【CN109609530A】一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用【专利】

2018年第37卷第5期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS·1949·化 工 进展海藻糖合酶的自诱导表达及其催化生产海藻糖的新工艺晏星辰1，2，赵倩如3，王凯峰3，郭玉欣3，江凌2，黄和4（1南京工业大学生物与制药工程学院，江苏 南京 210009；2南京工业大学食品与轻工学院，江苏 南京 210009；3南京工业大学2011学院，江苏 南京 210009；4南京工业大学药学院，江苏 南京 210009）摘要：海藻糖合成酶一步合成法是制备海藻糖最具工业化前景的方法之一。

在前期研究基础上，本研究从发酵产酶和酶催化两方面进一步降低海藻糖生产成本，提高生产效率。

首先，采用自诱导表达系统，在摇瓶体系中对含有海藻糖合成酶的大肠杆菌BL21（DE3）进行三阶段温度控制发酵，即以自诱导培养基发酵培养重组大肠杆菌，在37℃培养2.5h ，25℃培养10.5h ，30℃继续培养至发酵终点；此时，酶活达到1.42×104U/mL ，比自诱导恒温提高了57.4%。

在此基础上，在5L 反应器上进行三阶段温控发酵验证实验。

通过连续发酵40h 后OD 达到31，细胞干重浓度达到15.32g/L ，酶活达到最高值1.81×104U/mL ，比摇瓶发酵提高了28.6%。

其次，开展全细胞催化生产海藻糖工艺优化，以5%甲苯处理45min 的大肠杆菌细胞为研究对象，考察了pH 、反应温度、底物浓度对全细胞催化合成海藻糖的影响以及全细胞催化的重复使用性能。

结果发现：催化反应在pH 为7.5、温度为30℃、麦芽糖初始浓度为350g/L 时，海藻糖的得率达到74%以上；全细胞催化反应10个批次后，细胞仍保持对麦芽糖64.1%的转化率。

本研究为海藻糖的工业化生产提供了一种经济、高效的工艺路线。

关键词：海藻糖；海藻糖合酶；自诱导表达；三阶段温控；全细胞催化中图分类号：TQ464.1 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2018）05–1949–07 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2017-1428.Auto-induced expression of trehalose synthetase and novel process forcatalytic production of trehaloseYAN Xingchen 1，2，ZHAO Qianru 3，WANG Kaifeng 3，GUO Yuxin 3，JIANG Ling 2，HUANG He 4（1Biotechnology and Pharmaceutical Engineering ，Nanjing Tech University ，Nanjing 211816，Jiangsu ，China; 2Collegeof Food Science and Light Industry ，Nanjing Tech University ，Nanjing 211816，Jiangsu ，China ；32011 College ，NanjingTech University ，Nanjing 211816，Jiangsu ，China ；4School of Pharmaceutical Sciences ，Nanjing Tech University ，Nanjing 211816，Jiangsu ，China ）Abstract ：One-step catalysis by the trehalose synthase is one of the most promising methods for the trehalose production. Based on the previous researches ，this study started with two aspects of enzyme expression and catalysis to reduce the cost and improve the productivity of trehalose production. Firstly ，Escherichia coli BL21（DE3）containing trehalose synthase was cultured using auto-induced expression system and three-stage temperature controlling strategy in shake flasks. The recombinant E. coli cells were sustainedly cultivated in 37℃ for 2.5h ，25℃ for 10.5 h ，and 30℃ till to the end of cultivation ，respectively. The enzyme activity reached 1.42×104U/mL ，which was 57.4% higher than that obtained from the process of the constant temperature incubation. Furthermore ，this cultivating六大人才高峰（2015-JY-009）及江苏省先进生物制造创新中心项目。

海藻糖合成国际专利海藻糖合成技术专利分析一、专利检索概况针对海藻糖合成技术，我进行了国际专利数据库的检索。

通过关键词组合，如“海藻糖”、“合成”、“生产方法”等，在多个专利检索平台进行了广泛的搜索。

经过筛选和去重，确定了以下具有代表性的专利。

二、关键专利分析专利名称：高效海藻糖合成方法1.申请人：XYZ生物科技公司2.申请日期：XXXX年XX月XX日3.授权日期：XXXX年XX月XX日4.主要内容：该专利描述了一种使用特定酶催化的海藻糖合成过程，通过优化反应条件和酶的选择，提高了合成效率。

