最新转录组分析(RNA-Seq)

RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。

2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。

深度为10-30 Million reads。

）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。

大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。

我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。

这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。

首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。

接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。

再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。

然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。

再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。

对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。

这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。

也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。

因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。

转录组数据分析引言：转录组数据分析是研究生物体在特定条件下细胞内mRNA的表达情况的一种方法。

转录组数据分析的目的是识别差异表达的基因，揭示其在生物学过程中的功能和调控机制。

随着高通量测序技术的发展，转录组数据的获取变得更加容易和可行，因此转录组数据分析也成为生命科学研究中的重要工具之一。

本文将介绍转录组数据分析的基本流程和常用的分析方法。

一、转录组数据的获取转录组数据的获取通常使用高通量测序技术，例如RNA-Seq和microarray。

RNA-Seq是一种基于测序的转录组分析技术，可以直接测定细胞或组织中的mRNA的序列，无需参考基因组序列，因此能够检测到新的转录本和未注释的基因。

Microarray是一种基于杂交的转录组分析技术，通过固定的探针阵列检测RNA样本中的mRNA的水平。

两种技术各有优劣，研究人员可以根据自己的研究目的选择适合的方法。

二、转录组数据分析的基本流程转录组数据分析的基本流程包括数据预处理、差异表达分析和功能注释。

数据预处理是对原始转录组数据进行筛选、过滤和归一化处理，以得到可靠的表达量信息。

差异表达分析通过统计学方法找出在不同条件下差异表达的基因。

功能注释则针对差异表达基因进行功能分析，识别其参与的生物学过程和通路。

三、数据预处理数据预处理是转录组数据分析的第一步，其目的是筛选和过滤掉噪声数据，并对数据进行归一化处理。

常见的数据预处理步骤包括：读取原始数据、去除低质量读段、去除接头序列和低质量碱基、去除rRNA序列、对碱基进行质量修剪、进行序列比对和表达量计算、基因表达量归一化等。

数据预处理的目的是为后续的差异表达分析做好准备。

四、差异表达分析差异表达分析是转录组数据分析的核心步骤，它通过统计学方法找出在不同条件下差异表达的基因。

常见的差异表达分析方法有DESeq2、edgeR和limma等。

这些方法利用统计学模型和假设检验来计算基因表达的显著性差异，并生成差异表达基因列表。

原则上, 所有的高通量测序技术都能进行RNA测序。自2019 年以来, 以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的 Solexa 技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测 序技术相继诞生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出单 分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。新一 代测序又称作深度测序或高通量测序, 是相对于传统的 Sanger 测序而言,主要特点是测序通量高, 测序时间和成 本显著下降。各平台测序原理及序列长度的差异决定了各 种高通量测序仪具有不同的应用侧重
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景

RNA-seq⽅法原理、数据分析、数据库及⼯具介绍RNA-seq⽅法原理、数据分析、数据库及⼯具介绍能够对RNA序列数据进⾏分析的新⽅法可以让我们从头开始构建转录组。

对RNA进⾏测序⼀直以来都被认为是⼀种发现基因的有效⽅法，⽽且这种⽅法还被认为是对编码基因以及⾮编码基因进⾏注释的⾦标准。

与以前的⽅法相⽐，⼤规模平⾏RNA测序⽅法（massively parallel sequencing of RNA）极⼤增强了RNA测序技术的处理能⼒，使我们得以能够对转录组进⾏测序。

在本⽂中即将介绍到的这两种RNA测序⽅法就能以前所未有的精度对转录组进⾏分析。

Trapnell⼩组使⽤的⽅法是⼀种名为Cufflinks的软件。

这种软件能够随时发现⼩⿏⽣肌细胞（myoblast cell）内新出现的转录⼦，还能在细胞分化时对转录⼦表达⽔平进⾏监测，从⽽分析基因表达情况和剪接情况。

Guttman⼩组也使⽤了与 Trapnell⼩组相类似的软件⽅法，不过他们使⽤的是另⼀种名为Scripture的软件。

Scripture软件可以对源⾃三个⼩⿏细胞系的转录组进⾏再注释（reannotate），从⽽对数百个最近新发现的lincRNA（large intergenic noncoding RNA）进⾏完整的基因模式注释。

