PCR介导的定点突变与随机突变的应用
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定点诱变技术
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Single gene shuffling
. .. . ....... library of point mutants
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
在正常情况下，尿嘧啶Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺 入DNA中的尿嘧啶残基。但 在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut- ung-菌株 中生长的M13噬菌体的单链基 因组DNA中将含有20-30个尿 嘧啶残基。用这些噬菌体感染 ung+菌株，尿嘧啶被迅速去 除，DNA链遭到破坏，感染 力下降约5个数量级。
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works ？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
多功能氧化酶的定向进化 （Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works ？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化 （Su-Hua Huang等,2004）
定点突ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的研究意义
1.对调控区进行突变
研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
PCR介导的基因突变
在基因5’和3’末端产生突变 重叠延伸PCR 大引物PCR法
PCR突变技术方法概览
PCR突变技术方法概览1基于PCR 的体外诱变技术定点突变的方法很多，而基于 PCR 的定点突变技术由于其突变效率高，操作简单，耗时短，成本低廉等优点而倍受瞩目。
近十年来，基于 PCR 的定点突变技术获得了长足的发展，目前运用此技术已能实现各种类型的基因突变。
基因突变实验包括以下几个步骤:1目的基因全序列变异文库的构建;2利用高通量表达筛选载体从变异文库中筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。
1.1 重叠延伸PCR（over-lap extension PCR OE-PCR）这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除及插入。
其基本原理如图（1）所示。
首先设计两个 PCR 反应以产生两个含突变位点的 DNA 片段，随后将上述两个 PCR 产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次 PCR 产物进行纯化处理可显著提高突变效率。
OE-PCR 不足之处在于：○1一个突变需要两对引物，3次 PCR，并且需对中间产物进行纯化。
相对而言步骤较烦琐，不经济；○2由于 DNA 二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合导致目的产物得率很低；○3当利用 Taq 聚合酶进行PCR 反应时，经常在 PCR 产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生非预期的移码突变。
针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR 进行了改进。
1997年，Urben等提出一步重叠延伸 PCR 法（one-step overlap extension PCR），使得三个 PCR 反应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。
其原理是首先将待突变的 DNA 以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同（例如pUC18,19）。
环状质粒 pcr 构建定点突变序列
环状质粒 pcr 构建定点突变序列标题：环状质粒PCR构建定点突变序列在遗传工程领域，环状质粒PCR技术被广泛应用于构建定点突变序列，以实现对目标基因的精确控制和调节。
本文将介绍环状质粒PCR构建定点突变序列的原理、步骤以及应用前景。
一、原理环状质粒PCR是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，通过引入特定的引物和模板DNA，可以在特定位点引发突变。
其原理主要包括以下几个步骤：1.设计引物：根据目标基因序列，在突变位点的上下游设计引物，确保能够选择性扩增目标序列。
2.扩增反应：将设计好的引物与模板DNA一起加入PCR反应体系，进行多轮的循环反应，使目标序列得以扩增。
3.定点突变：在PCR反应体系中加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列进行配对，从而引发突变。
