第八章 酶的定向进化
- 格式：ppt
- 大小：6.71 MB
- 文档页数：77
下载文档原格式
合集下载
第八章定向进化
第八章 酶的定向进化
• • 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用
第一节 定向进化简介
• • • • 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶
一．理论来源
• 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生 物进化过程
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
• 酶分子改造,基于序列的合理化设计， sequential rational design
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化，非合理设计 irrational design
酶分子的合理设计： 酶分子的合理设计： • 利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方 法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 的分子特征、空间结构、结构和功能之间 的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非合理设计： 酶分子的非合理设计： • 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机 突变，基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
• functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
酶分子存在进化潜力的原因
1.天然酶在生物体内存在的环境和酶实际应 用的环境的不同。如非水相作为筛选压力。 2.生命体内的单个酶的进化受到整体调节， 进化机会有限。 3. 非生物体内所涉及的酶或蛋白质的性质， 如蛋白类药物改造消除其副作用。
三．定向进化的选择策略
定向进化=随机突变 正向重组 选择（或筛选） 定向进化 随机突变+正向重组 选择（或筛选） 随机突变 正向重组+选择 – 关键：突变和筛选 – 突变，采用回交法消除不利突变和中性突变 – 筛选，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质有 关。 例：蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X 光片消化分析，44000个突变株筛选
• • 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用
第一节 定向进化简介
• • • • 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶
一．理论来源
• 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生 物进化过程
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
• 酶分子改造,基于序列的合理化设计， sequential rational design
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化，非合理设计 irrational design
酶分子的合理设计： 酶分子的合理设计： • 利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方 法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 的分子特征、空间结构、结构和功能之间 的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非合理设计： 酶分子的非合理设计： • 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机 突变，基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
• functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
酶分子存在进化潜力的原因
1.天然酶在生物体内存在的环境和酶实际应 用的环境的不同。如非水相作为筛选压力。 2.生命体内的单个酶的进化受到整体调节， 进化机会有限。 3. 非生物体内所涉及的酶或蛋白质的性质， 如蛋白类药物改造消除其副作用。
三．定向进化的选择策略
定向进化=随机突变 正向重组 选择（或筛选） 定向进化 随机突变+正向重组 选择（或筛选） 随机突变 正向重组+选择 – 关键：突变和筛选 – 突变，采用回交法消除不利突变和中性突变 – 筛选，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质有 关。 例：蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X 光片消化分析，44000个突变株筛选
2011酶工程 第八章 酶的定向进化
普通筛选方式
常见的96孔板高通量筛选技术
1 平板筛选技术
1）根据细胞生长情况筛选突变基因 热 抗生素 pH 高渗透压 低温 有毒物及抑制剂
OD-Monitor OD值测定传感器
2） 依据颜色变化筛选
颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝 基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的 黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色 底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没 有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一 个有色化合物。
Stemmer W P C. , Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 10747- 10751
二 酶稳定性-耐有机溶剂
2001年，Song 和Rhee利用随机突变和重组的方法筛选得到 三株磷脂酶A1 突变体,可以在有机溶剂存在的条件下有效的 发挥作用, 其稳定性和活性都得到较大的提高。 Song J K, Rhee J S. Biochim Biophys Acta , 2001 , (1547) : 370～ 378. Arnold 等用定向进化方法提高P450 BM3对有机溶剂ＤＭＳ Ｏ耐受力提高了６倍，对ＴＨＦ的耐受力提高了１０倍。
基因型
表达型
融合蛋白
PIII
Lead
Hv
Link
Lv
E
PIII
4 酵母细胞表面展示技术
S. cerevisiae 易培养、安全、适用范围广
适用于真核生物蛋白库的构建，有较高的库容量
（ 105 -106 )