虽然RNA测序技术已经出现了将近20年，但直到最近才开始构建克隆⽂库。

对⼈类、⼩⿏以及其它重要模式⽣物进⾏全长基因克隆构建的科研项⽬需要⼏年的时间才能够完成。

但是有了最新的测序技术，我们将不再需要构建克隆⽂库，可以直接对cDNA⽚段进⾏测序。

我们现在可以只需要花费⼏天，仅⽤以往同类项⽬科研经费的很少⼀部分就能够得到⼀个⽐较满意的完整的细胞转录组。

但是这种新技术也存在⼀点问题。

不⽤构建克隆，我们就⽆法知道哪⼀个“结果（mRNA或蛋⽩）”来⾃哪⼀个转录⼦。

最近已经有⼈开始通过对已知的或者预测出来的转录⼦的短RNA序列进⾏测序的⽅式来对基因表达和可变剪接进⾏分析研究。

RNA-Seq项目常见问题与解答这两年随着测序成本的下降和转录组研究的日渐火热，RNA-seq俨然已经成为了分子生物学课题组推进项目的首选方向。

在我们接触的转录组项目中，有些老师对项目分析结果存在或多或少不清楚或有疑惑的地方。

那么春天来了，花儿开了，今天福利也到了，我们特意将转录组项目中常见的一些问题进行了汇总，各位老师可以按需自取哈。

1．如何判定生物学重复一致性的高低？生物学重复统计方法及公式答：（1）皮尔逊相关系数r可以作为生物学重复相关性的评估指标，理想的生物学重复试验r2≧0.92。

考虑到个体差异、取材环境、时间以及人员操作熟练程度等因素对测序数据的影响，一般r2≧0.8为可接受范围。

（2）Pearson（皮尔逊）相关系数：皮尔逊相关也称为积差相关（或积矩相关）是英国统计学家皮尔逊于20世纪提出的一种计算直线相关的方法。

2．DEG基因用Transcripts还是Unigenes？答：DEG基因用的是Unigene。

3．transcript-id代表什么意思？为什么有的基因有多个transcript-id？答：基因转录本id；因为可变剪切的缘故，一个基因可能有多个转录本。

4．在miRNA鉴定中，可能成为miRNA的reads是怎样计算的？哪些条件会影响到mrd值？micro RNA在不同组织有异构体的存在，是如何处理的？答：与 Rfam， miRbase， RepBase和 Exon\Intro 序列库进行比对，获得 sRNA 注释信息，以此作为预测新的 miRNA 的基础。

miRNA的鉴定是利用miRDeep2软件进行已知及新（保守及非保守）的miRNA鉴定。

miDeep2会在reads比对到基因组上的位置两端分别延伸75、15bp进行结构预测，此软件认为极可能与可能是miRNA的根据是通过mrd值来区分的，mrd>-10为可能，mrd>0为极可能；影响mrd值的有reads在基因组上的分布和碱基结合的自由能等；5．对于有生物学重复的项目，怎样计算差异基因？答：两两比对使用的是R的EBseq包, 是基于负二项分布检验的方式对reads数进行差异显著性检验，重复间的比对使用的是R的DEseq包，是基于分层贝叶斯模型的原理对组合内样品进行分析。

