冲溶液溶解并定容于100 mL容量瓶中，浓度为2．0×10－5moL/L，置于冰箱中保存待用．1．2．3 分子荧光光谱测定准备7个25 mL的容量瓶，先于每个容量瓶中加入5 mL浓度为2．0×10－5moL/L牛血清白蛋白溶液，然后分别加入0．00 mL、0．25 mL、0．50 mL、1．00 mL、1．50 mL、2．00 mL、2．50 mL 1．0 ×10－4moL/L 酞菁铁Ⅱ溶液，用pH=7．4的Na2HPO4－KH2PO4缓冲溶液分别定容至25 mL．并且标号0－6．分别测定0号空白样的分子激发光谱和分子发射光谱，确定其最大激发波长和最大发射波长．以最大激发波长光源测定0～6号样品的最大发射波长的光强度F．1．2．4 紫外可见光谱的测定准备7个25 mL的容量瓶，首先于每个容量瓶中加入5 mL 2．0×10－5moL/L 牛血清白蛋白溶液，然后分别往 7 个容量瓶中加入0．00 mL、0．25 mL、0．50 mL、1．00 mL、1．50 mL、2．00 mL、2．50 mL 浓度为 1．0 ×10 －4 moL/L酞菁铁Ⅱ溶液，用pH=7．4的Na2HPO4－KH2PO4缓冲溶液分别定容至25 mL．分别测定其紫外可见光谱，导出每次测定数据的txt文件．然后用origin软件做出其光谱图．2 结果与分析2．1 牛血清白蛋白和酞菁铁Ⅱ的荧光光谱含有荧光芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的蛋白质具有内源荧光［8］．图1、图2表明，0号空白样BSA的激发波长为283 nm时，最大荧光发射峰的波长为338 nm．由此测得0号空白样荧光强度F0为83．1，1～6号样的荧光强度F见表1．当荧光体与猝灭剂由于热运动发生碰撞时，可引起荧光体的荧光动态猝灭［9－10］．这种动态猝灭服从Stern-VoLmer方程:其中:F0和F分别为加入猝灭剂前后的荧光强度，Ksv称为Stern-VoLmer猝灭常数，［Q］是猝灭剂的浓度，n为结合位点数．图1 BSA的激发光谱图2 BSA的发射光谱Num n(FePcⅡ)∶n(BSA) CBSAmol/L CFePcⅡ moL/L F 0 2．0 ×10－5083．1 1 2∶1 2．0 ×10－5 1．0 ×10－5 74．4 2 1∶1 2．0 ×10－5 2．0 ×10－5 68．8 3 1∶2 2．0 ×10－5 4．0 ×10－5 57．9 4 1∶3 2．0 ×10－5 6．0 ×10－5 50．6 5 37．8 1∶4 2．0 ×10－5 8．0 ×10－5 43．6 6 1∶5 2．0 ×10－51．0 ×10－4表1 BSA和FePcⅡ的浓度和相互作用的荧光强度由表1得到Lg((F0－F)/F)和Lg［Q］的线性关系由线性方程可得酞菁铁和牛血清白蛋白相互作用的结合位点数n约为1，Stern-VoLmer猝灭常数为1．25×104．2．2 牛血清白蛋白和酞菁铁Ⅱ的紫外可见光谱按照试验方法，保持溶液的pH7．4，温度20℃．按照测定荧光光谱同样的浓度配制溶液．测定其紫外可见光谱得到数据见图3．图3表明，BSA结合物在190 nm～250 nm范围内有较强吸收，随着FePcⅡ浓度增大(如图中箭头所示)，BSA 的吸光强度也增大，且呈现缓慢递增．短波方向基本没有变化，吸收曲线向长波方向扩张，有红移的趋势．说明酞菁铁Ⅱ和牛血清白蛋白之间发生了相互作用，但这种作用仅仅是非共价相互作用．210 nm左右的峰主要反映BSA二级螺旋结构［11］状况，说明BSA主链构象发生变化，即螺旋结构变紧密［12］．3 结论图3 BSA和FePcⅡ相互作用的紫外可见光谱荧光光谱分析表明，随着酞菁铁Ⅱ浓度的增加，BSA在345 nm处发生有规律的荧光猝灭现象．根据Stern-VoLmer方程可以计算得到两者相互作用的猝灭常数为1．25×104，结合位点数为1．由紫外可见光谱可知，随着酞菁铁Ⅱ浓度的增加，牛血清白蛋白在210 nm处吸光度有所上升，峰位发生红移．说明酞菁铁Ⅱ和牛血清白蛋白之间发生了相互作用，但这种作用仅仅是非共价相互作用．参考文献:【相关文献】［1］淡克娜，熊霞．5－氨基酮戊酸光动力治疗在皮肤科临床应用的研究进展［J］．西南军医，2013，(1):123－126．［2］黄剑东．不同激光波长下ZnPcSP的光敏化能力和抗癌活性［J］．物理化学学报，1997，13(3):247－251．［3］温进昆，韩梅．医学分子生物学理论与研究技术［M］．北京:科学出版社，1999:219．［4］林燕，赖晓绮，李蕾．稀土离子(Ⅲ)与牛血清白蛋白结合作用的荧光光谱分析［J］．赣南师范学院学报，2001，(6):45－48．［5］徐新宏，陈大俊．酞菁铁的微波法合成及表征［J］．化学世界，2010，(4):210－213．［6］李洋，王中华，魏群．四(3’－羧基丙酰胺基)酞菁铁的合成及其性质研究［J］．西华师范大学(自然科学版)，2012，33(2):233－245．［7］刘鹏，吴钟睛，周伟伟，等．酞菁铁的模板合成及其对氧还原的电催化性能［J］．长沙理工大学学报(自然科学版)，2012，9(2):92－95．［8］郭维，郑绿茵，吴勇权，等．光谱法研究硝柳胺与阳孔戚血蓝蛋白的相互作用［J］．分析化学，2009，37(3):378－382．［9］肖荣平，张娜，黄剑东，等．白蛋白对单取代酞菁锌光谱性质和存在状态的影响［J］．光谱学与光谱分析，2011，31(4):1052－1056．［10］成国珍，许金梅．荧光分析法［M］．(第2版)．北京:科学出版社，1990:112－132．［11］王亚俐，王海芳．光谱法研究苯甲酸钠与牛血清白蛋白的作用［J］．北京大学学报(自然科学版)，2002，38(2):159－163．［12］郭尧君．分光光度技术及其在生物化学中的应用［M］．北京:科学出版社，1987:230．。

