一种乳酸菌的检测鉴定方法

分子生物学实验作业——用分子生物学方法鉴定菌株专业：生物化工姓名：王晓娜学号：1043111039鉴定一株乳酸菌菌株一、实验目的和方法采用RAPD指纹图谱方法鉴定一株乳酸菌菌株二、实验材料2.1 菌株实验给定的菌株2.2 试剂Taq DNA聚合酶、DNA电泳buffer、引物、dNTP、模板DNA2.3 仪器台式离心机，PCR仪，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统三、实验步骤3.1 制备细菌DNA样品收集菌悬液于1.5mlepp管中，5 000r/min离心5min。

去上清，在沉淀中加入567微升 TE缓冲液、30微升10％的SDS、5微升10mg/ml 的溶菌酶后，37℃水浴3h。

再加入3微升20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴lh。

加入100微升5mol/l NaCl，80微升CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min。

加入等体积的氯仿／异戊醇，12 000r/min离心5min。

取上清，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，12 000r／min离心5min。

取上清，加入2倍体积的冰乙醇，12 000r/min离心10rnin，沉降DNA。

去上清，将沉淀吹干，用100微升TE缓冲液(pH8．0)溶解。

取l微升 DNA样品，稀释200倍后，紫外测定0D260和0D280。

选取浓度1．8≤0D26l／0D280≤2．0的样品。

然后，将DNA浓度稀释至48ng/µl作为模板备用。

3.2 PCR反应扩增体积为25µl (含TapDNA聚合酶2u，10×PCR reaction buffer 2µl，dNTP 2µl，引物lµl，模板DNA 1µl)。

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，38℃复性lmin，72℃延伸2min，进行40个循环后72℃延伸10min。

取12µl扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为l％(0．5×TBE)电泳30—40min，用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。

乳酸菌鉴定方法嘿，你问乳酸菌的鉴定方法哈。

那我们得先从形态学方面入手。

把含有乳酸菌的样本放在显微镜下观察。

乳酸菌的形状有点特别，大多数是杆状或者球状的。

就像一个个小卫士，在微观世界里排着队。

你可以看看它们的大小，一般都比较小，得仔细观察才能看清它们的模样。

有的乳酸菌还会连在一起，像一串串小珠子似的。

再说说菌落特征。

把乳酸菌接种到固体培养基上，让它们生长繁殖。

过一段时间后，你会看到培养基上长出了一个个小菌落。

乳酸菌的菌落通常比较小，而且表面光滑、湿润。

有点像小小的露珠落在培养基上。

颜色一般是白色或者乳白色的，看起来很干净。

接着讲讲生化反应鉴定。

乳酸菌能发酵一些糖类，比如葡萄糖、乳糖等。

我们可以通过检测它们发酵糖类产生的产物来鉴定。

比如检测有没有产生乳酸，因为乳酸菌的名字可不是白叫的，它们可是产乳酸的能手。

可以用一些化学试剂来检测，要是试剂变色了，那就说明产生了乳酸。

还有一个方法是通过分子生物学技术来鉴定。

这就有点像用高科技手段来识别乳酸菌。

提取乳酸菌的DNA，然后用特定的引物进行PCR 扩增。

就像给乳酸菌的DNA 做个标记，这样就能准确地知道是不是乳酸菌了。

我给你讲个事儿哈。

在一家做酸奶的工厂里，他们很关心酸奶里的乳酸菌。

有一次，他们怀疑酸奶里的乳酸菌有点问题，就开始进行鉴定。

先把酸奶样品放在显微镜下看，发现有很多球状的小东西，看着像是乳酸菌。

然后把样品接种到培养基上，长出了好多小菌落，菌落的特征和乳酸菌的很像。

接着他们又做了生化反应测试，发现这些菌确实能发酵乳糖产生乳酸。

最后还不放心，又用分子生物学技术验证了一下，确定就是乳酸菌。

这样他们就放心了，知道自己的酸奶里有足够的、正宗的乳酸菌。

在鉴定乳酸菌的时候，每一个方法都很重要。

就像我们认识一个人，要从不同的方面去了解。

不能只看外表，还得看看他的行为、习惯等。

鉴定乳酸菌也是一样，综合运用这些方法，才能准确地鉴定出乳酸菌。

而且操作过程要仔细，不能马虎，不然就可能得出错误的结论。

乳酸菌菌种的分离筛选原理乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的益生菌，广泛应用于食品、饲料、医药等领域。