5.技术细节：专利中详细说明了酶的来源、反应温度、pH值以及反应时间等关键参数，这些参数对于提高海藻糖的产量和质量至关重要。

6.技术评估：该方法具有创新性，通过生物催化方式减少了化学合成的复杂性和环境污染。

同时，高效的合成过程有助于降低生产成本。

7.市场应用前景：随着人们对天然甜味剂需求的增加，海藻糖作为一种低热量、防龋齿的甜味剂，在食品、医药和化妆品等行业具有广阔的应用前景。

专利名称：微生物发酵法生产海藻糖1.申请人：ABC生物技术研究所2.申请日期：XXXX年XX月XX日3.授权日期：XXXX年XX月XX日4.主要内容：该专利利用特定微生物菌株进行发酵，通过调控发酵条件来生产海藻糖。

5.技术细节：专利中描述了微生物菌株的筛选、培养基的组成、发酵温度和时间等关键技术点。

6.技术评估：这种方法利用微生物的天然代谢能力，具有环保、可持续的优点。

同时，通过发酵过程的优化，有望实现工业化大规模生产。

7.市场应用前景：随着生物技术的不断发展，微生物发酵法将成为海藻糖生产的重要方向，尤其在食品和医药领域具有巨大的市场潜力。

三、综合分析从检索到的专利来看，海藻糖的合成技术主要集中在生物催化法和微生物发酵法两大方向。

这些方法在环保性、可持续性和成本效益方面相较于传统化学合成法具有明显优势。

随着消费者对健康和环保理念的日益关注，以及生物技术的不断进步，预计海藻糖的市场需求将持续增长。

专利名称：一种海藻糖合酶生产菌株及其应用专利类型：发明专利
发明人：吴敬,宿玲恰,郭小杰
申请号：CN201510378976.7
申请日：20150701
公开号：CN104911135A
公开日：
20150916
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种海藻糖合酶生产菌株及其应用，属于生物工程和酶工程技术领域。

本发明的海藻糖合酶生产菌为一株假单胞菌Pseudomonas sp.WSH15-02，于2015年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015227，是从淀粉加工厂附近土壤中经菌株富集、平板菌落特征初筛，采用摇瓶复筛，测定酶活力，经酶活测定，比较海藻糖合酶活性大小而得到。

该菌生产的海藻糖合酶可以麦芽糖为底物催化生产海藻糖，具有不受底物浓度影响、温度范围广、没有副产物生成、反应方法简便、低能耗、物料成本低、高效等优点，底物转化率可达80％以上。

该菌可用于生物制品、食品、药品、作物育种及精细化工等领域。

申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：张勇
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(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610073828.9(22)申请日 2016.02.02C12N 15/61(2006.01)C12N 9/90(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12P 19/24(2006.01)C12P 19/12(2006.01)(71)申请人齐鲁工业大学地址250353 山东省济南市长清区大学路3501号(72)发明人苏静 李珍珍 王瑞明 张云霄(74)专利代理机构济南金迪知识产权代理有限公司 37219代理人朱家富(54)发明名称一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用(57)摘要本发明涉及一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用。

突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明首次根据(Pseudomonas stutzeri)Qlu3预测的三维结构为基础，对其活性中心进行关键氨基酸的定点突变，获得了海藻糖合酶的突变体蛋白，该突变的海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高，热稳定性好，较野生型海藻糖合酶，突变体的海藻糖转化率提高了4.5％，副产物葡萄糖的生成量降低了69.4％。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页序列表4页 附图3页CN 105524936 A 2016.04.27C N 105524936A1.一种突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，表达载体中插入了权利要求1所述的表达基因。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为pET-15b。