展示可溶性蛋白（104 -105 protein copies/cell），
第八章酶分子的定向进化概要
张今等为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题 以天冬氨酸为模型通过控制DNA合成的碱基底物 种类和浓度比例实现碱基对的错配，向目的基因 引入突变同时限制突变减少筛选突变体的工作量， 探索了一种称为酶法体外随机、定向改造酶分子 的途径。
9
三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
3
三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
21
七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
9
三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
3
三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
21
七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
第八章 酶定向进化
其基本操作过程如下 : 靶基因经随机突 变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用 DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加 引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些 片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至 获得全长基因; 再加入基因的两端引物进 行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。
2.1交错延伸重组(Stagger extension process)
图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图 谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频 率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可 达500-700个； 质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用 pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中， 凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就 是都含有pUC19的。
它是由两个相互独立的关键技术组成. 一个是随机基因文 库的构建, 另一个是特定酶( 特别是增加催化活性、增强 选择性或稳定性) 的筛选策略。
第二节 定向进化的方法
一、酶基因的随机突变
1.易错PCR技术 (Error prone PCR)
易错PCR 是指从酶的单一基因出发，通过 改变PCR 的反应条件 , 使碱基在一定程度上 随机错配而引入多点突变, 构建 行全面的筛选。为此要求构建 可能完变基库容量。
所有的质粒载体都有三个 共同的特征：一个复制子、一 个选择性标志和一个克隆位点。 复制子是含有DNA复制起始 位点的一段DNA（ori），也包 括表达由质粒编码的复制必需 的RNA和蛋白质的基因。 选择性标志对于质粒在细 胞内持续存在时必不可少的。 克隆位点是限制性内切酶 切割位点，外源性DNA可由此插 入质粒内，而且并不影响质粒 的复制能力，或为宿主提供选 择性表型。
酶工程 第八章 酶的定向进化 (1)
7
酶的定向进化
• 基于序列的理性设计：分子修饰
利用已知酶分子的空间结构、结构和功能之间关系， 以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造； • 利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基 因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因， 并定向筛选出所需突变酶；
• 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ • 提高Mg2+浓度
15
1、易错PCR
• 优点：操作简便，随机突变的定向进化
• 难点：要控制好突变率
16
1、易错PCR
连续易错PCR： 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。
8
酶的定向进化
酶定向进化的概念： 模拟自然进化（随机突变和自然选择） 的过程，在体外进行酶基因的人工随机突 变，并在人工控制条件的特殊环境下进行 定向选择，得到具有优良催化特性的酶的 突变体。所得到的酶称为进化酶。
9
酶的定向进化
• 主要过程： 1、随机
DNA 改组 (DNA shuffling)
交错延伸PCR 随机引物体外重组 基因家族重排
12
PCR
13
1、易错PCR
• Taq酶不具有3’5’ 方向的 外切酶活性，有一定的错配 几率（5×10-5） • 易错PCR：提高PCR过程 的错配几率
14
1、易错PCR
方法：
• 改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降 至5％-10％），同时加入dITP来代替被减少的 dNTP；
• 基因重组（of chapter 8
8.1进化的应用
34
酶工程5 第八章_酶定向进化
1992年Gram H．等用噬菌体呈现技术体外筛选抗体时，用易错PCR 向抗体的重链可变区和轻链可变区引入突变。
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
2/169
第一节 酶定向进化介绍
3/169
获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
4/169
22/169
定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
23/169
2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
2/169
第一节 酶定向进化介绍
3/169
获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
4/169
22/169
定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
23/169
2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
酶的定向进化
交错延伸
StEP法重组发生在单一试管中, 不需分离亲 本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换 模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化 过程〔28〕. 该法简便且有效, 为酶的体外 定向进化提供了又一强有力的工具.