4.纯化和检测：通过凝胶电泳或其他检测手段，验证突变序列的引入是否成功。
二、步骤环状质粒PCR构建定点突变序列的步骤如下：1.设计引物：根据目标基因序列，利用生物信息学工具设计引物，确保引物的特异性和扩增效率。
2.模板制备：从目标基因所在的质粒中提取模板DNA，确保模板的纯度和完整性。
3.反应体系准备：根据PCR反应的需要，准备好反应缓冲液、酶、引物和dNTP等试剂。
4.扩增反应：将模板DNA与反应体系混合，利用PCR仪进行循环反应。
根据目标序列的长度和复杂性，设置合适的扩增程序和循环次数。
5.突变引入：在PCR反应的合适环节，加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列发生配对，引发突变。
6.纯化和检测：通过凝胶电泳等方法，纯化扩增产物并进行突变检测，确认突变序列的引入是否成功。
三、应用前景环状质粒PCR构建定点突变序列具有以下应用前景：1.基因功能研究：通过引入特定的突变序列，可以研究目标基因的功能和作用机制，揭示基因与表型之间的关系。
2.基因工程改良：利用定点突变序列构建新的基因表达载体，可以实现对基因表达的精确调控，为基因工程改良提供技术支持。
pcr介导的定点突变概念 -回复
pcr介导的定点突变概念-回复PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可以扩增DNA 片段。
PCR介导的定点突变是通过PCR技术实现对DNA序列的定点突变。
本文将一步一步回答有关PCR介导的定点突变的相关问题。
第一步：基本原理PCR介导的定点突变利用了PCR的扩增原理和定点突变的策略。
PCR是通过DNA聚合酶酶对DNA模板进行复制，通过不断的循环扩增，使得从原始DNA模板中放大出特定的DNA片段。
而定点突变是指在特定的位点中引入突变。
因此，PCR介导的定点突变就是在PCR扩增过程中，通过引入特定的引物和条件，使得扩增的产物在特定位点发生突变。
第二步：PCR介导的定点突变策略PCR介导的定点突变有多种策略，其中常用的有两种：引物扩增和引物合成。
（1）引物扩增策略：这种策略通常使用两对引物，分别为5'引物和3'引物。
其中，5'引物和3'引物的设计需要根据目标位点的序列来选择。
在引物的设计中，可以通过引入特定的碱基改变在扩增过程中产物的序列。
例如，在引物的3'端加入一个碱基缺失或错配，就可以实现定点突变。
（2）引物合成策略：这种策略是通过合成特定的引物来实现定点突变。
合成的引物包含了目标序列的突变部分，通过PCR扩增使得扩增产物在特定位点发生突变。
这种策略适合于需要产生多个突变位点的研究。
第三步：PCR介导的定点突变步骤PCR介导的定点突变通常包含以下几个步骤：（1）引物设计与合成：根据目标位点的序列，设计合适的引物。
引物的设计需要遵循一些原则，如引物长度、引物的GC含量、引物间的配对等。
设计合适的引物后，可以选择将引物进行合成，也可以选择自行合成。
（2）PCR扩增反应：将设计好的引物加入PCR反应体系中，与模板DNA 进行扩增。
PCR反应体系通常包括模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等。
在PCR反应过程中，通过控制反应的温度和时间，使得引物与DNA模板特异性结合，通过连续扩增循环，产生大量扩增产物。
pcr定点突变技术原理
pcr定点突变技术原理
PCR定点突变技术是指基于聚合酶链反应技术和脱氧核糖核酸（DNA）技术，通过检测特定位点的特定DNA序列，以及该特定位点在
基因突变中发生变化的方法。
该技术通过引入多个PCR扩增特定序列，并在PCR产物中检测突变位点。
整个PCR定点突变分析流程包括：DNA
提取、PCR扩增、筛选、突变检测、数据分析等步骤。
第一步，先从患
者的脱氧核糖核酸（DNA）样本中取出要检测特定位点的特定DNA序列；第二步，涉及倍性引物的PCR扩增得到的DNA复制物，称为弧菌状病
毒（HCV）；第三步，以线性化步骤将弧菌状病毒和分子材料分离出来，生成紫外可见化质粒，只保留差异片段；第四步，读取所有特征模式，以获得有效的特征模式，以及发现相关的突变和多态性；第五步，通
过对所有样本进行数据挖掘来识别单项显著突变，以确定检测突变位
点的实验结果。
PCR定点突变技术是一种快速、准确的技术，使得迅速检测基因变
异和检测新发现的个体基因变异变得可能，完成病原菌或其他物质的
突变检测，为基因治疗、基因疾病的诊断和治疗，基因改造有重要的
应用前景。
氨基酸突变方法
氨基酸突变方法引言：氨基酸突变是生物学研究中的一个重要课题，它可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关系，以及基因突变对生物体的影响。
本文将介绍几种常见的氨基酸突变方法，包括随机突变、定点突变和定向进化等方法。
一、随机突变法：随机突变法是一种经典的氨基酸突变方法，它通过引入随机突变源（如化学物质或辐射）来导致基因序列的随机突变。
这种方法可以产生大量的突变体，从中筛选出具有特定性状或功能的变异体。
然而，由于随机突变的性质，其突变结果可能不可预测，因此需要进行大规模筛选和分析。
二、定点突变法：定点突变法是一种有针对性的氨基酸突变方法，它通过人工合成或基因工程技术，将目标基因的某个氨基酸残基替换为其他氨基酸。
这种方法可以精确控制突变的位置和类型，从而研究特定氨基酸对蛋白质结构和功能的影响。
常用的定点突变方法包括PCR扩增、基因克隆和基因编辑等技术。