乳酸菌菌种的分离筛选是乳酸菌应用研究中的重要一环，其目的是从大量的混合菌群中筛选出具有优良特性的菌株。

乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基：乳酸菌菌种对营养要求较高，因此选择适宜的培养基是分离筛选的首要步骤。

常用的培养基有MRS培养基、DC培养基等，它们含有适宜乳酸菌生长的营养成分，能提供所需能量和营养物质。

2. 适宜的培养条件：乳酸菌对培养环境的温度、pH、氧气和二氧化碳等条件有一定要求。

通常情况下，乳酸菌分离筛选需要在适宜的温度（一般为30-40）下进行，pH值保持在4.5-7.0之间，氧气和二氧化碳含量适中。

3. 分离方法：乳酸菌菌种的分离常采用传统的分离培养技术，如层析法、稀释平板法、摇瓶培养法等。

其中，层析法是一种常用的快速分离方法，通过将混合菌群在筛选培养基上涂抹或刺激，使不同菌株在筛选培养基上形成分离的菌落。

4. 鉴定鉴别：乳酸菌菌种的筛选与鉴定是不可分割的一步，只有确定菌株的种属和特性才能真正确认其乳酸菌的菌种类型。

目前，常用的鉴定方法包括形态学观察、生理和生化特性检测、分子生物学方法（如PCR技术、16S rDNA序列分析）等。

在乳酸菌菌种的分离筛选过程中，还需要注意以下几个问题：1. 选择样品：样品的选择对于乳酸菌菌种的分离筛选至关重要。

通常情况下，从乳制品、肠道、土壤等环境中寻找潜在的乳酸菌菌种，可以提高分离到优良菌株的几率。

2. 优化培养条件：对于特殊的乳酸菌菌种，可能需要优化培养条件，如调整温度、添加特定的营养成分等，以促进其生长和繁殖。

3. 评价筛选结果：乳酸菌菌种的分离筛选结果需要综合考虑其特性和应用价值。

如菌株的酸奶生产能力、耐酸碱能力、抗菌能力、抗氧化能力等。

总结起来，乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括选择合适的培养基和培养条件、采用适当的分离方法和鉴定鉴别技术。

乳酸菌的分离与筛选具体实验流程1. 引言1.1 背景介绍乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，它们能够以乳酸为代谢产物进行无氧发酵，并且在食品工业、农业和医学领域具有重要的应用价值。

乳酸菌不仅能够促进食品品质的改善和保鲜，还对人体健康具有积极影响。

然而，目前市面上存在许多商业化的乳酸菌制剂，其有效成分及效果并不尽相同。

因此，研究和筛选出优质活性的乳酸菌种类，具有重要意义和广阔前景。

1.2 研究意义本研究旨在通过分离与筛选方法得到高活性的乳酸菌。

通过该研究可以加深我们对乳酸菌及其作用机制的理解，并为特定领域如食品工业、农业等提供先进的技术支持和解决方案。

此外，筛选出具有优良特性的乳酸菌株也将为开发新型功能性食品、生物农药等领域的产品提供重要支持。

因此，本研究对于推动食品工业、农业发展具有积极意义。

1.3 实验目的本实验主要目的如下：- 收集和处理样品：收集富含乳酸菌的样品，并经过适当处理以提高分离效果。

- 选择与制备分离培养基：根据乳酸菌的特性选择适合的培养基并进行制备。

- 设定分离培养条件：通过调控温度、pH值等参数，确定适宜的乳酸菌分离培养条件。

- 鉴定活性乳酸菌指标：确定评价乳酸菌活性和质量的指标，并进行相关试验和检测。

- 设计与实施筛选试验：根据所选指标设计筛选试验，并在实验中采用相应方法进行实施。

- 可行性评估与结果分析：对筛选试验结果进行评估和分析，并总结可行性及相关优化建议。

通过以上实验流程，我们旨在深入了解乳酸菌的特点及其在不同领域中应用潜力，并为进一步研究和开发具有市场竞争力的乳酸菌产品提供理论和实践基础。

2. 乳酸菌的分离方法2.1 样品收集与处理在乳酸菌的分离研究中，样品的选择和处理十分重要。

我们可以选择不同来源的样品，如发酵食品、生态环境等。

收集样品后，需要进行适当的处理以消除非目标微生物对于乳酸菌生长和筛选的干扰。

常见的样品处理方法包括冷藏、过滤、稀释等。

2.2 分离培养基选择与制备为了促进乳酸菌的分离和生长，在实验中需要选择适宜的分离培养基。

一、实训目的本次实训旨在通过实验操作，掌握乳酸菌的检测方法，了解乳酸菌的基本特性，提高对微生物检测技术的实际操作能力，并加深对乳酸菌在食品、医药等领域的应用认识。