5.一种转基因细胞系，含有权利要求3所述的重组载体。

6.权利要求1所述突变的海藻糖合酶的表达基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求5所述的转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1740323A [43]公开日2006年3月1日[21]申请号200410051199.7[22]申请日2004.08.24[21]申请号200410051199.7[71]申请人李宝健地址510275广东省广州市新港西路135号中山大学园西区747号之三103室[72]发明人李宝健 徐志祥 [74]专利代理机构广州知友专利商标代理有限公司代理人宣国华[51]Int.CI.C12N 15/52 (2006.01)C12N 15/81 (2006.01)C12P 19/12 (2006.01)C12P 19/14 (2006.01)C12N 15/10 (2006.01)C12N 15/63 (2006.01)C12N 1/19 (2006.01)权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 7 页[54]发明名称一种酶法合成海藻糖的工艺方法[57]摘要本发明公开了一种酶法合成海藻糖的工艺方法，包括下列步骤：a.分别克隆灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因；b.分别构建灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体；c.在酵母中分别转化、表达灰树花海藻糖合成酶基因以及大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体，构成重组蛋白，然后对重组蛋白进行纯化；d.在以蔗糖和葡萄糖为主要成分的反应液中，分别加入纯化的上述重组蛋白合成海藻糖。

本发明应用基因工程、酶工程和发酵工程合成海藻糖，在酶法生产海藻糖方面形成了新的技术和工艺，同时以蔗糖和葡萄糖这两种廉价的原料来实现工业化规模化生产海藻糖，降低了成本，具有重大的经济效益。

200410051199.7权 利 要 求 书第1/2页1、一种酶法合成海藻糖的工艺方法，包括下列步骤：a.分别克隆灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因；b.分别构建灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体；c.在酵母中分别转化、表达灰树花海藻糖合成酶基因以及大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体，构成重组蛋白，然后对重组蛋白进行纯化；d.在以蔗糖和葡萄糖为主要成分的反应液中，分别加入纯化的上述重组蛋白合成海藻糖。

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610061793.7(22)申请日 2016.01.29C12P 19/14(2006.01)C12P 19/20(2006.01)C12P 19/12(2006.01)C12P 19/04(2006.01)(71)申请人山东和田旺生物科技有限公司地址261300 山东省潍坊市昌邑市柳疃沿海经济发展区(72)发明人王伟华 陈凤霞(74)专利代理机构济南舜源专利事务所有限公司 37205代理人吕翠莲(54)发明名称一种海藻的酶解处理方法(57)摘要本发明提供一种海藻的酶解处理方法，包括材料准备、预处理、酶处理、离心步骤。

所述的酶处理步骤：采用的酶为复合酶，所述的复合酶包括蛋白酶、纤维素酶和果胶酶，质量比为3:1:2。

所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶、木瓜凝乳蛋白酶中的任意一种。

所述的纤维素酶为葡聚糖外切酶、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶、纤维二糖酶中的任意一种。

所述的果胶酶为原果胶酶、裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶中的任意一种。

采用本发明的海藻酶解处理方法，海藻酸钠的提取率为38.0～50.9%；海藻糖胶的提取率为7.5～11.8%。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页CN 105586377 A 2016.05.18C N 105586377A1.一种海藻的酶解处理方法，其特征在于：包括材料准备、预处理、酶处理、离心步骤。

2.根据权利要求1所述的一种海藻的酶解处理方法，其特征在于：所述的酶处理步骤：采用的酶为复合酶，所述的复合酶包括蛋白酶、纤维素酶和果胶酶，质量比为3:1:2。

3.根据权利要求2所述的一种海藻的酶解处理方法，其特征在于：所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶、木瓜凝乳蛋白酶中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的一种海藻的酶解处理方法，其特征在于：所述的纤维素酶为葡聚糖外切酶、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶、纤维二糖酶中的任意一种。

专利名称：一株产海藻胶降解酶的海洋细菌及应用专利类型：发明专利
发明人：汤凯,詹佩文,韩昱,陈小凤,林丹
申请号：CN201711471996.4
申请日：20171229
公开号：CN108004178A
公开日：
20180508
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一株产海藻胶降解酶的海洋细菌及应用，涉及海藻胶。