rnaseq数据分析流程RNA-seq数据分析流程。

RNA测序（RNA-seq）是一种用于研究转录组的高通量测序技术，它可以帮助科研人员了解基因表达和转录本结构。

在本文中，我们将介绍RNA-seq数据分析的一般流程，包括数据预处理、基因表达分析和功能注释等步骤。

1. 数据预处理。

首先，我们需要对原始的RNA-seq数据进行质量控制（QC）。

这包括使用软件如FastQC来评估测序数据的质量，检测是否存在低质量的碱基或测序错误。

接下来，我们需要对数据进行去除接头（adapter trimming）和过滤低质量读（quality filtering）。

这些步骤可以使用工具如Trimmomatic或Cutadapt来完成。

最后，我们需要对清洗后的数据进行比对到参考基因组（alignment），这可以使用软件如HISAT2或STAR来完成。

2. 基因表达分析。

一旦我们获得了比对到参考基因组的数据，我们就可以开始进行基因表达分析。

首先，我们需要对比对结果进行计数，这可以使用软件如featureCounts或HTSeq来完成。

然后，我们需要对表达数据进行标准化，例如使用DESeq2或edgeR来进行基因表达的差异分析。

最后，我们可以使用一些可视化工具如ggplot2或heatmap 来展示基因表达的模式和差异。

3. 功能注释。

最后，我们可以对不同表达的基因进行功能注释。

这包括对差异表达基因进行富集分析（enrichment analysis），例如富集在特定的通路（pathway）或生物学过程（biological process）中。

这可以使用工具如DAVID或Enrichr来完成。

此外，我们还可以对差异表达基因进行蛋白质-蛋白质相互作用分析（protein-protein interaction analysis），例如使用STRING数据库来预测蛋白质之间的相互作用网络。

总结。

综上所述，RNA-seq数据分析是一个复杂的过程，涉及到数据预处理、基因表达分析和功能注释等多个步骤。

转录组测序（RNA-seq）技术转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。

转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。

相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

技术优势：数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。

高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。

任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。

同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。

更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。

应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。

图1 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异康成生物提供的RNA-se q技术服务实验流程：1. 样品RNA准备2. 测序文库构建使用oligo dT微珠纯化mRNAmRNA片段化处理反转录反应合成合成双链cDNA双链DNA末端修复及3’末端加‘A’使用特定的测序接头连接DNA片段两端高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库3. DNA成簇（Cluster）扩增4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）5. 数据分析原始数据读取与数据库比对并进行注释深层次数据分析6. 提供实验报告原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息等。

RNA-Seq数据分析从原始的数据开始，进行reads回帖，到拼接转录本，计算表达量，分析差异表达，最后可视化分析结果。

TopHat是一个把reads回帖到基因组上的工具。

首先用Bowtie把reads 回帖到基因组上，然后通过拼接，我们就可以在基因组上看到一些reads堆叠起来的区域，称为consensus,这些consensus可能是一个真的外显子，也有可能是几个外显子拼在一起的，或者一些别的情况。

我们知道，经典的剪切位点一般都有GT和AG这样的序列标志，在consensus的边界和内部，TopHat会去找这样的剪切位点，并且得到他们可能的组合。

然后对于那些没有被Bowtie贴到基因组上的reads,TopHat会对他们建立索引，去和这些可能的剪切位点比对，这样就把跨越剪切位点的reads准确地贴到基因组上。

一些比较重要的命令行选项。

关于插入片段长度的选项：在RNA-Seq中，会把mRNA打断成小的片段，然后对片段长度进行iding筛选后拿去测序，如果选择的片段长度是300bp，两端各测序75bp的reads,中间的插入片段长度就应该设为150bp.下面是设置插入片段长度的标准差，如果选择的片段长度比较集中，这个值可以设置的小一些，反之应该设置得大一些。

-G选项是提供哦呢一个已有的注释文件。

如果你分析的基因组被注释得比较好了，最好能够提供这个文件，这时TopHat就会先把reads往转录组上贴，没有贴到转录组上的再往基因组上贴，最后把结果合并起来。

我们知道大多数的转录组都是比基因组小得多的，而且junction reads可以直接贴到转录本上，所以这样回帖的效力和准确度都可以得到提高。

标准的Illumina平台是不分链的，我们无法知道配对的reads哪个方向和转录本一致，哪个和转录本反向互补。

对于分链的数据，也有两种情况，在firststrand这种分链方法中，第二个read和转录本方向一致，第一个read和转录本反向互补，在另一种fr- secondstrand分链方法中，就刚好反过来了。

