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实验二蛋白质免疫印迹技术河北大学生命科学学院2010生物技术河北保定071002摘要：目的：学习掌握动物抗血清的制备原理及技术，通过实际操作学会动物抗血清的制备，掌握Western－blotting的基本原理，熟悉Western－blotting的实验操作。
方法：，使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清，然后利用Western－blotting 检测抗血清。
结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应.关键词：常规免疫抗血清免疫印记Abstract：objective：learn to master the theory and technology of preparing animals’antiserum by operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’antiserum , mastering the basic principles of Western－blotting, and being familiar with the experiment operation of Western－blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the routine immunization of , and obtain the antiserum, then detecting the antiserumthrough Western－blotting.Result:Purified chicken ovomucoid can lead to the laboratory rat's immunoreaction Keywords: routine immunization antiserum Western－blotting前言免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
Western blot实验报告摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法方法：western blot结果：见后文结论：western blot能很好地分离蛋白关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白Western blot test reportAbstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transferResults: see belowKey words: Western blot、separate、mouse tissues、protein前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
3.6.2 Western blotting检测3.6.2.1 试剂配置及保存如下：1）制胶用（1）10％SDSSDS 10.0 g加蒸馏水至100 ml如溶解困难，可在50 °C水浴下溶解，室温保存。
（2）10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺1 .0g蒸馏水10 ml配好后分装，-20 °C避光保存。
（3）0.5MTrisHcl（pH6.8），1.5MTrisHcl（pH8.8），30%丙稀酰胺及TEMED皆4 °C保存。
2）电泳与转膜缓冲液（1）5×电泳液缓冲液Tris（MW121.14）30.0 g甘氨酸（MW75.07）144.0 gSDS 10.0 g加蒸馏水至2000 ml , 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取200 ml配制成1000ml即可。
（2）10×转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）144.0 gTris（MW121.14）30.3 gSDS 1.5g加蒸馏水至1000 ml , 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。
通常取200 ml母液，加1400 ml蒸馏水，最后加400ml甲醇，配制成2000 ml即可，注意先加甲醇易产生沉淀。
3）洗膜液（1）5×TBS缓冲液Tris（MW121.14）22.4 gNaCl 292.0 g加蒸馏水至2000 ml , 浓盐酸调pH至7.6，溶解后室温保存。
（2）1×TBST缓冲液5×TBS缓冲液200 ml蒸馏水800 mlTween-20 0.75 ml混匀后室温保存。
因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。
4）封闭液（1）封闭液（5%脱脂牛奶)：1×TBST缓冲液50 ml脱脂奶粉2.5 g溶解后4 °C保存，可于一周内使用。
3.6.2.2 SDS-PAGE蛋白电泳、转膜、免疫反应和化学发光法检测1）灌制蛋白质聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）：配制4%浓缩胶，根据蛋白大小配制7.5%，10%分离胶以及8%与16%的双层分离胶。
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：Western Blotting 方法一: 直接法方法二: 间接法优点： 1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带1. 免特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的Marker缺点： 1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便1. 交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
细胞蛋白的提取与测定一、蛋白提取原理: 蛋白质是一切生命活动的承担者, 为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究, 进一步阐明众多疾病的机制, 同时为疾病治疗提供理论依据, 因此需要提取目的蛋白, 由于蛋白质种类繁多, 结构复杂, 需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。
贴壁细胞蛋白的提取: （所有操作均在冰上进行）准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用裂解液制备: 每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白, 使其免于被蛋白酶降解）, 配好后冰上备用；2.此处以6孔板为例, 吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液, 清洗 2-3次, 吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）；3.加入适当体积的裂解液, 让裂解液与细胞充分混匀, 冰上裂解30min；4.裂解完成后, 用细胞刮刀将细胞刮下, 将细胞及裂解液吸入离心管, 放离心机4℃12000rpm 离心30min（离心机提前预冷）, 上清即为蛋白溶液, 细胞碎片沉降于底部；5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA 定量分析；c.做western blot, 需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同, 例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。
二、组织中总蛋白的提取：1.将已称重的冷冻组织（约50g）放入预冷好的研钵中, 用研杵快速研磨组织, （有的需要加入液氮）, 直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）；2.裂解液制备: 取250ulRIPA裂解液+2.5ul 100mmol/L蛋白酶抑制剂+2.5ul蛋白酶抑制剂复合物Cocktail(多种小分子组成的抑制剂混合物能更好的保护蛋白不被蛋白酶降解)；3.取适量研磨的匀浆放入离心管, 加入配好的裂解液, 冰上孵育40min；4.离心: 4℃ 12000rpm 离心15min 保留上清；5.将蛋白溶液防止于-20℃保存（长期保存放于-80℃）。
Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳分离的提议目的蛋白成分。
蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结构(凝胶）。
据有无浓缩效应可将电泳分为两类：i.连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效应区分。
ii.不连续系统：缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、分子筛效应、浓缩效应区分。
SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象：在实验中要注意：印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品达到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持物上，另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢失和扩散。
免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作容易，适用于理论和应用上的研究。