产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，保藏号为CGMCC 1.15788。

产海藻胶降解酶的海洋细菌在制备海藻胶中应用。

海藻胶的制备方法：将表层海水水样涂布于RO种子培养基培养，得到形态各异的单菌落，并纯化后保存；将初筛后得到的保种细菌纯化接入海藻酸钠液体培养基中，摇床培养，分离能降解海藻酸钠的海洋细菌。

海藻胶降解酶的制备方法：从保种管中取出菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后接入RO种子培养基中，摇床培养至对数生长期，得种子液；将种子液转接发酵培养基，摇床培养得发酵液；将发酵液经离心得上清液，即为海藻胶降解酶。

申请人：厦门大学
地址：361005 福建省厦门市思明南路422号
国籍：CN
代理机构：厦门南强之路专利事务所(普通合伙)
代理人：马应森
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专利名称：一种海藻糖的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：刘功良,杨松光,张敏倩,白卫东,梁景龙,吴玉莹,黄力申请号：CN201911221980.7
申请日：20191203
公开号：CN110714039B
公开日：
20220329
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及海藻糖制备技术领域，具体公开了一种海藻糖的制备方法。

所述的海藻糖通过蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL‑2发酵制备得到；具体通过如下方法制备得到：将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL‑2接种在培养液中，在20～30℃下发酵84～108h，得发酵液；然后从发酵液中进行海藻糖的提取即得海藻糖。

实验表明，采用蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL‑2来发酵制备海藻糖可以显著提高菌种胞内海藻糖积累量，提高酵母菌发酵海藻糖的产量。

申请人：仲恺农业工程学院,中国科学院华南植物园
地址：510225 广东省广州市海珠区东沙街24号
国籍：CN
代理机构：佛山帮专知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：曾凤云
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专利名称：一种催化合成海藻糖的生物酶及其制备方法及应用专利类型：发明专利
发明人：邢将军,祝俊,余玉奎,徐飞,沈为标,范晓阳,王玉刚
申请号：CN201610167114.4
申请日：20160323
公开号：CN105695433A
公开日：
20160622
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种催化合成海藻糖的生物酶及其制备方法和应用。

所述生物酶为SEQID NO：2所示的氨基酸序列；所述生物酶的制备包含以下步骤：1）利用基因工程的手段将全基因合成的生物酶基因片段SEQID NO：1克隆到高效表达载体中，构建了产海藻糖酶的基因工程菌株；2)将所述基因工程菌进行发酵培养，收集菌体细胞；3）破碎菌体细胞，释放出生物酶，得到包含酶的水溶液；4）将包含上述酶的水溶液用于将直链淀粉或直链糊精转化为海藻糖。

本发明构建的基因工程菌可以将直链淀粉或直链糊精高效转化为海藻糖，具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。

申请人：江苏诚信药业有限公司
地址：226221 江苏省南通市启东市滨江精细化工园区上海路338号
国籍：CN
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海藻糖的酶法合成及在食品工业中的应用
汤兴俊
【期刊名称】《中国食品添加剂》
【年(卷),期】2003(000)002
【摘要】海藻糖具有独特的生物学功能,在医药、食品等行业应用潜力巨大.本文就海藻糖的性质、生物学功能、酶法合成的研究进展进行了综述,并简要叙述了海藻糖在食品工业中的应用.
【总页数】5页(P90-94)
【作者】汤兴俊
【作者单位】大闽食品,漳州,有限公司,漳州,363000
【正文语种】中文
【中图分类】TS743:TS2
【相关文献】
1.海藻糖研究现状及其在食品工业中的应用 [J], 聂凌鸿;宁正祥
2.新型食品添加剂海藻糖的功能及在食品工业中的应用 [J], 朱明
3.海藻糖的性质和应用以及酶法合成的研究进展 [J], 刘雨霄;王逸潇
4.海藻糖在食品工业中的应用 [J], 杨荣华;林家莲
5.海藻糖脂肪酸二酯的酶法合成及性质 [J], 汪淑珍
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