流式细胞仪的原理与使用
一、定义
流式细胞仪（flow cytometer）：是集光电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。
流式细胞术（flow cytometry , FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识及技术。
二、基本结构
1.流动室和液流系统
流动室由样品管、鞘液管、喷嘴等组成，由透明稳定的材料（化学玻璃、石英等）制成，是液流系统的核心部分。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力下从样品管射出。鞘液由鞘液管由四周流向喷孔，包围在样品外周后由喷嘴射出。
2.激光源和光学系统
光源根据被激发物质的激发光谱而定，常用弧光灯和激光。常用的弧光灯为汞灯，激光器多为氩离子激光器、氪离子激光器或染料激光器。经过特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发荧光供收集检测。
3.光电管和检测系统
荧光染色或荧光标记后的细胞受到合适的光激发后产生的荧光通过光电转换器转变为电信号进行测量。通常使用光电倍增管（PMT）。PMT响应时间短，为ns数量级，具有较强光谱响应特性，200～900nm光谱区内光量子产额较高，其增益从103到108可连续调节，有利于弱光的测量。
由PMT输出的电信号放大后输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类为线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系，适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。免疫分析时需要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，其荧光强度相差1～2个数量级；在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
细 胞 分 选 的 简 要 操 作 步 骤
一、上样前的准备
FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、 应用无菌技术制备下列无菌工作液。
3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制）
5L 无菌蒸馏水
5L 无菌PBS
2、 在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。安好鞘液筒。
3、 将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。
4、 用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、 在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、 放上一支装有70 % 乙醇的进样管。
7、 设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、 从Acquire menu选择SortSetup 。在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。按液流控制键RUN。
10、 在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。。
11、 跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
12、 再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、 断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、 在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。
15、 在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、 放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、 点击Acquisition Control菜单中Acquire。
18、 跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
19、 再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、 断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。安好鞘液筒。
流式细胞术分析细胞周期时相
实验原理：流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱
材料：HeLa细胞，5ml注射器，离心管，封口膜，微量移液器，Tips
试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存），
PI （650µg/ml，避光保存于-20℃），PBS(pH 7.4，保存于4℃)
实验步骤：
取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800rpm , 离心 15 min去上清。
•PBS洗2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。
•用5mL注射器将细胞吸起，用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）
•800rpm 15min收集固定细胞，PBS洗2次
•用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）
•加RNase-A约3µL至终浓度约为50µg/mL ，37℃水浴消化30 min；
•加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。
•用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测
流式细胞术简介
一、流式细胞术发展简史
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。