齐墩果酸及衍生物与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析张天星;黄伟;黄雪玉;廖安平【期刊名称】《中国药科大学学报》【年(卷),期】2017(48)5【摘要】通过化学修饰改善齐墩果酸与牛血清白蛋白的相互作用,从而提高两者之间的结合能力。

以齐墩果酸为先导物,分别对其C-3位羟基和C-28位的羧基进行修饰,得到4种不同的衍生物,并用IR和~1H NMR进行结构表征。

采用荧光光谱法,研究了齐墩果酸及4种衍生物与牛血清白蛋白的相互作用规律,以及温度和Cu^(2+),Co^(2+)等金属离子对两者之间的相互作用的影响。

与齐墩果酸相比,4种衍生物与牛血清白蛋白的相互作用都有提高,其中衍生物OA_2与牛血清白蛋白的相互作用提高了近16倍。

Cu^(2+)和Co^(2+)等金属离子能明显增强衍生物OA_2与牛血清白蛋白间的相互作用。

化学修饰是提高齐墩果酸与BSA之间的相互作用的有效途径。

【总页数】5页(P572-576)【关键词】齐墩果酸;衍生物;牛血清白蛋白;相互作用;荧光光谱法【作者】张天星;黄伟;黄雪玉;廖安平【作者单位】广西民族大学广西多糖材料与改性重点实验室培育基地/广西高校化学与生物转化过程新技术实验室【正文语种】中文【中图分类】R914;R965【相关文献】1.山梨酸钾与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 [J], 雷海英;乔栋娟;王志军2.头孢噻肟钠和氯霉素与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 [J], 刘保生;王晶;薛春丽;杨超;吕运开3.L-半胱氨酸与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 [J], 徐大玮;毕玉琦4.槲皮素镧配合物与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 [J], 周菊峰;胡钞粟;蒋建宏;王艳兰;肖碧源;肖圣雄;李强国5.Fe3+离子与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 [J], 郝长春;徐国庆;王天月;冯盈;亓翠玉;高峰;孙文远;孙润广因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

二茂铁衍生肽的合成、表征及其与β-淀粉样蛋白的相互作用的开题报告摘要：β-淀粉样蛋白（Aβ）是阿尔茨海默病的主要致病因素之一，因此，开发具有高选择性和亲和力的Aβ靶向化合物是治疗阿尔茨海默病的一个重要策略。

