固定方法—戊二醛-锇酸双固定
双固定法:指用戊二醛对样品前固定,漂洗后使用锇酸对样品 进行后固定,这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定 的方法称为双固定法。 先用2.5%戊二醛固定2h以上。 缓冲液多次清洗(pH7.4 0.2mol/L磷酸缓冲液洗三次,15min/ 次)。
1%锇酸固定2h。
3脱水
透射电镜的结构 透射电镜主要由电子光学系统、 真空系统和供电系统三部分组成。其 中电子光学系统通常称为镜筒,是透 射电子显微镜的核心,它又可以分为 照明系统、成像系统和观察记录系统。
TEM
电子光学系统(镜筒) 供电系统 真空系统
照明部分
成像放大部分
显像部分
电子枪:TEM电子源
物镜、中间镜、投影 镜
理想固定剂
1)渗透力强,穿透速度快,能迅速达到组织块的各部 位,立即杀死细胞,以尽量减小死后变化 2)稳定细胞成分和结构,以保证后续的各种处理中物 质不溶解、不丢失 3)对细胞超微结构没有损伤,保证电镜图像的真实性 4)能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定 5)最好提供一定的反差 ,并有防腐作用
切片操作步骤: 装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片
切片厚度的判断
颜色 暗灰色 铅灰色 银灰或银白 米黄、金黄 紫色(蓝) 厚度(Å) <400Å 400~500 500~700 700~1000 1000以上 切片 厚度 太薄 较薄 适中 较厚 不能用 分辨 率 高 高 好 低 反差 小 小 好 好
常用固定剂
1)锇酸(OsO4)
优点: ⑴ 几乎和细胞内所有成分发生化学结合 ⑵ 对氮具有较强亲和力,对含有蛋白质的细胞结构固定作用良 好 ⑶ 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物 ⑷ Z=76,增加膜的反差 ⑸ 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好 锇酸缺点: ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸,对微管固 定效果差 ⑵ 酶的钝化剂,不能用于细胞化学研究 ⑶ 分子量大,渗透能力差,要求组织块小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积