三、定向进化法：定向进化法是一种结合了随机突变和筛选的氨基酸突变方法，它可以通过长时间的进化和筛选来获得具有特定性状或功能的变异体。
这种方法通常通过构建突变体库、筛选和再进化等步骤来实现。
定向进化法可以通过逐步优化和筛选，获得更好的突变体，对于研究蛋白质功能和优化酶的性能具有重要意义。
四、其他突变方法：除了以上介绍的方法外，还有一些其他的氨基酸突变方法。
例如，基于自然突变的方法可以利用已知的自然突变位点来进行模拟和研究；基于结构模型的方法可以通过蛋白质结构预测和模拟来设计突变位点和类型；基于进化模型的方法可以利用进化信息来指导突变设计和筛选。
这些方法都有各自的优缺点，可以根据具体研究目的和条件选择合适的方法。
结论：氨基酸突变是研究蛋白质结构和功能的重要手段，具有广泛的应用前景。
随机突变、定点突变和定向进化等方法可以用来研究氨基酸对蛋白质性质的影响，优化酶的催化性能，甚至设计新的功能蛋白质。
通过不同的突变方法，研究人员可以深入探索氨基酸序列与蛋白质结构、功能之间的关系，为生物学和医药领域的研究提供有力支持。
定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变是指在基因组中特定的位置发生的变异事件。
这些定点
突变可以是单个碱基的替代、插入或删除，也可以是染色体片段的重排和
结构变化。
基因定点突变是遗传学和分子生物学研究中的重要技术，具有
广泛的应用前景。
在基因定点突变的研究中，常用的方法包括基于随机突变和基于定点
突变的方法。
一、基于随机突变的方法：
1.化学诱变：通过化学物质如亚硫酸乙基甲酯(EMS)或N-亚硝基-N-
乙基脲(ENU)等诱导基因组范围内的突变。
这些突变通过对群体进行筛选
和筛选，从而找到目标基因的突变。
2.辐射突变：用射线如X射线、γ射线，或放射性物质如乙烯基腈，等辐射处理生物体，以诱导其基因组上的随机突变。
基于随机突变的方法广泛应用于物种、疾病、发育和进化等研究中。
它们可以帮助揭示基因功能的重要性和与特定物种和表型相关的基因。
二、基于定点突变的方法：
1.基因敲除/敲入：通过合成受损的DNA片段或外源DNA片段，将其
导入到目标基因中，从而造成其功能异常或置换为新的基因序列。
这种方
法可用于明确或验证基因的功能，并探索特定突变的表型影响。
定点突变的原理和应用
定点突变的原理和应用1. 定点突变的定义定点突变是指在DNA序列中发生的局部突变，导致该位置的碱基序列发生改变。
这种突变只发生在特定的位点上，不会影响其他的DNA区域。
2. 定点突变的原理定点突变通常是通过基因编辑技术实现的，最常用的技术是CRISPR/Cas9系统。
以下是定点突变的原理步骤：•选择目标基因：首先需要选择一个或多个目标基因进行突变。
•设计RNA引导序列：设计一个RNA引导序列，使其能够与目标基因的特定区域配对。
•制备Cas9蛋白：将Cas9蛋白在实验室中通过重组技术制备出来。
•激活CRISPR/Cas9系统：给细胞提供Cas9蛋白和RNA引导序列，激活CRISPR/Cas9系统。
•RNA引导序列与目标基因配对：激活后的Cas9蛋白会与RNA引导序列形成复合物，引导该复合物与目标基因的特定区域配对。
•Cas9蛋白的剪切活性：一旦Cas9蛋白与目标基因配对成功，其剪切活性会被激活，导致目标基因的突变。
3. 定点突变的应用定点突变技术在生命科学研究和生物工程领域有广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用领域：3.1 疾病研究通过定点突变技术，可以模拟、研究多种遗传性疾病。
通过突变引入到实验动物模型中，可以深入了解疾病的发生机制、病理过程和潜在治疗方法。
3.2 基因治疗定点突变技术可以用于基因治疗，通过修复特定基因的突变来治疗某些遗传性疾病。
例如，修复CFTR基因的突变可以治疗囊性纤维化。
3.3 遗传改良定点突变技术可用于改良作物品种，使其具有更好的品质、更高的产量或更强的抗逆能力。
3.4 新药开发定点突变技术可以用于研究药物的作用机制和副作用，以及筛选潜在的药物靶点。
3.5 细胞工程通过定点突变技术，可以对细胞进行工程改造，从而使其具有特定的功能或性状，广泛应用于医药、能源和材料等领域。
4. 定点突变技术的优势和挑战定点突变技术相比传统的突变技术具有以下优势：•准确性：定点突变技术可以实现特定位点的精确突变，避免了无关的突变。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
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随 机 突 变 ＰＣＲ 的 优 点 之 一 是 在 无 需 分 离 克 隆和获得序列信息的情况下， 可以对核酸群体进 行重复随机突变。得到突变体库以后筛选出有特 殊性质的个体， 该个体还可直接用作第二次突变
ＰＣＲ 的模板， 连续反复地进行随机诱变， 使每一次 获得的小突变累积而发生重要的有益突变。
［参考文献］
任桂杰， 等 ． ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
８６７
合酶进行不正确拷贝时随机引入突变。通过调整 核苷酸、酶及镁离子的用量， 获得无序列倾向性的 突变体库。
随机突变 ＰＣＲ 应使用 ｃＤＮ源自 或仅含有目的序 列的双链 ＤＮＡ 片段作模板， 一般不用质粒 ＤＮＡ， 也不用基因组 ＤＮＡ。随机突变 ＰＣＲ 方 法 对 模 板 ＤＮＡ 的长度限制在约 １０００ 核苷酸。对于较长靶 ＤＮＡ 的突变， 可将其分为若干片段分别进行。