二茂铁衍生肽是一类含有二茂铁基团的肽分子，已被证明具有显著的抗氧化和抗炎作用。

在本研究中，我们将合成二茂铁衍生肽（MTS）并评估其与Aβ的相互作用。

预计本研究的结果将为开发新型Aβ靶向药物提供重要的参考。

关键词：二茂铁衍生肽；β-淀粉样蛋白；相互作用；药物开发。

引言：阿尔茨海默病是一种神经系统退行性疾病，其主要影响老年人。

现在已经发现，β-淀粉样蛋白（Aβ）是阿尔茨海默病的主要致病因素之一，其在脑内沉积的程度与疾病的严重程度相关。

因此，开发具有高选择性和亲和力的Aβ靶向化合物是治疗阿尔茨海默病的一个重要策略。

二茂铁衍生肽（MTS）是一类含有二茂铁基团的肽分子，已被证明具有显著的抗氧化和抗炎作用。

它们的分子结构可以通过调整侧链上的化学基团进行个性化设计。

有研究表明，MTS通过其二茂铁基团与氧自由基结合，并进一步对氧自由基进行电子转移，从而发挥抗氧化作用。

此外，MTS还能通过抑制促炎基因的表达来发挥其抗炎作用。

在本研究中，我们将合成不同结构的MTS，并评估其与Aβ的相互作用。

通过比较不同结构的MTS与Aβ的结合亲和力和选择性，我们将确定最佳MTS结构，以作为开发新型Aβ靶向药物的基础。

实验方法：合成二茂铁衍生肽通过基于Fmoc化学的固相合成技术合成MTS。

在固相芯片上引入二茂铁侧链，通过化学反应依次引入其他氨基酸侧链，并分别去除Fmoc保护基。

表征MTS使用高效液相色谱（HPLC）对MTS进行纯度验证，使用质谱技术对MTS的分子量进行确定。

评估MTS与Aβ的结合使用生物传感技术测定MTS与Aβ的结合常数（Kd）。

结果：预计成功合成不同结构的MTS，并进行HPLC和质谱分析进行纯度验证和分子量确定。

学 号 0908014127分 类 号 密 级 公开作者姓名 指导教师 学科门类 提交论文专业名称 成绩评定摘要摘要采用荧光光谱法研究了不同温度下金属离子Fe2+、Zn2+对原花青素和牛血清白蛋白(BSA)之间相互作用的影响。

实验结果表明，不存在金属离子时，原花青素对BSA的荧光猝灭过程为静态猝灭，在Fe3+ 或Zn2+的存在下，原花青素和牛血清白蛋白相互作用的峰逐渐降低，说明了这两种金属离子可以增大原花青素对BSA的猝灭，并且随着原花青素浓度的增加，猝灭的效果越明显。

关键词：金属离子；荧光光谱；原花青素；牛血清白蛋白AbstractAbstractEffects of metal ions Fe2+, Zn2+ of proanthocyanidins and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy at different temperatures (BSA) influence the interaction between. The experimental results show that, there is no metal ion, fluorescence quenching process of proanthocyanidins on BSA is a static quenching procedure in Fe3+ or the presence of Zn2+, the interaction of proanthocyanidins and bovine serum albumin was gradually reduced, and show that the two kinds of metal ions can increase the procyanidins quenching of BSA, and with the increase of proanthocyanidins concentration quenching effect more obvious.Key words: Metal ion;fluorescence spectrophotometry; procyanidins;bovine serum albuminAbstract目录摘要 (I)目录 (Ⅲ)前言 (1)1 文献综述 (1)1.1原花青素 (2)1.2牛血清白蛋白 (3)1.3药物小分子与大分子的相互作用的研究现状 (3)1.3.1 药物小分子与大分子的相互作用模式 (3)1.3.2 分析方法及进展 (3)2 实验部分 (6)2.1药品试剂与仪器设备 (6)2.1.1 药品试剂 (6)2.1.2 仪器设备 (6)2.2实验步骤 (6)3 结果与讨论 (7)3.1白杨素对BSA的猝灭作用 (7)3.1.1 猝灭光谱 (7)3.1.2 测定结合常数以及猝灭机理 (7)3.1.3 研究作用力类型及热力学性质 (8)3.2 Fe2+对原花青素与BSA的相互作用的影响3.2.1 荧光猝灭光谱图.................................................................. 错误！未定义书签。

二茂铁-谷胱甘肽的合成及电化学应用的开题报告一、研究背景谷胱甘肽(glutathione，GSH)是生物体内普遍存在的一种三肽，它的分子式为C10H17N3O6S，其抗氧化、解毒和抗癌等活性在生物学、医药学领域中得到广泛应用。

而二茂铁(Ferrocene，Fc)则是电化学研究中的重要材料，因其化学稳定性和强氧化还原性能，在电化学传感器、催化剂、电池等领域均有广泛应用。

将谷胱甘肽与二茂铁结合起来，能够把它们各自优异的属性整合在一起，产生协同作用，形成一种新型的功能材料，为电化学领域中的传感器、催化剂等提供新的思路。

二、研究内容本文将探讨二茂铁-谷胱甘肽的有机合成方法，并采用电化学方法对其性能进行表征和研究。

1. 合成方法本文将采用N,N-二丙基甲酰胺(DMF)为溶剂，通过缩合反应将二茂铁-谷胱甘肽合成。

其中，谷胱甘肽的羧基将和二茂铁上的氨基进行缩合反应，得到二茂铁-谷胱甘肽。

2. 表征方法采用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)对合成的二茂铁-谷胱甘肽进行形态、粒径等表征；采用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)和荧光光谱对其吸收和发射光谱进行表征；采用电化学方法对其电化学性质进行研究。

三、研究意义本文制备的二茂铁-谷胱甘肽材料具有双重氧化还原性，能够响应外界电子的变化，是一种有潜力的传感器材料。

一方面，通过调节材料中二茂铁和谷胱甘肽之间的比例，可以调节其电子传输的性质，优化其传感性能；另一方面，可以利用谷胱甘肽的生物活性，将其应用于生物传感领域中，如检测谷胱甘肽的生物合成和代谢等。

