乙肝病毒cccDNA检测

龙源期刊网 cccDNA是乙肝检测的最权威指标作者：刘士敬来源：《家庭医学》2010年第08期研究发现，细胞外的乙肝病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，有数个碱基的“缺刻”；正链较短，有较大的“缺口”。

在乙肝病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(英文简称cccDNA)。

cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。

近年来，国内一些大医院已建立了可靠的检测方法。

评价慢性乙肝抗病毒治疗疗效目前考核抗病毒药物疗效的标准，都是建立在乙肝病毒被抑制或可能被清除的间接评价指标之上，比如，病毒DNA达到不可测水平、HBeAg消失或血清转换、HBsAg消失或血清转换等。

只有彻底清除了细胞核内的cccDNA，乙肝病毒复制的基础不复存在了，才是真正治愈了乙肝。

可见，考核抗病毒治疗的最终疗效标准，应该是清除cccDNA，其他任何指标与之相比只能是“次要”标准。

有研究表明，在血清HBsAg被清除的乙肝病毒感染者中，肝细胞内仍有cccDNA存在。

但清除cccDNA的过程比较漫长，需要较高的社会和经济成本，而且在现有条件下进行长期治疗，伴随的必然是药物不良反应的增加以及病毒耐药突变等。

因此，是否把清除cccDNA作为治疗终点，还需要进行更多的研究。

筛选抗病毒药物目前的抗病毒药物均不能有效清除CCCDNA，因此，开发新的、能清除CCCDNA的药物是患者和医生共同的期待。

遗憾的是，CCCDNA分子在细胞内形成的一些关键环节，目前还不清楚或存在争论。

如果能阐明这些环节，将有助于指导开发新的、能够清除eecDNA的抗病毒药物。

评价乙肝病毒复制的模型一种细胞或动物模型能否支持乙肝病毒复制，cccDNA可以作为一个较好的评价指标。

乙肝DNA测定结果如何解读乙肝DNA测定结果的解读：乙肝DNA测定是一项用来检测乙型肝炎病毒是否存在于体内的重要检测手段。

其结果可分为阳性和阴性两种，具体解读如下：1、乙肝DNA测定结果为阴性：表示体内没有乙型肝炎病毒或病毒数量很少。

此时，患者有可能已经从疾病中恢复或处于病毒携带者状态。

2、乙肝DNA测定结果为阳性：表示体内存在乙型肝炎病毒。

阳性结果的大小表示病毒载量的多少，数字越大，病毒载量越高。

数字越小，病毒载量越低。

当病毒载量高时，就需要进行相应的治疗。

乙肝DNA测定的治疗方法：目前，治疗乙肝感染的方法主要是药物治疗以及疫苗预防。

药物治疗依靠抗病毒药物来抑制病毒复制，达到稳定病情、控制病毒、防止病情恶化等效果。

常用的抗病毒药物有：拉米夫定、爱地华、恩替卡韦等。

疫苗预防是针对乙型肝炎病毒产生抗体，从而达到预防感染的目的。

乙肝DNA测定的注意事项：1、准确性：乙肝DNA测定的结果应该由专业医生来解读，因为误判会对治疗方案产生影响。

2、重要性：乙肝DNA测定是乙肝治疗的一个关键指标，检测结果直接关系到患者治疗的方向和疗效。

3、检测周期：乙肝DNA测定结果不是一次就能确定的，需要定期测定。

一般来说，至少每半年进行一次测定，以保证治疗的有效性和及时处理病情。

4、治疗方案：乙肝治疗除了要考虑病毒载量外，还需要注意患者的肝功能情况、乙肝病期、合并症等因素，因为不同的患者情况需要的治疗方案是不同的。

5、生活习惯：患者在治疗期间应该注意生活习惯，比如不要喝酒，不要吃刺激性食物，同时保持充足的休息，加强身体锻炼，避免感染其他疾病。

乙肝核心抗体阳性是不是曾经感染能跟他吃饭乙肝核心抗体阳性是什么意思？乙肝核心抗体（HBcAb）是乙型肝炎病毒感染后体内产生的抗体之一，其出现表明人体曾经感染过乙型肝炎病毒。