二、实训时间2023年10月25日至2023年11月5日三、实训地点生物实验室四、实训内容1. 乳酸菌样品的采集与处理2. 乳酸菌的分离纯化3. 乳酸菌的形态观察4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定5. 乳酸菌产酸能力的测定五、实训方法1. 乳酸菌样品的采集与处理（1）采集：从市场上购买含有乳酸菌的酸奶、酸奶饮料等样品。

（2）处理：将样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，制成系列稀释液。

2. 乳酸菌的分离纯化（1）平板划线法：将稀释后的样品涂布在MRS平板上，用无菌接种针进行划线。

（2）培养：将平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。

（3）挑取单菌落：根据菌落的特征，挑取疑似乳酸菌的单菌落。

3. 乳酸菌的形态观察（1）制作临时玻片：将挑取的单菌落涂布在载玻片上，用无菌盖玻片覆盖。

（2）显微镜观察：在显微镜下观察乳酸菌的形态、大小、排列等特征。

4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定（1）革兰氏染色：将挑取的单菌落涂布在载玻片上，进行革兰氏染色。

（2）生化反应：进行糖发酵试验、氧化酶试验、V-P试验等。

5. 乳酸菌产酸能力的测定（1）制作MRS培养基：按照实验要求配制MRS培养基。

（2）接种：将挑取的单菌落接种于MRS培养基中。

（3）培养：将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24小时。

（4）测定pH值：使用pH计测定培养基的pH值，计算产酸能力。

六、实训结果与分析1. 乳酸菌样品的采集与处理采集了5个样品，均成功制成系列稀释液。

2. 乳酸菌的分离纯化共分离纯化出10个疑似乳酸菌的单菌落。

3. 乳酸菌的形态观察在显微镜下观察到乳酸菌为杆状，大小约为0.5～1.0μm，排列呈链状。

4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定10个疑似乳酸菌均呈革兰氏阳性，能发酵乳糖，不产生硫化氢，氧化酶试验阴性。

食品中乳酸菌的筛选与活性鉴定乳酸菌是一类对人体健康具有益处的细菌，在许多食物中都可以找到它们的踪迹。

从酸奶到发酵食品，乳酸菌都发挥着重要的作用。

然而，如何筛选出具有较高活性的乳酸菌，并对其进行鉴定，这是一个令人感兴趣的话题。

首先，我们需要选择适当的食品样本进行筛选。

常见的食品包括酸奶、奶酪、纳豆等发酵产品。

这些食品中含有大量的乳酸菌，因此是我们进行筛选的理想选择。

此外，还可以考虑其他一些食物，如蔬菜和肉类，它们也可能含有乳酸菌。

接下来，我们需要从样本中分离出乳酸菌。

这可以通过培养基选用和分离培养来实现。

培养基的选用非常重要，它应提供乳酸菌所需要的营养物质。

我们可以选择常用的乳酸菌培养基，如MRS培养基。

通过将样品接种于MRS培养基中，我们可以让乳酸菌生长并形成可见的菌落。

然后，通过将这些菌落转移至其他培养基中，可以进行单菌落分离，确保我们获得的是纯种的乳酸菌菌株。

鉴定乳酸菌的活性也是我们的重点之一。

活性乳酸菌可以产生乳酸、酶和抗菌物质，这些物质对人体健康有益。

因此，我们想要筛选出活性较高的乳酸菌菌株。

常见的活性鉴定方法包括测定乳酸产量、酶活性和抗菌活性。

乳酸产量是乳酸菌活性的重要指标之一。

我们可以通过高效液相色谱法（HPLC）来测定乳酸的含量。

通过将培养基或发酵物转移到HPLC系统中，我们可以分析出乳酸的浓度。

通过与不同菌株之间的比较，我们可以确定哪些菌株产乳酸的能力更强。

酶活性是另一个衡量乳酸菌活性的重要指标。

乳酸菌常常能够产生多种酶，如蛋白酶和纤维素酶。

我们可以使用相应的酶活性试剂盒来检测其酶活性。

高酶活性的乳酸菌意味着它们能够更好地消化蛋白质和纤维素，从而提高食物的可消化性和营养吸收能力。

除了乳酸和酶活性外，抗菌活性也是评估乳酸菌活性的重要指标之一。

乳酸菌可以产生抗菌物质，对抗病原菌的侵袭。

我们可以通过抗菌活性试验来评估乳酸菌的抗菌能力。

将不同乳酸菌菌株与病原菌一起接种在琼脂平板上，观察是否形成抑制区域。

乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类可以发酵果糖或蔗糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。