四、研究计划1. 合成方法的优化通过改变缩合反应中的反应物比例、反应温度等条件，优化合成二茂铁-谷胱甘肽的方法。

2. 材料性质的表征采用SEM、TEM、UV-Vis、荧光光谱等方法对制备的材料进行详细的表征和分析，确定其性质。

3. 电化学性质的研究采用循环伏安法、交流阻抗法等电化学方法，研究材料的电化学性质，探究其氧化还原反应机制和传感性能。

谷胱甘肽-二茂铁的合成及其与牛血清白蛋白的相互作用王芳斌彭勇范美意刘又年*黄可龙*(中南大学化学化工学院,长沙410083)摘要：采用液相合成法,以O -苯并三唑-N ,N ,N ′,N ′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和1-羟基苯并三氮唑(HOBT)为缩合剂,将二茂铁胺和还原型谷胱甘肽(GSH)反应,合成了具有电化学活性的谷胱甘肽-二茂铁(GSH -Fc),其收率为23.2%,并对目标产物进行了红外、核磁、质谱表征.通过电化学方法研究了GSH -Fc 与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用特性.电化学实验结果表明,BSA 和GSH -Fc 结合位点位于BSA 的亚结构域IIA,结合常数为1.71×106L ·mol -1,结合位点数为1.30.同时通过荧光光谱法研究了GSH -Fc 与BSA 相互作用是一种静态猝灭的过程,结合常数和结合位点数分别为2.74×106L ·mol -1和1.57,与电化学方法得到的结果相吻合.关键词：谷胱甘肽-二茂铁;牛血清白蛋白;相互作用;电化学;荧光光谱中图分类号：O641Synthesis of Glutathionyl Ferrocene and Its Interaction withBovine Serum AlbuminWANG Fang -BinPENG YongFAN Mei -YiLIU You -Nian *HUANG Ke -Long *(College of Chemistry and Chemical Engineering,Central South University,Changsha 410083,P.R.China )Abstract ：Glutathionyl ferrocene (GSH -Fc)was synthesized from glutathione and ferrocenyl amine using O -(benzotriazol -yl)-N ,N ,N ′,N ′-tetramethyluronium (HBTU)/1-hydroxybenzotrizole (HOBT)as coupling agents in solution with a yield of 23.2%.The compound was characterized by 1H -NMR,IR and MS.Interactions of bovine serum albumin (BSA)with glutathionyl ferrocene were investigated by electrochemical methods.Experimental results revealed that there were specific interactions between BSA and GSH -Fc at the IIA subdomain.The binding constant and binding sites were obtained by linear sweep voltammetry and had values of 1.71×106L ·mol -1and 1.30,respectively.Fluorescence spectroscopy methods were employed to investigate the interaction between GSH -Fc and BSA as well.Results showed that the fluorescence of BSA was quenched by GSH -Fc during a static quenching process.The binding constant and the number of binding sites were obtained and had values of 2.74×106L ·mol -1and 1.57,respectively,which agreed well with results from electrochemical experiments.Key Words ：Glutathionyl ferrocene;BSA;Interaction;Electrochemistry;Fluorescence spectroscopy[Article]物理化学学报(Wuli Huaxue Xuebao )Acta Phys.-Chim.Sin .,2009,25(6)：1125-1130Received:January 19,2009;Revised:February 24,2009;Published on Web:March 31,2009.*Corresponding authors.Email:liuyoun@,klhuang@;Tel:+86731-8836964.国家自然科学基金(20676153,20876179)资助项目鬁Editorial office of Acta Physico -Chimica Sinica生物分子的识别及相互作用是生命的基础,研究和分析生物分子识别、相互作用机理及分子结构和功能之间的关系是阐明生命活动规律的关键,尤其是研究小分子与蛋白质的相互作用在生命活动的研究中具有重要意义.谷胱甘肽是生物活性肽,广泛存在于生物体内,对生物的生理活动起着重要的作用[1].血清白蛋白(SA)是人体及动物体内最重要的蛋白之一,在体内主要起着小分子、药物分子、有机化合物及其他代谢物的运输和代谢作用,可以和许多内、外源物质广泛结合,在维持体液的正常分布、保持血容量及血压等方面起着重要作用.牛血清白蛋白(BSA)与人血清白蛋白(HSA)具有类似的结构June 1125Acta Phys.-Chim.Sin.,2009Vol.25和功能,也是目前研究最多的血清白蛋白[2,3].因此,研究BSA 与GSH 的相互作用对诠释小分子与蛋白质的相互作用有着重要的意义.电化学方法具有快速、灵敏、简单的特点,近年来,在生物分析领域得到了长足的进步[4].但是大多数多肽或蛋白质没有电化学活性,限制了这种方法的应用.