基因工程原理

遗传学筛选法 基因转化使得 宿主细胞获得了 新的表现型，可 以利用导入基因 表达的功能进行 筛选。 如质粒 DNA导入大肠杆 菌后获得了抗药 性，或插入失活 使得基因功能丧 失（LacZ基因的 α互补－蓝白筛 选）鉴定重组子。
Southern blot：用DNA探针（放射性或非放射性标记）检测同源 DNA模板的技术。DNA双链变性打开后与探针退火结合，菌落 原位/DNA电泳膜转移杂交可以鉴定同源DNA片段。 Northern blot：检测RNA表达，可用DNA或RNA探针。
分子杂交探针的制备
单链DNA－用M13单链噬菌体克隆探针双链DNA，获得的单链噬 菌体用引物在E.coli聚合酶I作用下进行聚合，切下探针片段进行 PAGE电泳分离； 单链RNA－体外转录获得，噬菌体启动子T7/SP6进行体外转录后 消化DNA即获得标记的RNA探针；
切口平移－即Nick translation，用DNasI产生切口，由DNA聚 合酶I进行聚合获得标记探针，DNA聚合酶I的3’－5’外切酶活 性可以去除5’末端，获得全长标记探针； 随机引物延伸－即random primer extension, 利用随机引物 (6~9mer)与变性ds DNA结合然后进行延伸反应； 末端标记－(1)T4 DNA聚合酶标记3’端(在3’-OH加上标记核苷 酸)；(2)T4多核苷酸激酶标记5’端(碱性磷酸酶除去5’磷酸， 再加上标记的γ-dNTP)；(3)末端转移酶标记3’末端； 合成寡核苷酸探针: 人工合成寡核苷酸探针； 标记核苷酸－(1)放射性同位素标记：有α-32PdATP/dCTP； γ-32PdATP/dCTP; (2)非放射性标记：Degoxigenin(毛地黄 苷，DIG)，biotin(生物素)标记核苷酸(dUTP), 用其特异抗体 进行检测，和荧光素(不如前两种常用)。
大肠杆菌表达真核基因融合蛋白
转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列控制，可以 得到高效表达； 融合蛋白通常比天然外源蛋白更稳定； 融合蛋白较大易于电泳分离，提取； 融合蛋白－(1)原核基因与外源真核基因ORF一致； (2)原核基因与外源真核基因一起转录翻 译，但翻译产物不是融合蛋白，即启动子－SD序列－ 原核CDS-TGATG-真核CDS－Ter.
化学法
利用特异试剂修饰4种碱基并在其相邻磷酸二酯键切除 碱基进行水解切下缺少碱基的戊糖-磷酸链，获得的具有末端标 记的片段进行电泳分离和放射自显影分析。
DNA序列测定的进展
测序酶：早期用DNA聚合酶I、Klenow片段和逆转录 酶，Taq DNA聚合酶耐热可消除模板二级结构和减少引 物错配，及T7 DNA聚合酶(Sequenase)等得到了应用； 噬菌体T7的基因6外切酶 可获得单链模板进行测序，提高效率； 非放射性标记序列测定 荧光法已用于DNA序列自动测定，但荧光强度不 高影响分辨率。 Dioxetane－生物素标记脱氧核苷酸， 链霉亲和素与生物素结合并再结合碱性磷酸酶， Dioxetane (Lumigen PPD)作底物，在碱性磷酸酶作用下 发出光子用X光片机测定。
质粒载体
质粒是染色体外的遗传物质可独立复制产生多个拷贝，Boyer和 Cohen于1973年构建了第一个重组质粒并在大肠杆菌中稳定传递。 质粒复制 ：松弛型－独立复制，拷贝数高, pUC载体可达700个/ 细胞；严紧型－受受体染色体DNA复制控制，拷贝数低。氯霉 素扩增－氯霉素可抑制染色体DNA复制，但质粒复制不受影 响，可增加拷贝数。 遗传标记：多数为抗药性标记，可进行抗药性筛选或插入失活 筛选。LacZ的α互补－质粒含有lacZ基因的5’编码区(N端146个 氨基酸)并插入多克隆位点，染色体上为3’端顺序，两个亚基结 合才具有功能(α互补)，插入外源片段后失去互补功能－可进 行蓝白菌落筛选(诱导物－IPTG即异丙基-β-D-硫代半乳糖苷， 生色底物X-gal－5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)。
DNA序列测定
1977年Sanger和Maxam－ Gilbert分别发明了测定DNA 顺序的方法.两种方法均涉及 产生4种反应产物即末端分别 为4种核苷酸的不同长度 DNA链，Sanger发明了“加减 法”和“双脱氧法”，“双脱氧 法”得到了广泛应用。 Maxam－Gilbert的“化学法” 是将DNA双链进行特异碱基 修饰并从修饰部位进行切 断，产生特异长度片段。
真核
DNA化学合成
根据已知基因的氨基酸序列设计适合受体细胞表达偏爱密码子 的核苷酸链，合成单链DNA片段，互补产生双链片段并有单链 末端，多个互补双链片段连接插入载体转化即获得合成基因的 克隆。 化学合成过程如下： DNA自动合成仪(ABI) 去保护: 核苷固定在固相载体(硅胶等高分子)上，5’-OH 由 DMTr (二甲氧基三苯甲基)保护，三氯醋酸(TCA)去保护； 激活反应: 四唑激活下，核苷(N2)与核苷(N1)上的5’-OH 起偶联反应，用乙腈洗涤； 加帽反应: 醋酸酐与DMAP(二甲基氨基吡啶)作用下，使 未参加反应的寡核苷酸链乙酰化，不参加下一步反应； 氧化反应: 将三价的磷酸转变为五价的磷酸。