RNA-seq转录组的测序技术一、概述1. RNA-seq技术简介在过去的几十年中，研究人员利用转录组学技术对生物体中的RNA 进行研究，以揭示基因表达调控和基因功能等方面的信息。

而RNA-seq技术则是近年来兴起的一种高通量测序技术，逐渐替代了传统的microarray技术，成为了研究转录组学的主流方法之一。

二、RNA-seq的原理1. 测序库构建在进行RNA-seq实验之前，首先需要构建测序库。

通常采用聚合酶链式反应(PCR)或者DNA和RNA的逆转录(Reverse Transcription)来将RNA转录成双链DNA，并添加barcode标签，最后形成文库。

2. 高通量测序完成测序库的构建后，需要使用高通量测序技术对文库中的DNA 进行测序。

目前常用的测序评台包括Illumina、Ion Torrent、PacBio 等公司的测序仪器。

高通量测序技术能够快速、高效地获取大量的基因序列信息。

三、RNA-seq的优势1. 高灵敏度与传统的microarray技术相比，RNA-seq能够提供更高的灵敏度和动态范围，能够检测到低表达水平的基因，同时也能够覆盖更广泛的基因组区域。

2. 高分辨率RNA-seq能够提供单个碱基的分辨率，帮助研究人员更准确地识别基因的外显子、内含子和剪切异构体。

3. 无需先验信息相比于microarray技术需要先知道待检测基因的序列信息，RNA-seq技术能够在不依赖已知基因组信息的情况下进行测序。

四、RNA-seq的应用1. 基因表达水平分析RNA-seq能够帮助科研人员进行基因表达水平的定量和定性分析，揭示基因在不同组织、不同环境条件下的表达规律。

2. 剪切异构体分析通过RNA-seq技术可以发现和识别基因的各种剪切异构体，帮助了解基因的调控机制。

3. RNA编辑和融合蛋白质的细致分析RNA-seq技术也被广泛应用于RNA编辑和融合蛋白质的研究，为研究人员提供了一种便捷的方法。

Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end Solexa Sequencing
-6-微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端 ��� 4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx） 5. 数据分析 ������ 原始数据读取 ������ 与数据库比对并进行注释 ������ 深层次数据分析
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS） 原则上, 所有的高通量测序技术都能进行RNA测序。自2005 年以来, 以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的 Solexa 技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测 序技术相继诞生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出单 分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。新一 代测序又称作深度测序或高通量测序, 是相对于传统的 Sanger 测序而言,主要特点是测序通量高, 测序时间和成 本显著下降。各平台测序原理及序列长度的差异决定了各 种高通量测序仪具有不同的应用侧重
2、就目前来看, 作为两个高通量的转录组 学研究技术, 在应用的某些方面既存在重叠 和竞争也存在优势互补, 一种技术能弥补另 一种技术遗漏的部分, 通常对一个生物学问 题的回答需要不同实验技术的协同配合

转录组研究新技术RNASeq及其应用一、本文概述随着生物信息学和分子生物学的快速发展，转录组研究已成为解析生命活动重要机制的关键手段。

近年来，新一代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）的崛起，特别是RNA测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）技术的广泛应用，极大地推动了转录组学研究的深度和广度。

RNA-Seq技术以其高分辨率、高灵敏度和高定量的特性，在基因表达分析、非编码RNA研究、基因结构变异分析等领域展现出强大的潜力。

本文旨在全面介绍RNA-Seq技术的基本原理、实验流程、数据分析方法，以及其在生命科学各领域中的实际应用，以期为相关研究人员提供有益的参考和启示。

二、RNASeq技术概述RNA测序（RNASeq）是一种革命性的技术，极大地推动了转录组学的研究进程。

该技术基于下一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）平台，可以对生物样本中的RNA进行全面、精确的测序和分析。