通常将具有电化学活性的分子链接在多肽、蛋白质或DNA 上,使其具有电化学活性.二茂铁具有良好的电化学特性和独特的夹心型结构,且易与多肽、蛋白质和DNA 等生物分子发生共轭反应,因此,常被用来作为生物电化学探针[5-9].特别是二茂铁-多肽化合物,近年来在蛋白质分子的识别[10]、离子的检测[11,12]、特定序列DNA 片断的分析[13-15]等领域取得了很大的进展.针对谷胱甘肽不具有电化学活性这一缺陷,本研究将电化学活性的二茂铁与其结合,通过电化学方法研究GSH 与蛋白质的相互作用,并辅以荧光光谱方法对结果进行了验证.研究结果为谷胱甘肽-二茂铁这种新型的电化学探针的研发提供有关参数.1实验部分1.1试剂与仪器牛血清白蛋白(BSA),还原型谷胱甘肽(GSH,纯度>98%),N -羟基琥珀酰亚胺(NHS),巯基十一酸(MUA),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),磷酸氢二钾和磷酸二氢钾购自Sigma 公司;三乙胺(Et 3N),O -苯并三唑-N ,N ,N ′,N ′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU),1-羟基苯并三氮唑(HOBT)和二碳酸二叔丁酯(Boc 酸酐)购自上海生工生物工程技术有限公司;二茂铁,叠氮化钠购自上海金山化工有限公司;氯甲酸乙酯购自湖南师范大学化学试剂厂;其他有机试剂均为分析纯试剂,所用水均为二次蒸馏水.INOVA -400核磁共振仪(美国Varian 公司);AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet 公司);LCQ Advantage 离子阱质谱仪(美国菲尼根公司);CHI660B 电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);F -2500荧光分光光度计(日本日立公司).1.2实验步骤1.2.1二茂铁胺及谷胱甘肽-二茂铁合成参考Rapic 等[16]以二茂铁为原料合成二茂铁二甲酸的方法,采用二茂铁为原料,合成了二茂铁单甲酸.然后,以二茂铁单甲酸为原料,依照我们研究的合成方法[17],合成二茂铁胺,并将其与GSH 反应,合成了谷胱甘肽-二茂铁(GSH -Fc),其合成路线见图1.称取3.0g 二茂铁甲酸(化合物1)溶于3mL 水和10mL 丙酮的混合溶液中,冷却至0℃后,滴加2.1mL 三乙胺和36mL 丙酮组成的溶液,再加入1.16mL 氯甲酸乙酯和6.6mL 丙酮的混合溶液.搅拌30min,将1.32g NaN 3溶于4.8mL 水后滴入反应体系.反应结束后,将溶液倒入过量的冰水中,用CH 2Cl 2萃取,将有机相蒸干后得到红褐色晶体叠氮羰基二茂铁1.1g(化合物2).将50mL 叔丁醇加至圆底烧瓶中,搅拌,加入0.97g 化合物2,加热至80℃回流反应1.5h.反应图1谷胱甘肽-二茂铁(GSH -Fc)的合成Fig.1Synthesis of gluthione -ferrocene(GSH -Fc)Et 3N:triethyl amine,t -BuOH:tert -butanol,(Boc)2O:anhydride di -tert -butyl pyrocarbonate,HBTU:O -(benzotriazol -yl)-N ,N ,N ′,N ′-tetramethyluronium,HOBT:1-hydroxybenzotrizole'1126No.6王芳斌等：谷胱甘肽-二茂铁的合成及其与牛血清白蛋白的相互作用完毕后取出溶液蒸干,用柱层析法进行纯化,展开剂二氯甲烷/己烷/乙酸乙酯的体积比为8∶1∶5,得橘红色固体叔丁基氧-氨基二茂铁0.73g(化合物3).将0.43g化合物3溶于乙酸乙酯溶液中,然后在0℃通干燥的HCl气体1h,再在室温下反应0.5 h,最后蒸干得到红褐色的二茂铁胺固体0.27g(化合物4).取0.76g NaHCO3于圆底烧瓶中,在5℃下用蒸馏水溶解得NaHCO3的饱和溶液,另外取0.48g (Boc)2O,将其溶解于大约30mL二氧六环中,将上述两种溶液混合;然后称0.614g GSH加入以上混合液.反应12h后,用乙酸乙酯萃取,取油相,用无水硫酸钠干燥,过滤,蒸干即可得到白色晶体0.53g (化合物5).取0.32g化合物5于干燥的圆底烧瓶中,用无水CH2Cl2溶解.在0℃下加入1.0mL Et3N,再加入0.42g HBTU和0.11g HOBT.反应1h后,加入0.30g化合物4,1.0mL Et3N,反应2h后移入室温反应12h.反应完毕后,依次用NaHCO3饱和溶液, 0.5mol·L-1的盐酸,NaHCO3饱和溶液和水萃取;用无水硫酸钠干燥油相,过滤,蒸干,用柱层析法对粗产物进行纯化,以CH2Cl2/EtOAc/MeOH体积比为30∶10∶1的混合溶剂为展开剂,得0.34g黄色的目标产物6,其收率为23.2%.1H-NMR(δ):6.78(brs, H,NH),6.23(brs,2H,NH),4.62(s,2H;H-2′,H-5′, Fc),4.49(s,5H;Fc unsubst),4.20(s,2H;H-3′,H-4′,Fc), 1.96(d,9H,CH3),1.65(s,3H).IR(cm-1,MeOH):3436 (—NH),2851(—SH),1653(C襒O),1021(C—O—C); MS(EI),m/z:590.5[M+H]+.1.2.2MUA-BSA修饰电极用0.05μm的Al2O3抛光裸金电极,二次水清洗,超声,用氮气吹干.将干净的金电极浸泡在4.0mmol·L-1MUA(11-巯基十一烷酸)的乙醇溶液中,密封,室温下静置18h,取出,先用乙醇溶液冲洗,再用水冲洗, N2吹干.在MUA修饰后的金电极表面滴加含有5.0 mmol·L-1EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳酰二亚胺)和5.0mmol·L-1NHS的磷酸缓冲溶液(PBS),反应1h后,用二次蒸馏水清洗电极,N2吹干后再与5.0mmol·L-1的牛血清蛋白反应4h得到MUA-BSA修饰电极,以备电化学测试.1.2.3电化学实验以金电极或修饰电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极,测试循环伏安(CV)特性.测定前电解池通入10min N2除氧,扫描速率0.1V·s-1.1.2.4荧光光谱实验将BSA溶于PBS缓冲溶液中,固定BSA浓度为50μmol·L-1,改变GSH-Fc浓度,以PBS缓冲溶液定容,静置30min.