［３］ 颜子颖， 王海林， 译． 金冬雁， 校． 精编分子生物学实验 指南［Ｍ］． 北京： 科学出版社， １９９８． ２５２－２５３． ［收稿日期 ２００４－１２－０６］
（编辑：孙玉芝）
（上接第 ８６２ 页）
［２］ 肖 波 ， 王 晓 云 ， 叶 晖 ， 等 ． 电 视 录 像 脑 电 图 在 癫 痫 及 其 他 发 作 性 疾 病 中 的 诊 断 价 值 探 讨 ［Ｊ］． 中 华 神 经 科 杂 志 ， ２００２， ３５： ３４５．
任桂杰 １， ２ ， 王志玉 １
（ 山东大学 １．公共卫生学院病毒学研究室； ２．医学院生化与分子生物学研究所，山东 济南 ２５００１２）
［关键词］ 聚合酶链反应；定点突变；随机突变 ［中图分类号］ Ｑ７５４ ［文献标识码］ Ｂ
蛋白质的结构与其功能之间的关系是蛋白质 组学研究的重点内容之一。体外突变技术是研究 这种复杂关系的有力工具， 也是实验室中改造／优 化基因常用的手段［１］。定点突变技术可对某个已知 基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入； 随 机突变则可在特定编码序列的多个位点上产生随 机的突变体。我们现介绍两种在实验中总结出来 的用 ＰＣＲ 方法对克隆化 ＤＮＡ 进行定点突变和随 机突变的技术。
３．１ 定 点 突 变 体 外 定 点 突 变 技 术 是 一 种 功 能 强大的方法， 可用于对蛋白质功能的研究， 确定酶 的活性位点， 以及在药物筛选中设计新的蛋白等。 ＰＣＲ 介导产生定点突变体的设计与传统的定点突 变方法不同， 它无需单链 ＤＮＡ 中间物， 回避了使 用 Ｍ１３ 系 列 噬 菌 体 载 体 及 其 他 辅 助 病 毒 制 备 单 链 ＤＮＡ 的过程［３］， 从而缩短了实验所需要的时间。
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 克隆载体、目的基因和菌株 载体为 ｐＢ－ ＳＫ＋质粒 ＤＮＡ。基因克隆的重组质粒由美国麻省大 学 Ｉｏｒｉｏ 博士惠赠。新城疫病毒融合蛋白基因被插 入 ＸｈｏⅠ切点（ ６６８） ； 副流感病毒融合蛋白基因被 插入 ＢａｍＨⅠ切点（ ７１９） 。大肠杆菌 ＴＧ１ 由本室保 存。 １．１．２ 试 剂 Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ ５ Ｕ／μｌ， ＴａＫａＲａ ＤＲＲ０１ＡＭ） ； 常规 １０×Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶缓 冲 液 ； ｄＮＴＰ 混 合 物 ； 天 然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ Ｆｅｒ－ ｍｅｎｔａｓ 公司， ＃ＥＰ０２８１） 或 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶； 自配１０×致突变 ＰＣＲ 缓冲液： ７０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５ ℃）， ０．１％（ｗ／ｖ）明胶。１０×ｄＮＴＰ 混合物： ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＧＴＰ， ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＡＴＰ， １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＣＴＰ 和 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＴＴＰ。５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２ （ 事 先 不 要 与 １０×致 突 变
［３］ 王 纪 文 ， 李 保 敏 ， 孙 若 鹏 ， 等． 儿 童 癫 痫 视 频 脑 电 图 监 测 及 诊 断 价 值 探 讨 ［Ｊ］． 中 国 实 用 儿 科 杂 志 ， ２００３， １８： ２２１．
［４］ 张文渊． 有关睡眠分期以及便携式、动态和视频脑 电 图等问题［Ｊ］．临床神经电生理学杂志， ２００１， １０： １８７．
［１］ 黄 培 堂 ， 王 嘉 玺 ， 朱 厚 础 ， 等 译 ． 分 子 克 隆 实 验 指 南 ［Ｍ］ ． 北京： 科学出版社， ２００３． １ ０８０－１ ０８７．
［２］ 黄 培 堂 ， 俞 炜 源 ， 陈 添 弥 ， 等 译 ． ＰＣＲ 技 术 实 验 指 南 ［Ｍ］． 北京： 科学出版社， １９９８． ４１６－４２５．
已 有 研 究 证 明［２］， 含 有 短 同 源 末 端 的 ＤＮＡ 片 段可以在 Ｅ．ｃｏｌｉ 胞内进行分子间重组， 即 ＰＣＲ 产 生的同源末端可通过体内重组使 ＤＮＡ 连在一起， 形成环状重组体。如果环状重组体分子含有复制 序列和选择标记， 那么这种重组体则更易于筛选。