RNASeq不仅提供了转录本的序列信息，还能够揭示转录本的表达水平、剪接方式、变异情况以及基因结构等重要信息。

RNASeq的实验流程通常包括样本制备、文库构建、测序和数据分析等步骤。

在样本制备阶段，需要提取高质量的RNA，并通过一系列的处理步骤去除杂质和降解的RNA。

文库构建是RNASeq技术的核心，其目标是将RNA片段化、反转录成cDNA，并构建成适合测序的文库。

测序阶段则利用NGS平台对文库进行高通量测序，获得大量的序列数据。

数据分析是RNASeq技术的另一个关键环节。

通过对测序数据的处理和分析，可以鉴定出转录本、评估基因表达水平、发现可变剪接事件、识别基因融合以及探索非编码RNA等。

RNASeq技术还可以与表观遗传学、蛋白质组学等其他组学技术相结合，从多个层面揭示生命活动的复杂性和多样性。

RNASeq技术的应用范围非常广泛，涵盖了基础生物学研究、疾病机理探索、药物研发等多个领域。

RNA-seq数据分析指南五月份看了一篇2016年的RNA-Seq文献综述，那篇文献特别长，花了三四天时间才看完。

当时为了做组会文献报告做了一些许总结，以ppt的形式呈现出来。

内容前言•各位同学/老师，大家好，现在由我给大家讲讲我的文献阅读报告！•A survey of best practices for RNA-seq data analysis ,我把它叫做RNA-seq数据分析指南。

这篇文章是由佛罗里达大学等单位的研究人员在1月26日发表在Genome Biology上的，该期刊的影响因子有10.8分。

这是这篇文章的通讯作者，应该挺靠谱的。

•新一代测序技术在爆炸式发展的同时，也衍生出许多其他技术创新。

RNA-Seq就是其中之一，这项技术使我们对细胞发育及其调控机制的理解，达到了前所未有的深度和广度。

RNA-seq可以获得相当惊人的数据量，而这恰恰是一柄双刃剑。

丰富的数据量蕴含着大量的宝贵信息，但这样的数据需要复杂的生物信息学分析，才能从中提取到有意义的结果。

•正因如此，数据分析可以说是RNA-seq的重中之重。

RNA-seq 有非常广泛的应用，但没有哪个分析软件是万能的。

科学家们一般会根据自己的研究对象和研究目标，采用不同的数据分析策略。

现在人们已经发表了大量的RNA-seq和数据分析方案，对于刚入门的新手来说难免有些无所适从。

这篇文章概述了RNA-seq生物信息学分析的现行标准和现有资源，为人们提供了一份RNA-seq数据分析指南，可以作为开展RNA-seq研究的宝贵参考资料。

•这份指南覆盖了RNA-seq数据分析的所有主要步骤，比如质量控制、读段比对、基因和转录本定量、差异性基因表达、功能分析、基因融合检测、eQTL图谱分析等等。

研究人员绘制的RNA-seq分析通用路线图(标准Illumina测序)，将主要分析步骤分为前期分析、核心分析和高级分析三类。

前期预处理包括实验设计、测序设计和质量控制。

转录组测序技术的新进展随着基因组学的迅猛发展，转录组学作为功能基因组学的重要分支，在生物学研究中扮演着越来越重要的角色。

转录组测序技术（RNA-seq）作为转录组学的重要工具，近年来也得到了广泛的应用。

那么，随着科技的不断发展，转录组测序技术有哪些新进展呢？一、单细胞RNA-seq传统的RNA-seq技术需要提取组织或细胞的总RNA，这样就无法获得单个细胞的转录组信息。