激发波长λex=280nm,激发和发射狭缝宽度均为2.5nm,扫描速率为300nm·min-1,在290-450nm范围内测定并记录荧光发射光谱.2结果与讨论2.1电化学方法2.1.1MUA-BSA修饰电极在扫描速率为0.1V·s-1,支持电解液为0.1mol·L-1的KClO4的PBS(pH=7.4)溶液中,MUA-BSA修饰电极在-0.2-0.6V内没有出现氧化还原峰(图2曲线a),而在0.1mol·L-1GSH-Fc溶液中,在-0.2-0.6V范围内出现一对氧化还原峰,E pa=0.213V,E pc= 0.150V,ΔE=0.063V,I pc/I pa=1.038(见图2曲线c),该氧化还原峰是由GSH-Fc中二茂铁基团发生氧化还原而产生的.但是MUA-BSA修饰电极在0.1mol·L-1二茂铁甲酸溶液的CV曲线如图2曲线b所示,表明二茂铁与BSA没有相互作用.由上述可知,由于GSH与BSA具有相互作用,二茂铁基团的电子才能通过MUA-BSA修饰电极进行电子的转移.同时研究了MUA-BSA修饰电极在GSH-Fc溶液中峰电流与扫描速率的关系,结果表明,峰电流与扫描速率的平方根(v1/2)呈线性关系,该电极反应受扩散步骤控制.图2MUA-BSA修饰电极在不同溶液中的循环伏安曲线Fig.2Cyclic voltammetry curves of MUA-BSA modified electrode in different solutions(a)0.1mol·L-1PBS(phosphate-buffered saline),(b)0.1mol·L-1Fc-COOH,(c)0.1mol·L-1GSH-Fc1127Acta Phys.-Chim.Sin.,2009Vol.252.1.2电化学测定GSH-Fc与BSA的结合位点BSA具有两个高亲合结合位点亚结构域IIA 和亚结构域IIIA,而华法林(warfarin)和布洛芬(ibuprofen)分别与亚结构域IIA和亚结构域IIIA有高结合性[18],同时BSA还有一个游离的巯基,而碘代乙酰胺常用来封闭-SH[19].因此为了研究BSA与GSH的结合位点,将MUA-BSA修饰电极浸泡在华法林、布洛芬和碘代乙酰胺溶液中,分别用来封闭BSA的亚结构域IIA、亚结构域IIIA和-SH,然后将处理的电极在GSH-Fc溶液中测得的CV曲线如图3所示.由图可知,布洛芬和碘代乙酰胺封闭后的BSA修饰电极电化学行为未发生变化,而经华法林封闭后,该修饰电极在GSH-Fc溶液中的氧化还原峰在-0.2-0.6V内消失,由此可知,GSH-Fc和华法林与BSA的相互作用在同一个结合位点,位于亚结构域IIA.2.1.3电化学法测定GSH-Fc与BSA的结合参数在GSH-Fc溶液中加入BSA,阳极峰电流降低.参考Li等[20]的方法,假设BSA有n个相同且独立的结合位点,与GSH-Fc形成化合物BSA-n GSH-Fc,即:BSA+n GSH-Fc葑BSA-n GSH-Fc(1)条件平衡常数K=c(BSA-n GSH-Fc)/[(c(GSH-Fc))n×c(BSA)](2)因为,c0(BSA)=c(BSA)+c(BSA-n GSH-Fc)(3)ΔI max=kc BSA(4)ΔI=kc(BSA-n GSH-Fc)(5)所以,lg[ΔI/(ΔI max-ΔI)]=lg K+n lg[GSH-Fc](6)ΔI为GSH-Fc溶液与其加到BSA溶液中的阳极峰电流强度差值,ΔI max为ΔI的最大值.固定BSA的浓度为20μmol·L-1,逐渐改变GSH-Fc的浓度,用线性扫描伏安法(LSV)测得阳极峰电流与GSH-Fc浓度关系如图4A所示.由图可以看出,GSH-Fc溶液阳极峰电流强度以及GSH-Fc与BSA混合后阳极峰电流强度都与GSH-Fc浓度成正比.当GSH-Fc浓度低于35μmol·L-1时,ΔI与GSH-Fc浓度具有较好的线性关系,但是当GSH-Fc 浓度高于30μmol·L-1时,ΔI趋向稳定.由图4B中lg[ΔI/(ΔI max-ΔI)]和lg[GSH-Fc]的线性关系可以得到GSH-Fc与BSA的结合常数(条件平衡常数)K为1.71×106L·mol-1,结合位点数n为1.30.图3GSH-Fc在封闭后的MUA-BSA修饰电极上的循环伏安曲线Fig.3Cyclic voltammetry curves of GSH-Fc at themodified electrode of blocked MUA-BSA(a)iodoacetamide,(b)ibuprofen,(c)warfarin图4GSH-Fc溶液中加入20μmol·L-1BSA前(a)后(b)阳极峰电流及其变化量(c)与GSH-Fc浓度关系(A)及lg[ΔI/(ΔI max-ΔI)]与lg[GSH-Fc]的线性拟合(B)Fig.4GSH-Fc anodic peak currents vs GSH-Fc concentration in the absence(a)and presence(b)of20μmol·L-1 BSA and the difference(c)between curves a and b(A),and the plot of lg[ΔI/(ΔI max-ΔI)]vs lg[GSH-Fc](B) 1128No.6王芳斌等：谷胱甘肽-二茂铁的合成及其与牛血清白蛋白的相互作用2.2荧光光谱方法测定GSH-Fc与BSA反应的结合常数和结合位点数固定BSA的浓度为50μmol·L-1,逐渐增加GSH-Fc溶液浓度,测量体系荧光发射光谱,如图5A 所示.由图可知,随着GSH-Fc浓度的增大,BSA荧光强度逐渐降低,因此GSH-Fc对BSA具有荧光猝灭作用.根据Stern-Volmer方程[21],F0F=1+k qτ0[Q]=1+K SV[Q](7)式中,F0和F分别为未加猝灭剂时的荧光强度和加入猝灭剂后的荧光强度,[Q]为猝灭剂浓度,τ0为猝灭剂不存在时荧光分子平均寿命,k q为动态荧光猝灭速率常数,K SV为Stern-Volmer动态猝灭常数.由方程(7)可得k q=2.2×1012,远远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2.0×1010L·mol-1·s-1这一数值[22];因此可以确定GSH-Fc对BSA荧光猝灭过程不是由扩散控制的动态猝灭过程,而是一种静态猝灭的过程.静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发荧光的配合物,从而导致荧光物质荧光强度降低的过程[23].荧光体与静态猝灭剂Q间的猝灭反应可表示为[24]lg F0-FF=lg K0+n lg[Q](8)式中K0为结合常数,n为结合位点数.以lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作线性拟合,得到其线性相关系数为0.997,线性拟合方程为lg F0-F=6.439+1.57lg[Q](9)通过计算得到GSH-Fc与BSA反应的结合常数K0= 2.74×106L·mol-1,结合位点数n=1.57.3结论采用液相合成法,合成了具有电化学活性的GSH-Fc.通过电化学方法研究了GSH-Fc与BSA之间的相互作用.BSA和GSH-Fc结合位点位于BSA 的亚结构域IIA,结合常数为1.71×106L·mol-1,结合位点数为1.30.同时通过荧光光谱法验证了这种相互作用,结果表明,GSH-Fc与BSA相互作用是一种静态猝灭的过程,结合常数和结合位点数分别为2.74×106L·mol-1和1.57.与电化学方法得到的结果相吻合.GSH-Fc可作为电化学探针用于研究谷胱甘肽分子与蛋白质(酶)、DNA等生物分子的相互作用,相关工作正在进行中.References1Trapani,A.;Garcia-Fuentes,M.;Alonso,M.J.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2006,64:1462Zsila,F.;Bikadi,Z.;Simonyi,M.Biochem.Pharmacol.,2003,65: 4473Guo,M.;Yan,J.W.;Yu,Q.S.;Shang,Z.C.;Lü,J.D.Acta Phys.-Chin.Sin.,2004,20:202[郭明,严建伟,俞庆森,商志才,吕建德.物理化学学报,2004,20:202]4Wang,J.;Li,M.;Shi,Z.;Li,N.;Gu,Z.Electroanalysis,2004,16: 1405Staveren,D.R.;Metzler-Nolte,N.Chem.Rev.,2004,104:59316Zhang,R.;Wang,Z.;Wu,Y.;Fu,H.;Yao,.Lett.,2008,10:图5不同GSH-Fc浓度时BSA的荧光猝灭光谱图(A)及(F0-F)/F与GSH-Fc浓度关系(B)Fig.5Fluorescence emission spectra of BSA in the presence of different concentrations of GSH-Fc(A)andthe plot of(F0-F)/F vs[GSH-Fc](B)F0and F are the relative fluorescence intensities before and after the addition of GSH-Fc to the BSA solutions.[GSH-Fc]/(μmol·L-1):a)0,b)20,c)40,d)60,e)80,f)100,g)120,h)140,i)160,j)1801129Acta Phys.-Chim.Sin.,2009Vol.2530657Deng,X.H.;Kan,X.W.;Yu,Y.;Zhang,W.Z.;Liu,H.Y.;Fang,B.Acta Phys.-Chin.Sin.,2005,21:1399[邓湘辉,阚显文,尉艳,张文芝,刘红英,方宾.物理化学学报,2005,21:1399]8Appoh,F.E.;Thomas,D.S.;Kraatz,H.-B.Macromolecules, 2006,39:56299Chen,C.H.;Li,H.;Zhu,W.;Zhang,Q.X.Acta Phys.-Chin.Sin., 2005,21:1067[陈灿辉,李红,朱伟,张全新.物理化学学报,2005,21:1067]10Plumb,K.;Kraatz,H.B.Bioconjugate Chem.,2003,14:60111Wang,F.B.;Fan,M.Y.;Liu,Y.N.;Wang,J.X.;Zeng,D.M.;Huang,K.L.J.Cent.South Univ.Technol.,2008,15:4412Caballero,A.;Espinosa,A.;Tárraga,A.;Molina,.Chem., 2008,73:548913Long,Y.T.;Li,C.Z.;Sutherland,T.C.;Chahma,M.;Lee,J.S.;Kraatz,H.-B.J.Am.Chem.Soc.,2003,125:872414Luo,X.;Lee,T.M.;Hsing,I.Anal.Chem.,2008,80:734115Jewell,C.M.;Hays,M.E.;Kondo,Y.;Abbott,N.L.;Lynn,D.M.Bioconjugate Chem.,2008,19:212016Bari觢ic,L.;Rapic,V.;Pritzkow,H.;Pavlovic,G.;Nemet,I.anomet.Chem.,2003,682:13117Bari觢ic,L.;Cakic,M.;Mahmoud,K.A.;Liu,Y.-N.;Kraatz,H.-B.;Pritzkow,H.;Kirin,S.I.;Metzler-Nolte,N.;Rapic,V.Chem.Eur.J.,2006,12:4965018Baroni,S.;Mattu,M.;Vannini,A.;Cipollone,R.;Aime,S.;Ascenzi,P.;Fasano,M.Eur.J.Biochem.,2001,268:621419Hill,H.D.;Straka,J.G.Anal.Biochem.,1998,170:20320Qu,F.;Li,N.Q.;Jiang,Y.Y.Talanta,1998,45:78721Khan,M.M.;Tayyab,S.Biochim.Biophys.Acta,2001,1545:263 22Yan,C.N.;Zhang,H.X.;Ju,X.;Mei,P.;Liu,Y.;Pan,Z.T.Chin.J.Anal.Chem.,2005,33:759[颜承农,张华新,鞠香,梅平,刘义,潘祖亭.分析化学,2005,33:759]23Zhang,B.L.;Wang,W.Q.;Bao,F.L.Chem.J.Chin.Univ.,1994, 15:373[张宝林,王文清,白凤莲.高等学校化学学报,1994,15:373]24Hu,Y.J.;Liu,Y.;Hou,A.X.;Zhao,R.M.;Qu,X.S.;Qu,S.S.Acta Chim.Sin.,2004,62:1519[胡艳军,刘义,侯安新,赵儒铭,屈啸声,屈松生.化学学报,2004,62:1519]＇＇＇ˇ＇＇'1130。