点突变引物通常为 ２５～３５ 个核苷酸， 突变的 位置一般放在引物的中间。无突变的引物一般长 度为 ２０～３０ 个核苷酸。两种 ＰＣＲ 引物的末端最好 有 ２４ 个左右的同源核苷酸。突变体的设计最好是 消除或产生一个限制酶识别位点， 以便有效地筛 选出突变产物。此种定点突变方法构建的目的产 物特异性高， 但转化率低， 平均每纳克 ＤＮＡ 只产 生 １０ 个带突变的克隆。因此需用高度感受态的大 肠 杆 菌 （ 转 化 效 率 ＞１ ×１０９ 转 化 子 ／μｇ 单 体 ｐＵＣ１９） 。如果没有高度感受态的大肠杆菌， 那么 转化后 ３７ ℃复苏 １ ｈ， 可将全部样品涂在平板上， 可以提高筛选的效率， 节省实验时间。
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（ Ｎｏ．３０２７００６１） ［作者简介］ 任桂杰（ １９６９－ ） ， 女， 讲师， 主要从事分子病毒学的研究。 ［通讯作者］ 王志玉， Ｔｅｌ： ０５３１－８８３８０４１８．
８６６
山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版）
ＤＮＡ， 酶切或双酶切反应初步鉴别突变株。然后送 公司测序， 进一步确定突变株。
［５］ Ｆｒｅｉｔａｓ Ａ， Ｆｉｏｒｅ ＬＡ， Ｇｒｏｎｉｃｈ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ｖｉｄｅｏ－ＥＥＧ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ
ｅｐｉｌｅｐｓｙ［Ｊ］． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ （Ｒｉｏ Ｊ） ， ２００３， ７９： ２５９． ［６］ Ｐａｏｌｉｃｃｈｉ ＪＭ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎｏｎｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ
３讨论
４３ 卷 ９ 期
图 １ 重组 ＰＣＲ 定点突变示意图
１．２．２ 随机突变方法［２］ 在预突变区域的两端按 常规方法设计引物， 为克隆方便也可在引物中加 入限制酶切位点。每 １００ μｌ 反应体系中， 分别加 入 １０ μｌ １０×致 突 变 ＰＣＲ 缓 冲 液 ， １０ μｌ １０×ｄＮＴＰ 混合物， 各种引物 ３０ ｐｍｏｌ 及 ＤＮＡ 模板 ２０ ｐｍｏｌ， 加入适量水使总体积为 ８８ μｌ， 混匀。加入 １０ μｌ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２， 混合均匀， 确证无沉淀产生后加 ５Ｕ 天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶， 使终体积为 １００ μｌ。混匀， 上层可覆盖矿物油或 ｗａｘ ｂｅａｄ。ＰＣＲ 循环 ３０ 次， 循环条件为： ９４ ℃ １ ｍｉｎ， ４５ ℃ １ ｍｉｎ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ。 不要进行热启动， 循环结束后也不要延长延伸时 间。氯仿／异戊醇（ ２４：１， Ｖ／Ｖ） 抽提后进行乙醇沉淀 以纯化 ＰＣＲ 产物。取少量纯化产物做琼脂糖凝胶 电泳分析， 证实获得满意量的全长 ＰＣＲ 产物。为 了比较全长 ＤＮＡ 的产量， 可将致突变 ＰＣＲ 和标 准 ＰＣＲ 同时进行， 然后电泳鉴定。将 ＰＣＲ 产物克 隆到适当载体后， 建立突变体库。从突变体库中筛 选出所需的突变体送公司测序， 确定突变体。
ＰＣＲ 扩增反应之前， 需用两种限制性内切酶 在质粒待扩增区域的两侧， 分别将模板质粒线性 化， 进行两次 ＰＣＲ 并引入突变。一般利用原始质 粒上单一酶切位点， 这样在插入物上任何位点进 行 突 变 时 ， 都 可 以 用 这 两 种 线 性 模 板 。超 螺 旋 的 ＤＮＡ 分 子 也 可 作 为 ＰＣＲ 的 模 板 ， 但 ＰＣＲ 产 物 必 需 经 过 纯 化 使 其 与 质 粒 模 板 分 开 （超 螺 旋 质 粒 转 化 效 率 非 常 高 ） 。由 于 超 螺 旋 模 板 的 ＰＣＲ 产 物 量 低 ， 因 此，超 螺 旋 质 粒 作 ＰＣＲ 模 板 时 要 进 行 多 次 的扩增循环。 ３．２ 随机突变 如果突变在长 ＤＮＡ 片段及在完 整基因中进行， 则更倾向于采用在整个序列中进 行散在的随机突变， 每一分子出现一个或数个突 变。由于天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶不具备 ３＇ →５＇ 外切 酶活性， 在链延伸过程中不可避免地存在一定的 核苷酸错误掺入， 所以可在 ＰＣＲ 中通过 ＤＮＡ 聚
第 ４３ 卷第 ９ 期 ２００５ 年 ９ 月
山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ ＨＥＡＬＴＨ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）
文章编号： １６７１－ ７５５４（２００５）０９－ ０８６５－ ０３
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．９ Ｓｅｐｔ．２００５
ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
２结果
