Western blot
一、Western blot历史及原理
蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，简称WB。1975年，继Edwin Southern发明的“Southern Blot”，1977年George Stark及其同事发明的“Northern Blot”技术之后，受以上两个“转印”技术的启示，1981年“Western Blot”这一技术正式问世。抗体技术的发展，电泳及转膜技术的改进使得Western Blot操作日益简单；分析方法及工具多样化、成像技术的革新、高灵敏度示标信号的出现使得Western Blot的检测范围得到扩展，定量/半定量成为可能。目前Western Blot设备不断更新、技术不断发展，WB仍将在较长时间和应用领域内得到更加广泛的应用，其检测灵敏度也将不断提高。
其基本原理与ELISA相似：通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离混合蛋白质样品，转印到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以转印到固相载体上的蛋白质（多肽）作为抗原，与对应的抗体（又称一抗）特异性结合，特异性抗体再与酶、荧光素或同位素标记的抗一抗抗体（又称二抗）起反应，经过底物显色或放射自显影以检测样品中特异性蛋白（见图1）。一抗的质量是WB成功的关键，现在市面上抗体公司很多，一般选择大公司大品牌的抗体对于实验的成功很有保证。但是由于实验经费的限制只能选择小公司或国产二线品牌的抗体，这个时候需要使用者尽可能多考究：①完整的质检数据；②售后承诺；③技术人员对产品的熟悉程度。对于二抗来说，选择就更需谨慎，虽然二抗看似简单，其质量却千差万别，对实验结果的影响也尤为重要。福因德科技（Frdbio）专注于免疫检测产品的开发和工艺研究，只做精品；如果客户购买的产品质量达不到标明的水平，无条件退货。对于WB的底物是根据二抗的标记酶来确定的，有大家较为熟悉的辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，）和碱性磷酸酶AP（Alkaline
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB）
一、 蛋白提取与样本制备
（一）操作步骤
1.提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化；
2.根据样本数配制混合溶液：PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1：100，现用现配）；
3.裂解组织：每个样品称取50mg，加1ml混合液，在冰上用组织剪剪减为碎屑，电动匀浆后4 ℃静置2h使其充分裂解，离心12000g，4 ℃15min，取上清；
4.蛋白定量：
1) 取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；
2) 标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍比稀释
（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul + 生理盐水80ul）；
3) 配制显色剂BCA混合液：a液：b液=50:1。配制量=200ul*（孔数+6）；
4) 加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；
5) 贴上封口胶，37℃震荡混匀30min；
6) 562nm波长处测吸光度OD；
7) 根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。
5.样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度； 6.样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）；
7.100℃变性5min。
8.分装并存于-20 ℃，避免反复冻融。
二、 配置相关试剂
（一）10%的SDS（戴口罩称取）：
试剂 剂量
SDS （g） 10
双蒸水（ml） 80
用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。
（二）1.5M Tris/HCl（pH8.8）
试剂 剂量
Tris base （g） 18.17
双蒸水（ml） 80
用浓盐酸调至pH 8.8，最后定容至100ml。室温下保存。
（三）0.5M Tris/HCl（pH6.8）
试剂 剂量
Tris base （g） 6.06
双蒸水（ml） 80
Southern杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量
基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
Northern 印记杂交
Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
Western杂交
原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
Western实验步骤
Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