然而，单个细胞的RNA-seq技术的出现，为单个细胞的研究提供了新的途径。

单个细胞RNA-seq可以从单个细胞中分离出RNA，用于研究不同类型的细胞之间的差异和细胞的发育分化等方面。

单个细胞RNA-seq还可以解决组织异质性和细胞异质性等问题，进一步推动个体化医疗的发展。

二、原位RNA-seq原位RNA-seq是指在组织切片中进行的RNA-seq。

这项技术可以对组织的转录组进行准确的测量，同时保持组织的空间结构与组织组成不变。

原位RNA-seq可用于准确识别与细胞类型和组织环境有关的基因表达，并提供更深入的组织学和生物学信息。

原位RNA-seq与组织病理学相结合，可用于疾病诊断和治疗等方面。

三、长读长分子RNA-seq长读长分子RNA-seq是指对长于300bp的RNA进行直接测序。

与传统的短序列RNA-seq相比，长读长分子RNA-seq不需要进行RNA的裁切和组合，可以在RNA分离、扩增、文库制备等步骤中避免RNA降解和片段化等问题。

长读长分子RNA-seq不仅能够识别已知的基因和剪接变体，还能够识别未表达的基因，揭示更为准确的转录组信息和剪接模式，尤其是在复杂的转录组中。

四、人工智能分析转录组测序技术的数据量大、复杂、五花八门，如何从海量的转录组数据中分析出有用的结果成为了瓶颈问题。

近年来，人工智能（AI）技术的应用，为转录组测序数据的分析提供了新的思路。

基于深度学习的人工智能算法，可以更准确地进行细胞类型的区分，剪接变异的鉴定和特殊转录本的识别等。

基于RNA测序的转录组分析技术RNA测序（RNA-Seq）技术是近年来生物医学领域发展最快、最引人注目的研究技术之一。

RNA-Seq技术以高通量的方法快速地测序RNA样本中的所有RNA，包括编码RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA），从而全面了解转录组中遗传信息的表达情况和调控机制。

一、 RNA测序技术的优势相对于传统的Sanger测序，RNA-Seq技术有以下优势：1.高通量，能快速测序大量RNA分子，获得全面丰富的转录组信息。

2.扩展性强，能够检测所有RNA分子类型（编码、非编码RNA），能支持多种样本类型的测序（细胞、组织、血清等）。

3.高灵敏度，能够检测低表达的RNA，同时对表达水平动态变化很敏感，有助于发现新的生物学过程。

4.高精度，优异的测序深度和覆盖度可使结果更加可靠。

二、 RNA测序技术的应用RNA测序技术在基础研究和临床诊断等方面都有广泛的应用。

1.发现新的RNA分子类型：利用RNA-Seq技术可以发现新的RNA分子类型，如Circular RNA（circRNA）、Long non-coding RNA（lncRNA）等，对了解RNA基因调控机制有重要意义。

2.全面理解基因调控网络：RNA-Seq技术可以发现与基因调控相关的RNA分子和代谢物，从而全面理解基因调控网络。

3.疾病基础研究：RNA-Seq技术可用于发现疾病相关的RNA 分子和调控途径，如肿瘤、神经退行性疾病等，是研究疾病机制和筛选治疗靶点的重要工具。

4.患者个性化诊断和治疗：RNA-Seq技术可以发现患者个体基因表达的差异，从而为个性化治疗和诊断提供基础。

三、 RNA测序技术的分析流程RNA测序技术的分析流程一般包括以下步骤：（1）RNA提取和质检：选择适当的RNA样本，进行RNA提取和质检，确保RNA质量达到要求。

（2）文库构建：根据测序需求选择不同的文库构建方式，如，随机分段转录组文库、chain termination转录组文库等。

近年来对酿酒酵母栗酒裂殖酵母拟南芥水稻小鼠人和人体白色念珠菌的转录组测定结果都显示出大量的新转录区域并且其中许多转录水平都低于已知的cdna基由于rnaseq相对于传统的测序方法具有明显的优势所以被广泛运用到差异基因表达分析新转录本发现可变剪切研究等方面
RNA-seq技术原理及应用
报告人：柳晓东 2012.4.16
三、RNA-seq技术优势
• 相对于传统的sanger测序法，RNA-seq具有以下优势： • 1、数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨 率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的 交叉反应和背景噪音问题。 • 2、高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。 • 3、任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此 无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。 同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪 切位点及cSNP，UTR区域。
二者的关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系， 测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。 当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控 制均得以保证。
er million reads）是每百万读 段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:
RNA-seq测序数据的分析
五、RNA-seq发展前景
• 由于RNA-seq相对于传统的测序方法具有明显的优势，所以 被广泛运用到差异基因表达分析，新转录本发现，可变剪 切研究等方面。并且随着技术的进步，成本的降低，其应 用也越来越广泛。近年来，由RNA-seq技术测序而发表的文 章越来越多，而且对于测序结果进行分析的软件也也越来 越丰富，相信在不久的将来，RNA-seq技术能够获得相当大 的普及。

