玉米-三代测序
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通过单分子测序技术揭开玉米复杂的转录组信息
试验材料：
玉米自交系B73不同生育时期的6个组织：根、花粉、胚胎、胚乳、未成熟的穗头和未成熟的雄穗，每个组织3个生物学重复。
建库测序：
PacBio单分子测序平台，6个分级长度文库（<1,1-2,2-3,3-5,4-6和>5kb）。
Illumina平台，Hiseq2000。
主要结果：
1、对处于不同发展阶段玉米的6个组织进行高质量RNA提取后进行逆转录。
为
了消除单分子测序过程中对短序列转录本的偏好性，使用SageELF分别建立了6
个分级长度文库（<1,1-2,2-3,3-5,4-6和>5kb）（图A、B）。
图A 六个分级长度文库的定量化。
图B 六个分粒级文库的凝胶电泳图。
使用PacBio单分子测序平台对所建立的文库进行测序，共得到3,716,604条reads，并使用ToFU进行处理，得到643,330条全长且高质量的转录本。
使用GMAP将高质量的转录本序列与玉米参考基因组RefGen_v3进行比对，有606,145（94.2%）的序列比对到玉米参考基因组上，又将比对上的转录本与NCBI进行比对，除去冗余的转录本后，得到了111,151个非冗余的亚型。
为了减少转录本中由于逆转录错误产生的截断转录本，只保留序列5’起始位点后第一个外显子存在冗余和最长的转录本，除去了37,185（5.8%）个低覆盖率和一致性差的转录本。
2、亚型的检测与表征。
得到的111,151个非冗余的亚型中，其中829个为转座
子序列，并且在6个组织中，胚乳中含有转座子序列最多而雄穗中最少。
将剩下的110,322个亚型比对到玉米参考基因组的基因集上，确定这些亚型的基因座，发现其占据注释基因座的70%。
为进一步与参考基因组的基因集比较，作者将特异的亚型分成八组，a、3%的转录本为新发现基因座的转录本，b、57%的新亚型，即与参考基因组比较至少有一个剪切位点相同，其它剪切位点不同的新亚型，c、17%的亚型与参考基因的内含子和剪切位点相同，d、5.6%的亚型与参考基因外显子有交集但剪切位点不同，e、0.5%的亚型位于参考基因组内含子区，f、4%的亚型与参考基因组外显子有交集但位于其相反链上，g、3.9%的亚型与参考基
因组剪切为位点相同但序列长度短于参考基因组，h、2.9%的亚型覆盖一个以上参考基因组中基因的转录本（图C）。
图C 比较单分子测序得到的亚型和基因组中的亚型。
将单分子测序得到的转录本与已报道玉米转录本进行比较，发现单分析测序得到的转录本的长度更长，并且鉴定出更多的基因具有两个或两个以上的亚型，平均每个基因具有的亚型数目为参考基因组中每个基因亚型数目的两倍以上（图D），同时也表明基因的亚型数与内含子呈正相关，而亚型的数目与基因的表达量没有显著关联。
图D 单分子测序得到的亚型和基因组中亚型长度的比较。
3、测序深度的分析。
调查测序深度与转录本鉴定之间的关系。
4、组织特异的亚型和可变剪切模式分析。
在6个组织中，花粉中组织特异的亚型最多而根中最少（图E）。
比较来自已知和新基因中组织特异的亚型发现她们具有相似的模式（图F）。
使用AStalavista鉴定亚型中五个不同的剪切类型（内含子保留，外显子跳跃，3’/5’端选择性剪接和互斥外显子）（图G）。
发生内含子保留剪接类型数目最多，外显子跳跃数目最少。
随后对发生内含子事件的基因进行实验验证，证实了长reads测序技术的高准确性。
剪接模式在6个组织中表现不一致，在胚乳中外显子互斥剪接类型发生的数目最多（图H）。
图E
图G 五种可变剪接类型。
图H 六个组织中发生五种剪接类型的数目。
5、转录因子的预测。