本实验采用人血清为材料，人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
其中IgG占血清免疫球蛋白总量的75%～80%。
人的IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二硫键相连。
在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。
对此样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG 为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的IgG。
二、试剂，器材和实验材料【试剂】1.30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。
2.浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。
3.分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。
4.10％过硫酸铵(w/v)：临用前用蒸馏水配制。
5.10％SDS(w/v)。
6.10％TEMED。
7.电极缓冲液：甘氨酸11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。
8.样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8，20％甘油，4％SDS，10％巯基乙醇，0.005％溴酚兰。
9.考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸。
10.脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。
11.TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/L Tris-HCl,12.500mmol/L NaCl，pH7.5，每组配150ml。
13.TTBS：取100mlTBS，加250μl 20％Tween-20。
14.封闭液及抗体稀释液：3％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。
15.底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10μl H2O2，临用前配制。
16.考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸，总体积500ml。
17.脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。
【器材】1.夹心式电泳槽2.转移电泳槽3.电泳仪【实验材料】1.人血清2.硝酸纤维素膜三、实验步骤ⅠSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.灌胶前的准备：将两块玻璃板洗净晾干或用吹风机吹干，嵌入本体的凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室。
合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合。
然后将以上组合放入制胶架，插入并旋转凸轮，即可灌胶。
2.配制胶液3.灌胶：将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板顶端约1.5cm处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层，以保持分离胶面平整，同时隔绝空气，空气中的氧对凝胶的聚合有阻碍作用。
待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已聚合，大约30min完成聚合。
倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端，插上样品梳，放置待其聚合。
4.配制电极缓冲液：甘氨酸14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。
每组配1000ml。
5.制样：5μl人血清，加45μl水，再加50μl加样缓冲液。
沸水浴加热8分钟，10000rpm离心2分钟,取上清液作为样品。
另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。
6.加样：1、加入电极缓冲液；a) 拔出样品梳；b）选3个样品槽，用微量进样器加样，中间槽加入5μl分子量标准蛋白样品，两旁槽各加入10μl人血清样品。
稳压120V电泳，当溴酚蓝前沿到达距底部0.5cm左右时，停止电泳。
7.切胶：根据切割线，先竖切后横切，宽胶条为两泳道，含人血清样和分子量标准蛋白样，考马斯亮蓝R-250全蛋白染色。
窄胶条为一泳道，为人血清样，转印后对目标蛋白免疫染色。
8.胶条保存：将两个胶条用保鲜袋包好，贴上标有自己名字的标签-20℃冻存。
Ⅱ转印蛋白质到硝酸纤维素膜上1.将带有人血清和标准蛋白的宽胶带用考马斯亮蓝R250染色、脱色：将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250染色液染色1小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。
更换几次脱色液，至背景无色透明，条带清晰为止。
2.放置NC膜和胶条：a)⑴.切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min使之湿润。
b)⑵.准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。
c)⑶打开转移转移槽的胶板，依次放入：a.一张浸湿的海绵b. 一张浸湿的滤纸c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向e. 一张浸湿的滤纸f. 一张浸湿的海绵。
3.转移：小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。
插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关调至稳压60V，电泳1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
Ⅲ膜的酶联免疫染色1.封闭：用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口。
加封闭液1ml后封闭开口，37℃摇床上摇动30min。
2.加封闭液及抗体a)与第一抗体结合(1)弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液(兔抗人IgG)，封口后37℃摇床上轻轻摇动50min。
(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。
再封入一新的塑料薄膜袋内。
b)与酶标第二抗体结合(3)加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃摇床上轻轻摇动50min。
(4)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。
加底物溶液显色将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。
转入水中保存。
3.结果分析：在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。
测量分子量标准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG带的迁移距离，在标准曲线上查出人IgG重链的分子量。
实验结果：做标准蛋白曲线的的凝胶的总长为7.53cm带有人血清IgG的硝酸纤维素膜的总长为7.24cm由公式y = -1.1451x + 2.0366知：当x（重链相对迁移率）=0.33时，y=1.6587 得IgG重链相当分子量为：45.57KDa当x（轻链相对迁移率）=0.56时，y=1.3953 得IgG轻链相当分子量为：24.85KDa讨论：一、实验注意事项：1..丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有神经毒性，注意不要沾在皮肤上，如有沾染可用水洗净。
聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。
2.电泳槽只能用水冲洗，不能用刷子刷，以免刷断铂电极丝；注意保护玻璃板。
3.一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。
多克隆抗体结合抗原能力较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生交叉反应。
因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合构成。
4..如果反应灵敏度不高，可增加凝胶的厚度到1.5mm（厚度超过2.0mm时，凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提高蛋白样品的上样量。
5.滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能过大，避免导致直接接触而引起短路。
6.如果出现非特异性的高背景，可观察仅用二抗单独处理转印膜所产生的背景强度，若高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或缩短二抗孵育时间；并考虑延长每一步的清洗时间。
7.一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求不同，须经预实验确定最佳条件。