BulkRNA-seq转录组分析Reference :我们⾃⼰测得的数据：交代⼀下需要准备的数据：⾸先要有双端测序的.fa.qz⽂件,要⽤⽹上下好的gene注释⽂件，hisat2需要⽤到，具体如何下载，见上⾯两个链接注：也可以利⽤.fa⽂件⽣成对应的索引⽂件，命令如下：$HISAT_HOME/hisat-build $HISAT_HOME/example/reference/22_20-21M.fa 22_20-21M_hisat//构建索引的命令如上，跟bowtie⼀样我修改了⼀下/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat-build 22_20-21M.fa my_hisat_index//连⽇志都跟bowtie⼀模⼀样，哈哈，可以看到我们的这个参考fasta⽂件 22_20-21M.fa 就变成索引⽂件啦，索引还是很多的！1. 先对数据进⾏质控/home/glab/Shanyr/software/FastQC/fastqc -o ./20200910-Liver-D4/neg/ ./20200910-Liver-D4/neg/neg_R1.fq.gz ./20200910-Liver-D4/neg/neg_R2.fq.gz2. 然后可以采⽤上⾯ref中的⽅法对数据进⾏质控，去掉认为是质量不好的readstrim_galore：可以处理illumina，nextera3，smallRNA测序平台的双端和单端数据，包括去除adapter和低质量reads。

trim_galore的参数： trim_galore的参数在处理过程⽐较重要：trim_galore -output_dir clean --paired --length 75 --quality 25 --stringency 5 seq_1.fasq.gz seq_2.fastq.gz3. ⽐对，⽣成bam⽂件：“将RNA-seq的测序reads使⽤hisat2⽐对对参考基因租组”/home/glab/Shanyr/software/hisat2-2.1.0/hisat2 -p 16 -x ../../../bulk_rnaseq/jky-z001/refdata-cellranger-hg19-3.0.0/genes/genome_tran -1 ../neg/neg_R1.fq.gz -2 ../neg/neg_R2.fq.gz -S ../neg/neg.sam注： -1和-2分别表⽰双端测序的1个⽂件，后⾯跟的是⽂件路径，⼀定要注意 /data/RNAseq/mm10/genome⽂件的⽬录，genome这个不是⽂件夹，是index⽂件的前缀，我的mm10⽂件下并没有这个⽂件，如果不加genome就会发⽣如下报错：4. htseq-count ⽣成计数矩阵htseq-count -f sam -r name -s no -a 10 -t exon -i gene_name neg.sam ../../../bulk_rnaseq/jky-z001/refdata-cellranger-hg19-3.0.0/genes/genes.gtf > neg.txt。

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总结
高通量测序技术的应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一个方面，除此之外，基因组的从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 同样有着广泛的应用。
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RNA-seq技术原理及应用
主要内容
1、RNA-seq技术简介 2、RNA-seq技术原理 3、RNA-seq结果分析 4、RNA-seq技术应用
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一、RNA-seq技术简介
1.诞生于 20 世纪 70 年代的 Sanger 法是最早被广 泛应用的 DNA 测序技术，也是完成人类基因组计 划的基础。
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
2、转录本变异研究 在发现序列差异方面，如融合基因鉴定、编码
序列多态性研究等，RNA-seq也具有很大的潜力。
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三、RNA-seq结果分析
RNA-seq 数据的基本处理
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三、RNA-seq结果分析
1. 序列定位算法
（1）空位种子索引法：首先将读段切分，并选取其中一段 或几段作为种子建立搜索索引，再通过查找索引、延展匹配来 实现读段定位 ，通过轮换种子考虑允许出现错配的各种可能的 位置组合（Maq）。
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二、RNA板扩增
序列组装和比较
图像获得和处理
TGCT…
1234
TTTT…
簇序列读取反应