在玉米的参考基因集中，共包含来自57个家族的2,624个转录因子。
单分子测序数据在53个家族中发现了新的isoform ，并将转录因子的数据增加到5,423个。
结合这些转录因子表达模式分为20个簇。
6、LncRNA 的鉴定。
已报道通过Illumina 测序共鉴定出1704个LncRNA ，作者使用PLEK 对单分子测序数据进行LncRNA 鉴定，鉴定出878个LncRNA ，其中11个与报道过的相同。
剩余的867个新LncRNA 平均长度为1.1kb ，长于之前所鉴定的LncRNA （图a ）。
随后作者将剩下867个新LncRNA 根据其在参考基因组上的位置分为四类，58%来自基因间隔区，21%来自反义链，16%来自有意链，5%来自内含子区（图b ）。
另外，大部分lncRNA 是单外显子的（图c ）。
lncRNA 也展示出组织特异性表达，多外显子的LncRNAs 表达量高于单外显子LncRNAs （图d 、e 、f 、h ）。
Lnc-RNA 和编码基因在染色体上的分布比较相似，富集在着丝粒外围区，和低重复区及低CG/CHG 甲基化区域相关（图g ）。
G
图a，比较新lncRNAs与已经报答lncRNAs的长度。
图b ，LncRNAs的四种类型。
图c ，LncRNAs和non-lncRNAs外显子的数目。
图d，六个组织共同的lncRNAs。
图e ，LncRNAs在六个组织中的表达情况。
图f ，Non-lncRNA 在六个组织中的表达情况。
图g，比较LncRNAs和non-lncRNAs的表达情况。
图h，比较多外显子LncRNAs和单外显子lncRNAs的表达情况。
7、融合转录本的鉴定。
从单分子测序数据中共鉴定出1,430个融合转录本。
其中143个被illumina数据支持。
结果表明，融合事件多发生在染色体间。
随机挑选若干转录本用RT-PCR和sanger 测序验证。
8、PacBio亚型的验证与定量。
对相同样品使用illumina平台进行测序。
使用Tophat 将测得的数据与参考基因组比对，并与PacBio的比对结果进行比较，有86%的剪接位点共同检测到（图a）。
考虑到Tophat2可检测的剪接较少，又用全能的START软件做比对，发现有90%以上的剪接点得到illumina数据的支持。
剪接位点也表现出组织差异性，花粉和胚乳中剪接位点的reads支持率较低,GC/AG 模式在这两个组织中占比最高（图b）。
使用Cufflinks软件对转录本定量，计算出FPKM值。
图a, 使用Tophat和START软件鉴定剪接位点。
图b，START软件鉴定的剪接
模式。
9、亚型甲基化的分析。
对剪接位点发生甲基化情况进行统计，发现CHG位点甲基化富集在受体位点上，而CG位点甲基化富集在供体位点（图a,b,c）。
并且发现CHG甲基化抑制可变剪接的发生，CG甲基化水平和isoform的数据正相关，CG甲基化促进可变剪接，而CHH甲基化和可变剪接没有显著相关性。
进一步分析发现，lnc-RNA 和non-lncRNA基因的起始和终止位点甲基化水平较低。
Non-lncRNA在基因体部分表现出更高的CpG甲基化模式，而lnc-RNA发生CHG 甲基化模式水平更高。
两者甲基化模式的不同，也反映出两者基因表达水平的差异。
图a，双链上的DNA甲基化情况。
图b，有义链上DNA甲基化情况。
图c，反义链上DNA甲基化情况。
优点
1、Long-reads单分子测序相比二代测序而言，获得更完整的转录本信息，实现对转录本精确重构。
2、玉米单分子测序结果改善了已注释的玉米基因组，校正之前一些错误的注释。
3、对转录本长度及基因融合等现象得到新的认知。
不足
仅凭对两种测序数据结果的比较分析，而缺少大量实验验证分析结果的准确性。