它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、动物肠道、植物表面等环境中，并且在食品加工、乳制品、膳食补充剂等领域具有重要的应用价值。

分类鉴定乳酸细菌的方法主要包括传统分离鉴定和分子生物学方法，而实验方法主要包括培养、生理生化鉴定和分子鉴定等。

1.传统分离鉴定传统分离鉴定是通过培养、生理生化特性的观察和细菌形态学特征的分析来进行分类鉴定的方法。

一般的步骤包括：1.2分离：采用适当的培养基，如MRS培养基等，在适当条件下进行分离培养。

可以采用不同的稀释度和培养温度来增加分离率和适应性。

1.3纯化：从培养出的菌落中选择纯净的菌落进行纯化。

1.4形态学观察：观察细菌的形态学特征，如菌落形态、细胞形态、孢子形态等。

1.5生理生化特性鉴定：通过生理生化实验，如氧需氧性、产气、产酸、碱性产蛋白酶等特性的鉴定来进一步确定细菌的分类。

1.6比较分析：将鉴定结果与已知的乳酸菌进行比较分析，以确定菌株的分类。

2.分子生物学方法分子生物学方法是一种快速、准确的分类鉴定方法，可以通过检测细菌的DNA序列来进行鉴定。

常用的分子生物学方法包括PCR、16SrRNA测序和随机扩增多态性DNA(RAPD)等。

2.1PCR：PCR是通过扩增细菌DNA的特定区域来进行鉴定的方法。

首先，从培养的细菌中提取DNA。

然后，使用特定引物扩增目标区域的DNA，并通过凝胶电泳分析PCR产物的大小。

比较PCR产物的片段大小和带型模式，可以确定乳酸菌的分类。

2.216SrRNA测序：细菌的16SrRNA序列是一个高度保守的基因序列，可以用来进行细菌分类鉴定。

通过提取DNA，扩增16SrRNA基因片段，并进行测序，然后将测序结果与已知的乳酸菌序列比对，可以确定细菌的分类。

2.3RAPD：RAPD是一种无须事先了解目标序列的技术，它利用随机引物扩增细菌DNA的多态位点，通过凝胶电泳分析不同样品间的DNA带型模式，来进行菌株分类。

乳酸片球菌检测标准
乳酸片球菌的检测标准包括以下几个方面：
1. 菌落形态：菌落直径～，呈乳白蓝色、圆形隆起、边缘整齐、有光泽、无透明圈。

2. 菌体形态：菌体呈球杆、成对、四联状、成片排列，大小为～μm。

3. 革兰氏染色：G+。

4. H2O2酶试验：阴性。

5. 运动性试验：不运动。

6. 硝酸盐试验：阴性。

7. 生长温度：在350℃、400℃、500℃均生长。

8. 生长pH值：在、生长，不生长。

9. 耐盐性：在%NaCl、%NaCl生长，18%NaCl不生长。

10. 发酵糖类：发酵阿拉伯糖、核糖和木糖产酸，不发酵鼠李糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇等。

11. 毒素检测：乳酸片球菌中的乳酸片球菌素是该菌唯一的毒力因子，也是其主要的抑菌物质，通过检测乳酸片球菌素可以确定乳酸片球菌的存在。

12. 其他指标：乳酸片球菌的乳酸片球菌素产生不受培养基成分和pH值的影响，但其产生受温度和培养时间的影响。

在30℃以下培养时乳酸片球菌
素产生量较少，在37℃左右培养时产生量最大，温度高于40℃时则不再产生乳酸片球菌素。

培养时间越长，产生的乳酸片球菌素越多。

以上是乳酸片球菌的检测标准，根据这些标准可以对乳酸片球菌进行准确、全面的检测和评估，以保证产品的安全性和有效性。

乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。

3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。

糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。

将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。

3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。

培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。

1.2.3 乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。

1.结果和分析2.1 乳酸菌的分离提纯在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状（如图一2.2乳酸菌的鉴定该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。

在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。

说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。

也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。

在糖发酵试验中，在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡（如图三）；加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡（如图四）。