两种金属卟啉与牛血清白蛋白作用的研究
胡珍珠;陈芳
【期刊名称】《化学世界》
【年(卷),期】2010(51)9
【摘要】采用荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究了两种金属卟啉与牛血清白蛋白(BSA)的结合作用。

实验结果表明:卟啉配合物对BSA有较强的荧光猝灭作用,按照Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk双倒数方程分析和处理试验数据,得到反应的结合常数、结合位点数和热力学参数等;探讨了金属卟啉的分子结构对结
合反应的影响。

利用同步荧光技术考察了金属卟啉对BSA构象的影响,发现金属卟啉的加入使BSA构象发生变化,色氨酸残基所处环境的疏水性降低。

【总页数】5页(P527-530)
【关键词】金属卟啉;牛血清白蛋白;光谱法;荧光猝灭;热力学参数
【作者】胡珍珠;陈芳
【作者单位】湖北师范学院化学与环境工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】O657.3
【相关文献】
1.两种方法研究新型光敏剂五聚赖氨酸-2-羰基酞菁锌与牛血清白蛋白相互作用 [J], 李春艳;阮冠宇;单丽;陈锦灿;黄明东
2.牛血清白蛋白与两种金属配合物的作用研究 [J], 刘海萍;王兴明;戴亚堂;宋绵新
3.丹皮酚及其两种同分异构体与牛血清白蛋白相互作用的热力学研究 [J], 刘敏;朱兰英;曲秀葵;孙德志;林瑞森
4.荧光光谱研究阿司匹林键联金属卟啉与牛血清白蛋白的相互作用 [J], 王凯;张智;张秀兰;巨修练;李早英
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