对副粘病毒融合蛋白进行的突变研究表明， 定 点 突 变 的 成 功 率 为 １００％； 随 机 突 变 （ ５００ 核 苷 酸 长度的靶 ＤＮＡ） 产生的突变群体中约 ４％为野生 型、１２％为含有 １ 个错误的突变体、２０％为 ２ 个错 误的突 变 体 、２２％为 ３ 个 错 误 的 突 变 体 、１８％为 ４ 个错误的突变体、１２％为 ５ 个错误的突变体、１２％ 为 ６ 个或更多错误的突变体。
ＰＣＲ 缓冲液混合， 否则会导致沉淀产生， 妨碍 ＰＣＲ 反应） 。 １．１．３ 定点突变引物 ①两对引物 （ 共 ４ 个） ， 每 对引物分别用于各自 ＰＣＲ 反应。每一引物约含有 ２４ 个与另一对引物中相应引物互补的核苷酸；② 测序引物， 在突变部位或插入部位的两侧， 用于分 析生成的构建体。所有引物均由上海生物工程有 限公司合成。 １．２ 方法 １．２．１ 定点突变方法［２］ 重组 ＰＣＲ 进行定点突变 的过程见图 １。引物由带数字的箭头表示。突出部 分代表错配碱基及 ＰＣＲ 产物中产生的突变。引物 １ 和引物 ３ 互补， 引物 ２ 和引物 ４ 互补。两种单一 限制性内切酶位点用于使质粒线性化。如要进行 另外的单一特异位点的突变， 只需合成新的引物 １ 和引物 ３， 可用同一种经酶切割的模板。５０ μｌ ＰＣＲ 反应体系中含 ２ ｎｇ 线性化的质粒 ＤＮＡ， 每种 引物 ２５ ｐｍｏｌ， 各种 ｄＮＴＰ ２００ μｍｏｌ／Ｌ， Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合酶 １．２５ Ｕ， １×ＰＣＲ 缓冲液， 在 反 应 体 系 表 面 加 ３０ μｌ 矿物油。ＰＣＲ 反应参数： 起始变性温度 ９４ ℃ １ ｍｉｎ， 循环条件（ 每 ｋｂ 长度的 ＰＣＲ 产物） 为 ９４ ℃ ３０ ｓ， ５０ ℃ ３０ ｓ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ， 进行 １４～２０ 次循环。 循环结束后延伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎ。用琼脂糖凝胶电泳 检 查 ＰＣＲ 产 物 。 从 两 个 ＰＣＲ 反 应 管 中 各 取 出 ３ μｌ ＰＣＲ 反应产物， 混匀后用 ＣａＣｌ２ 转化法转化至 感受态大肠杆菌中。涂平板后， 从转化的细菌菌落 中随机挑选若干， 接种于含氨苄青霉素的 ２×ＹＴ 培养基中， ３７ ℃震荡培养， 进一步扩增。提取质粒
ＰＣＲ 的模板， 连续反复地进行随机诱变， 使每一次 获得的小突变累积而发生重要的有益突变。
［参考文献］
任桂杰， 等 ． ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
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合酶进行不正确拷贝时随机引入突变。通过调整 核苷酸、酶及镁离子的用量， 获得无序列倾向性的 突变体库。
随机突变 ＰＣＲ 应使用 ｃＤＮ源自 或仅含有目的序 列的双链 ＤＮＡ 片段作模板， 一般不用质粒 ＤＮＡ， 也不用基因组 ＤＮＡ。随机突变 ＰＣＲ 方 法 对 模 板 ＤＮＡ 的长度限制在约 １０００ 核苷酸。对于较长靶 ＤＮＡ 的突变， 可将其分为若干片段分别进行。
［３］ 颜子颖， 王海林， 译． 金冬雁， 校． 精编分子生物学实验 指南［Ｍ］． 北京： 科学出版社， １９９８． ２５２－２５３． ［收稿日期 ２００４－１２－０６］
（编辑：孙玉芝）
（上接第 ８６２ 页）
［２］ 肖 波 ， 王 晓 云 ， 叶 晖 ， 等 ． 电 视 录 像 脑 电 图 在 癫 痫 及 其 他 发 作 性 疾 病 中 的 诊 断 价 值 探 讨 ［Ｊ］． 中 华 神 经 科 杂 志 ， ２００２， ３５： ３４５．
任桂杰 １， ２ ， 王志玉 １
（ 山东大学 １．公共卫生学院病毒学研究室； ２．医学院生化与分子生物学研究所，山东 济南 ２５００１２）
［关键词］ 聚合酶链反应；定点突变；随机突变 ［中图分类号］ Ｑ７５４ ［文献标识码］ Ｂ
蛋白质的结构与其功能之间的关系是蛋白质 组学研究的重点内容之一。体外突变技术是研究 这种复杂关系的有力工具， 也是实验室中改造／优 化基因常用的手段［１］。定点突变技术可对某个已知 基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入； 随 机突变则可在特定编码序列的多个位点上产生随 机的突变体。我们现介绍两种在实验中总结出来 的用 ＰＣＲ 方法对克隆化 ＤＮＡ 进行定点突变和随 机突变的技术。
３．１ 定 点 突 变 体 外 定 点 突 变 技 术 是 一 种 功 能 强大的方法， 可用于对蛋白质功能的研究， 确定酶 的活性位点， 以及在药物筛选中设计新的蛋白等。 ＰＣＲ 介导产生定点突变体的设计与传统的定点突 变方法不同， 它无需单链 ＤＮＡ 中间物， 回避了使 用 Ｍ１３ 系 列 噬 菌 体 载 体 及 其 他 辅 助 病 毒 制 备 单 链 ＤＮＡ 的过程［３］， 从而缩短了实验所需要的时间。