乙肝核心抗体阳性的患者可以被诊断为曾经患有乙型肝炎，但并不一定表示这个人正在患有乙型肝炎。

跟乙肝核心抗体阳性的人吃饭是否安全？乙肝核心抗体阳性的患者可以跟大多数人一样吃饭，因为乙肝病毒不通过空气、水、食物传播。

乙肝病毒DNA检测乙肝病毒DNA指的是脱氧核糖核酸，病毒的复制是靠DNA的复制来完成的，DNA的浓度越高，病毒的复制越活跃。

合起来，HBV-DNA指的就是乙肝病毒的脱氧核糖核酸。

乙肝病毒DNA检测是判断乙肝病毒复制的常用手段。

一般的，把数值大于10的3次方为阳性，把3-5次方认为是低量复制，5-7为中等量，大于7次方为大量。

乙肝两对半并不能准确的判断病毒复制情况，DNA弥补了这个的不足。

不过由于DNA检测技术要求严格，容易受到干扰，因此，一次结果不足以说明问题，遇到阳性，可以换医院再次检查。

目录1DNA检测2作用3临床意义4复制过程▪第一步：黏附▪第二步:脱壳▪第三步：入核▪第四步：转录▪第五步：翻译▪第六步：逆转录▪第七步：组装5频率6注意事项7检测方法8检测报告9检测费用10检测要空腹吗11乙肝病毒DNA检测的作用1DNA检测以往乙肝患者抗病毒治疗的指征是：乙肝病毒e抗原阳性（大三阳）患者HBVDNA数值要求达到10的5次方拷贝/毫升（20000U/ml），乙肝病毒e抗原阴性（小三阳）患者乙肝病毒DNA数值要求达到10的4次方拷贝/毫升（2000U/ml），但是10的4次方拷贝/毫升以下也不能认为就没有问题了，最新的国际研究资料表明：和肝脏疾病进展相关的病毒DNA水平域值尚不清楚，即使HBVDNA水平持续低于20000U/ml，也可能乙肝病毒情仍在进一步发展，因此HBVDNA数值应该越低越好，目前国际建议的HBVDNA检测正常值应该是：< 50U/ml 。

2作用目前，乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中使用的越来越普遍，可见乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中占的分量越来越重，这是因为乙肝病毒DNA检测对确诊乙肝和评估乙肝治疗效果具有十分重要的作用。

主要表现在以下七个方面：1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。

2、乙肝病毒是否复制。

3、乙肝是否传染，传染性有多强。

4、是否有必要服药。

5、肝功能异常改变是否由病毒引起。

乙肝定量的意义乙肝“两对半”定量检测的必要性及可行性众所周知，慢性乙型肝炎是我国常见的慢性传染病之一。

2008年4月，卫生部公布了最新的全国人群乙肝等有关疾病血清流行病学调查结果：我国乙肝表面抗原携带率为7.18%，携带者仍然达9300万人。

调查结果再次表明，乙肝防治工作面临的形势依然严峻，我们应充分认识乙肝危害的严重性和长期性。

根据中华医学会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》，乙肝的实验室检查包括生化学检查、HBV 血清学检测、HBV DNA及基因型和变异检测测、影像学诊断、病理学诊断。

其中，HBV 血清学检测主要指乙肝“两对半”检测，目前常采用酶免疫法 (EIA)、放射免疫法 (RIA)、微粒子酶免分析法 (MEIA) 或化学发光法等。

长期以来，受检测技术水平、检测成本、传统习惯等多方面因素影响，乙肝“两对半”一直处于手工定性检测，这使得该项目成为实验室众多项目中最难实现自动化定量检测的项目之一。

近几年，国内、国外不少厂家纷纷提出“乙肝定量检测”的概念，应该说这是实验室需求及检测技术发展的必然。

受厂家推广的影响，医务工作者不免存在以下疑问：什么是乙肝定量检测、乙肝定量检测有必要性吗？首先我们来讨论第一个问题，个别厂家在宣传定性/定量检测时，往往会“打擦边球”，试剂说明书里给出的单位明明是“COI”或“S/CO”，却被说成是“完全定量”。

这显然是不正确的，国际上公认的乙肝“两对半”定量的单位应该是ng/ml、IU/ml、IU/L 或PEIU/ml。

如何确定某一方法学是定性还是定量，笔者有一简单方法：打开试剂说明书，找到第一段话便一目了然（完整的试剂说明书在第一段话中，就会描述该试剂盒是作定性/qualitative还是定量/quantitative检测）。

对于“乙肝定量检测有必要性吗”这一问题，在医务工作者中存在两种声音：第一种是乙肝定性已能满足临床需要，乙肝定量没必要了；第二种声音是乙肝定量检测与疾病进程密切相关，定量检测极为重要。

乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ检测方法的建立及初步应用目的：建立和应用聚合酶链反应法(PCR)检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)。

方法：应用选择性PCR的方法检测30例乙肝患者肝组织中cccDNA，同时验证此方法的特异性。

结果：31例慢性乙型肝炎患者肝组织中，10例HBV cccDNA阳性，阳性率为32.3％。

HBV cccDNA阳性组的ALT、HBV DNA、和HBeAg水平均明显高于阴性组(P＜0.01和P＜0.05)。

结论：该方法操作简单，特异性好，可用于测定肝组织中HBV cccDNA，用于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价抗乙肝病毒药物的疗效。

标签：乙型肝炎病毒；共价闭合环状DNA；聚合酶链反应；慢性乙型肝炎在感染的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cc－cDNA)，不与蛋白共价结合。

cccDNA 是嗜肝DNA病毒科病毒基因组的复制中间体，是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板，虽然其含量较少，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，是嗜肝病毒持续感染的关键因素。