外源基因的表达体系
原核基因表达的基本元件 启动子：可调控强启动子，包括λPL、lac、trp、tac(trp-lac) T7 等，原核启动子含－10/－35顺序，表达原核基因仅需要启动子即 可； λPL－低温下(32ºC)阻遏其(cIts857), 高温(42ºC)表达外源基因； lac－中等强度启动子，由诱导物IPTG诱导表达；trp－受阻遏物色氨 酸调控；tac－trp的－35区与lac的－10区融合的强启动子， 受lac阻遏蛋白调控；T7启动子－需要T7噬菌体RNA聚合酶(可由λ 噬菌体提供)识别T7启动子； 核糖体结合位点：即Shine-Dalgarno(SD)序列，包括起始密码子 (ATG)和位于ATG上游3～11个核苷酸处约9~11个核苷酸的DNA序列。 SD序列与16S rRNA的3’端互补，带动mRNA与核糖体的结合；表达 真核基因必需，同时需去除内含子序列；
DNA序列分析 DNA的物理图谱
即DNA的限制酶图谱，可用多种不同的限制酶进行DNA酶 切分析，包括部分酶切法、交叉酶解法(已少用)、末端标记法、片 段杂交法。末端标记法－标记DNA分子，进行酶切(包括部分酶 切)，电泳分析片段大小；片段杂交法－标记不同限制酶的酶切片 段，然后进行相互杂交排列片段。
真核生物表达体系
酵母表达系统：酵母可以进行芽繁殖，可以在液体和固体培养基上生
长，繁殖周期快，真核基因的表达产物一般可以进行正确折叠，是表 达真核基因的理想系统。 动物生物反应器: 转基因动物可以用来表达外源基因，如可以开发乳 腺生物反应器生产基因工程药物。但转基因动物可以会带来一些伦理 问题，且动物疾病有的是人畜共患。 植物生物反应器：转基因植物是理想的生物反应器，首先在于其价廉 且可以大量生产且不需要进行加工及储存，其次真核基因可以正确折 叠，翻译产物具有活性，此外，植物疫苗可以引起人体正常免疫反应。
病毒表达系统：动植物及细菌病毒均可以用来表达外源基因，病毒表
达载体感染受体动植物或细菌可以进行外源基因的表达。
大多数的双子叶植物和少数单子叶植物可通过一种土壤杆菌即根癌农杆 菌介导而获得外源基因的表达。根癌农杆菌及其中的一种大质粒称为Ti 质粒上的多个基因共同作用，感染植物上的伤口细胞并将Ti质粒上的一 段DNA即转移DNA（T克隆较大DNA片段，用 YAC、BAC可以克隆更大 的染色体片段。人工染色 体含复制起始(ARS,自主复 制序列)，着丝粒，两端端 粒。
重组DNA构建
载体自连: 用碱性磷酸酶除去载体限制酶切点的5’磷酸基 可防止载体自连，提高与目的片段的连接效率； 平端连接: 提高平端浓度，加入凝聚剂(如聚乙二醇、氯 化六氨合高钴)，高浓度T4连接酶等可提高连接效率； 感受态细胞: 受体细胞接受外源DNA能力的一种生理状 态，一般是生长对数期后期。用CaCl2在0C冷冻处理可 大大提高感受态细胞转化效率； 限制-修饰系统: 某些E.coli宿主的限制酶可切割未修饰外 源DNA分子，可用该限制酶缺陷的菌株进行转化； 重组系统: E.coli可编码催化同源DNA序列重组的代谢途 径，真核DNA片段是同源重组的理想底物，可用重组缺 陷菌株(recA-/B-/F-)进行转化。
Hale Waihona Puke cDNA的构建克隆cDNA(与mRNA互补的反转录DNA)可以了解蛋 白质基因的结构及其表达： 单链DNA合成: 反转录酶, 引物为poly(T)或随 机引物(N6/9); 双链DNA合成: DNA聚合酶I，由单链3’末端发 夹结构或用RNaseH水解形成mRNA片段引物起动第 二链的合成； 克隆转化: 将cDNA克隆到载体后转化受体菌。
重组DNA的筛选
λ 噬菌体的体外包装 A蛋白－参与λ 噬菌体DNA插入前头部，在噬菌体多联 体 COS位点切割DNA；A-突变－可形成空头部； D蛋白－ λ 噬菌体头部的外面，参与λ 噬菌体DNA进入 前 头部，头部的成熟；D-突变－形成不成熟空头部； E蛋白－ λ 噬菌体头部主要成分，头部最早前体必需； E-突变－可积累各种病毒衣壳； imm434cIts突变-产生温度敏感阻遏物，在32C为溶源状态， 45C加入裂解生长。 A- E-突变体噬菌体感染的细菌与D- E-突变体噬菌体感染的 细菌的提取物可互补； 或感染A- 噬菌体感染的细菌提取物加入野 生型噬菌体提取的A蛋白进行互补。 λ 噬菌体DNA由突变体感染 提取物体外包装后再感染E.coli可大大提高转染效率，达 108pfu/μg DNA。
Chapter 3 基因工程原理
克隆载体 真核基因的克隆 重组DNA的筛选 外源基因的表达体系 DNA序列分析 PCR技术 反义技术 点突变
克隆载体
克隆载体的特性 复制起始(ORI)：在受体细胞中独立复制； 多克隆位点(MCS)：含多个限制性核酸内切酶 单一切点； 多选择标记：抗药性，其他遗传标记； 分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大； 常用克隆载体 质粒, 噬菌体(λ), Cosmid, Phagemid, 真核病毒, YAC, BAC