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 克隆载体、目的基因和菌株 载体为 ｐＢ－ ＳＫ＋质粒 ＤＮＡ。基因克隆的重组质粒由美国麻省大 学 Ｉｏｒｉｏ 博士惠赠。新城疫病毒融合蛋白基因被插 入 ＸｈｏⅠ切点（ ６６８） ； 副流感病毒融合蛋白基因被 插入 ＢａｍＨⅠ切点（ ７１９） 。大肠杆菌 ＴＧ１ 由本室保 存。 １．１．２ 试 剂 Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ ５ Ｕ／μｌ， ＴａＫａＲａ ＤＲＲ０１ＡＭ） ； 常规 １０×Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶缓 冲 液 ； ｄＮＴＰ 混 合 物 ； 天 然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ Ｆｅｒ－ ｍｅｎｔａｓ 公司， ＃ＥＰ０２８１） 或 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶； 自配１０×致突变 ＰＣＲ 缓冲液： ７０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５ ℃）， ０．１％（ｗ／ｖ）明胶。１０×ｄＮＴＰ 混合物： ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＧＴＰ， ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＡＴＰ， １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＣＴＰ 和 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＴＴＰ。５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２ （ 事 先 不 要 与 １０×致 突 变
［３］ 王 纪 文 ， 李 保 敏 ， 孙 若 鹏 ， 等． 儿 童 癫 痫 视 频 脑 电 图 监 测 及 诊 断 价 值 探 讨 ［Ｊ］． 中 国 实 用 儿 科 杂 志 ， ２００３， １８： ２２１．
［４］ 张文渊． 有关睡眠分期以及便携式、动态和视频脑 电 图等问题［Ｊ］．临床神经电生理学杂志， ２００１， １０： １８７．
［１］ 黄 培 堂 ， 王 嘉 玺 ， 朱 厚 础 ， 等 译 ． 分 子 克 隆 实 验 指 南 ［Ｍ］ ． 北京： 科学出版社， ２００３． １ ０８０－１ ０８７．
［２］ 黄 培 堂 ， 俞 炜 源 ， 陈 添 弥 ， 等 译 ． ＰＣＲ 技 术 实 验 指 南 ［Ｍ］． 北京： 科学出版社， １９９８． ４１６－４２５．
已 有 研 究 证 明［２］， 含 有 短 同 源 末 端 的 ＤＮＡ 片 段可以在 Ｅ．ｃｏｌｉ 胞内进行分子间重组， 即 ＰＣＲ 产 生的同源末端可通过体内重组使 ＤＮＡ 连在一起， 形成环状重组体。如果环状重组体分子含有复制 序列和选择标记， 那么这种重组体则更易于筛选。
点突变引物通常为 ２５～３５ 个核苷酸， 突变的 位置一般放在引物的中间。无突变的引物一般长 度为 ２０～３０ 个核苷酸。两种 ＰＣＲ 引物的末端最好 有 ２４ 个左右的同源核苷酸。突变体的设计最好是 消除或产生一个限制酶识别位点， 以便有效地筛 选出突变产物。此种定点突变方法构建的目的产 物特异性高， 但转化率低， 平均每纳克 ＤＮＡ 只产 生 １０ 个带突变的克隆。因此需用高度感受态的大 肠 杆 菌 （ 转 化 效 率 ＞１ ×１０９ 转 化 子 ／μｇ 单 体 ｐＵＣ１９） 。如果没有高度感受态的大肠杆菌， 那么 转化后 ３７ ℃复苏 １ ｈ， 可将全部样品涂在平板上， 可以提高筛选的效率， 节省实验时间。
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（ Ｎｏ．３０２７００６１） ［作者简介］ 任桂杰（ １９６９－ ） ， 女， 讲师， 主要从事分子病毒学的研究。 ［通讯作者］ 王志玉， Ｔｅｌ： ０５３１－８８３８０４１８．
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山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版）
ＤＮＡ， 酶切或双酶切反应初步鉴别突变株。然后送 公司测序， 进一步确定突变株。
［５］ Ｆｒｅｉｔａｓ Ａ， Ｆｉｏｒｅ ＬＡ， Ｇｒｏｎｉｃｈ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ｖｉｄｅｏ－ＥＥＧ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ
ｅｐｉｌｅｐｓｙ［Ｊ］． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ （Ｒｉｏ Ｊ） ， ２００３， ７９： ２５９． ［６］ Ｐａｏｌｉｃｃｈｉ ＪＭ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎｏｎｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ
３讨论
４３ 卷 ９ 期
图 １ 重组 ＰＣＲ 定点突变示意图