因此，我们选择其特异性引物，建立了乙肝病毒肝组织的cccDNA检测方法。

1材料与方法1.1研究对象慢性乙型肝炎患者肝组织标本31例和2例HBV DNA阳性肝癌肝组织标本；HBV DNA阳性血清标本1例，HBV DNA含量为107 copies/ml；HBV DNA阴性血清标本和HBV阴性肝组织标本各l例作为阴性对照，－70℃保存。

诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。

1.2仪器PCR自动循环仪，AG－9600 Thermal Station，AcuGen Sva－terns。

1.3引物的设计和合成由于松弛环状DNA(rcDNA)的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不会被扩增，而cccDNA由于为完整的双链结构，则可以被选择性扩增，通过GENERUN软件设计一对跨越缺口的最佳引物，BA3为：5’－CCG ACC ACG GGG CGC ACC TCT CTI”TAC G－3’，BA4为：5’－CAA GGC ACA GCT TGG AGG CTT GAACAGT－3’，扩增目的基因片段为373 bp。

乙肝定性转定量的发展进程以我们目前人类现有的科技手段，根本无法做到治愈乙肝，我们现阶段的目标不在于治愈乙肝，而在于提高乙肝患者的生活质量，阻止其病情向更糟糕的情况发展。

提到防治乙肝，不能不提到相关的药物，自1991年干扰素（IFN）应用于临床以来，相继有LVD（1998）、ADV（2002）、pegIFN-α和ETV（2005）、LdT（2006）被使用，最新的药物是2008年的TDF。

这些药物的使用，极大的改变了CHB相关Management的修订。

不但如此，对于检验医学来说，科技的进步更意味着与CHB相关检测指标的更新。

首先谈血清HBV DNA。

第一次把血清HBV DNA纳入准则的是2000年的亚太准则（Asian-Pacific Consensus Working Parties on Hepatitis B. Asian-Pacific consensus statement on the management of chronic hepatitis B: An update J Gastroenterol Hepatol 2003;18:239-45），由于2004年Taqman技术的出现，HBV DNA定量成为可能，因此该准则在2005年进行修订，把HBV DNA定量纳入CHB 检测指标。

但是HBV DNA定量作为一个CHB长期指标被纳入一系列相关准则，只是近期发生的事情。

因为直到2005-2006年才有一系列研究证实：血清HBV DNA升高与肝硬化和原发性肝癌高度相关，而肝硬化和肝癌，正是临床上阻止CHB长期演变的目标。

正是由于这些研究的推动，各种CHB相关防治准则在对于血清HBV DNA定量的态度发生了极大转变，都开始纷纷强调抑制血清HBV DNA和监测其水平（Prophylaxis, diagnosis and therapy of hepatitis B virus (HBV) infection: The German guidelines for the management of HBV infection. Z Gastroenterol 2007;45:1281-328.）。

乙型肝炎cccDNA的检测和临床应用肖春花;张春兰【期刊名称】《河北医药》【年(卷),期】2012(034)019【总页数】4页(P2993-2996)【关键词】乙型肝炎;松弛环状DNA;检测【作者】肖春花;张春兰【作者单位】516002,广东省惠州市第三人民医院感染科;516002,广东省惠州市第三人民医院感染科【正文语种】中文【中图分类】R512.62慢性乙型肝炎仍然是影响人类健康的一个重要问题，全球大约有4亿人感染乙型肝炎，其中中国占很大比例，约3 000万慢性乙型肝炎患者，又约5%最终发展成肝硬化或肝癌，每年约有100万人死于HBV感染引起的各种终末期肝病。

目前研究发现并不是乙型肝炎病毒直接损伤肝组织，而是细胞免疫应答攻击病毒的同时造成肝组织的损伤，导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌［1，2］。

虽然近年来乙型肝炎抗病毒治疗取得了一定进展，但治疗的疗程、停药后的复发等等问题一直困扰人类。

HBV感染的细胞生物学知识展示HBVcccDNA(covalently closed circular DNA)在病毒长期存在、停药后复发和抗药性方面起着重要的作用［3］。

1 cccDNA1.1 HBV基因组 HBV基因组结构独特而精密，由不完全的环状双链DNA组成，成熟病毒的DNA以松弛环状DNA(relaxed circular，rcDNA)形式存在，其中负链(长链)约含3 200个bp，含有HBV基因组的全长基因，在5’起始端与3’末端之间有一个至数个碱基的缺口;正链(短链)的长度可变，相当于长链的50% ～80%［4］。

HBV基因组中4个开放性读框均位于负链，分别是S区、C区、P区和X 区，其中S区完全嵌合于P区内，C区、P区和X区部分相互重叠。

见图1。

图1 HBV基因组的组成和结构1.2 cccDNA形成乙肝病毒感染宿主细胞后在胞质中脱去衣壳，然后rcDNA进入细胞核，经宿主DNA聚合酶和拓扑酶等的“修复”，形成超螺旋结构的cccDNA。