１．２．２ 随机突变方法［２］ 在预突变区域的两端按 常规方法设计引物， 为克隆方便也可在引物中加 入限制酶切位点。每 １００ μｌ 反应体系中， 分别加 入 １０ μｌ １０×致 突 变 ＰＣＲ 缓 冲 液 ， １０ μｌ １０×ｄＮＴＰ 混合物， 各种引物 ３０ ｐｍｏｌ 及 ＤＮＡ 模板 ２０ ｐｍｏｌ， 加入适量水使总体积为 ８８ μｌ， 混匀。加入 １０ μｌ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２， 混合均匀， 确证无沉淀产生后加 ５Ｕ 天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶， 使终体积为 １００ μｌ。混匀， 上层可覆盖矿物油或 ｗａｘ ｂｅａｄ。ＰＣＲ 循环 ３０ 次， 循环条件为： ９４ ℃ １ ｍｉｎ， ４５ ℃ １ ｍｉｎ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ。 不要进行热启动， 循环结束后也不要延长延伸时 间。氯仿／异戊醇（ ２４：１， Ｖ／Ｖ） 抽提后进行乙醇沉淀 以纯化 ＰＣＲ 产物。取少量纯化产物做琼脂糖凝胶 电泳分析， 证实获得满意量的全长 ＰＣＲ 产物。为 了比较全长 ＤＮＡ 的产量， 可将致突变 ＰＣＲ 和标 准 ＰＣＲ 同时进行， 然后电泳鉴定。将 ＰＣＲ 产物克 隆到适当载体后， 建立突变体库。从突变体库中筛 选出所需的突变体送公司测序， 确定突变体。
ＰＣＲ 扩增反应之前， 需用两种限制性内切酶 在质粒待扩增区域的两侧， 分别将模板质粒线性 化， 进行两次 ＰＣＲ 并引入突变。一般利用原始质 粒上单一酶切位点， 这样在插入物上任何位点进 行 突 变 时 ， 都 可 以 用 这 两 种 线 性 模 板 。超 螺 旋 的 ＤＮＡ 分 子 也 可 作 为 ＰＣＲ 的 模 板 ， 但 ＰＣＲ 产 物 必 需 经 过 纯 化 使 其 与 质 粒 模 板 分 开 （超 螺 旋 质 粒 转 化 效 率 非 常 高 ） 。由 于 超 螺 旋 模 板 的 ＰＣＲ 产 物 量 低 ， 因 此，超 螺 旋 质 粒 作 ＰＣＲ 模 板 时 要 进 行 多 次 的扩增循环。 ３．２ 随机突变 如果突变在长 ＤＮＡ 片段及在完 整基因中进行， 则更倾向于采用在整个序列中进 行散在的随机突变， 每一分子出现一个或数个突 变。由于天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶不具备 ３＇ →５＇ 外切 酶活性， 在链延伸过程中不可避免地存在一定的 核苷酸错误掺入， 所以可在 ＰＣＲ 中通过 ＤＮＡ 聚
第 ４３ 卷第 ９ 期 ２００５ 年 ９ 月
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文章编号： １６７１－ ７５５４（２００５）０９－ ０８６５－ ０３
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ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
２结果
对副粘病毒融合蛋白进行的突变研究表明， 定 点 突 变 的 成 功 率 为 １００％； 随 机 突 变 （ ５００ 核 苷 酸 长度的靶 ＤＮＡ） 产生的突变群体中约 ４％为野生 型、１２％为含有 １ 个错误的突变体、２０％为 ２ 个错 误的突 变 体 、２２％为 ３ 个 错 误 的 突 变 体 、１８％为 ４ 个错误的突变体、１２％为 ５ 个错误的突变体、１２％ 为 ６ 个或更多错误的突变体。
ＰＣＲ 缓冲液混合， 否则会导致沉淀产生， 妨碍 ＰＣＲ 反应） 。 １．１．３ 定点突变引物 ①两对引物 （ 共 ４ 个） ， 每 对引物分别用于各自 ＰＣＲ 反应。每一引物约含有 ２４ 个与另一对引物中相应引物互补的核苷酸；② 测序引物， 在突变部位或插入部位的两侧， 用于分 析生成的构建体。所有引物均由上海生物工程有 限公司合成。 １．２ 方法 １．２．１ 定点突变方法［２］ 重组 ＰＣＲ 进行定点突变 的过程见图 １。引物由带数字的箭头表示。突出部 分代表错配碱基及 ＰＣＲ 产物中产生的突变。引物 １ 和引物 ３ 互补， 引物 ２ 和引物 ４ 互补。两种单一 限制性内切酶位点用于使质粒线性化。如要进行 另外的单一特异位点的突变， 只需合成新的引物 １ 和引物 ３， 可用同一种经酶切割的模板。５０ μｌ ＰＣＲ 反应体系中含 ２ ｎｇ 线性化的质粒 ＤＮＡ， 每种 引物 ２５ ｐｍｏｌ， 各种 ｄＮＴＰ ２００ μｍｏｌ／Ｌ， Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合酶 １．２５ Ｕ， １×ＰＣＲ 缓冲液， 在 反 应 体 系 表 面 加 ３０ μｌ 矿物油。ＰＣＲ 反应参数： 起始变性温度 ９４ ℃ １ ｍｉｎ， 循环条件（ 每 ｋｂ 长度的 ＰＣＲ 产物） 为 ９４ ℃ ３０ ｓ， ５０ ℃ ３０ ｓ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ， 进行 １４～２０ 次循环。 循环结束后延伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎ。用琼脂糖凝胶电泳 检 查 ＰＣＲ 产 物 。 从 两 个 ＰＣＲ 反 应 管 中 各 取 出 ３ μｌ ＰＣＲ 反应产物， 混匀后用 ＣａＣｌ２ 转化法转化至 感受态大肠杆菌中。涂平板后， 从转化的细菌菌落 中随机挑选若干， 接种于含氨苄青霉素的 ２×ＹＴ 培养基中， ３７ ℃震荡培养， 进一步扩增。提取质粒