酶法体外随机-定位诱变
为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰
岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶
体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site-
directed mutagenesis)〔29～32〕. 该方法的内涵与酶的
体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点,
以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变
注：易错 PCR突变率需仔细调控，不能高低，靶基因取代碱基1.5~5个，经常一次突变很难获 得满意的结果。将一次易错 PCR获得的小突变累计产生重要的有益突变。
Chen等人〔5，6〕用此策略使在非水相（二甲基甲 酰铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的 活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的 DMF中, 催化效率kcat/Km分别是野生酶的256和131 倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定 向进化〔2〕, 产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高 3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍. 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、 耗时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）. 此 外, 使用该方法易出现同型碱基转换.
于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了
第八章酶的定向进化
➢ 缺点：正突变基因少，需多次PCR。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物 来源的天然酶提高270倍，比段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化 ➢ 噬菌粒载体
➢ 转导
2、突变基因的筛选 （1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
定向进化的特点 ➢ 适应面广； ➢ 目的性强； ➢ 效果显著。
定向进化的原理 ➢ 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化 酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 ➢ 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 ➢ 定向进化=随机突变+定向选择。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术突变频率高，进化速度快。 ➢段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起 突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变 体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
改变四种底物浓度比等。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 1、突变基因的构建 适用：较小基因的定向进化。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。
酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起
结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物 来源的天然酶提高270倍，比段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化 ➢ 噬菌粒载体
➢ 转导
2、突变基因的筛选 （1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
定向进化的特点 ➢ 适应面广； ➢ 目的性强； ➢ 效果显著。
定向进化的原理 ➢ 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化 酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 ➢ 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 ➢ 定向进化=随机突变+定向选择。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术突变频率高，进化速度快。 ➢段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起 突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变 体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
改变四种底物浓度比等。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 1、突变基因的构建 适用：较小基因的定向进化。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。
酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起
酶定向进化
基因家族重排技术改组效果
第三节 酶突变基因的定向选择
• 在人工控制条件的特殊环境下，按照人们
所设定的进化方向对突变基因进行选择，
以获得具有优良催化特性的酶的突变体的
过程
反复进行 基因 随机突变 构建基因 定向筛选 正突变基因一、 突变或包装成重组λ 噬菌体的技术过程。 反复进行 随机突变
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
微量滴定板
比色法
微孔板分光光度计
荧光检测
荧光检测器
3.噬菌体表面展示法
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而 表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面 的生物技术。
用固相化抗原 经“亲和结合 一洗脱一扩增” 数个循环直接、 方便、简捷、 高效地筛选出 表达特异性好、 和力强的抗体 噬菌体库。
2.载体的特点
具有自主复制起点 两种以上易于检测的选择性标记 多种限制性内切核酸酶的单一位点
2. 基因重组
• 在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载 体DNA连接在一起形成重组DNA的技术过程。
• 1）黏性末端连接 • 2）平头末端连接 • 组DNA转入受体细胞或包 装成有感染活性的重组噬将带有外源基因的重组质粒 DNA印染受体细胞的技术过程。）
P212
• 将各种不同的突变基因与载体重组，再转入适宜
突变基因
含突变基因的细胞或 重组λ噬菌体基因正突 变基因基因重组
筛选
载体的选择 含有正突变基因的重完整性（二）构建基因的主要过程• 1. 载体的选择
质粒载体
噬菌体DNA载体 黏粒载体 噬菌粒载体
2、高通量筛选方法
酶定向进化
• 细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化
的过程，以各种细胞为进化对象，通过人工随机
突变，改良细胞的各种特征，主要包括微生物细
胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞
的定向进化等。
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定
向进化的过程。通过从细胞内提取或者通
过PCR等方法获得目标分子的基因，在体
• 概念断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突 变的技术过程。
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
酶切
突变本过程
基因家族若干同源基因 酶切 DNA随机片断 无 酶切
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步 • 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而DNA重 排技术则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上 的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。
三、基因家族重排技术
• 概念：又称为基因家族改组技术，是从基 因家族的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割成随机片断，经过不加引物的多次 PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排 布而引起基因突变的技术过程。
基因家族：是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两 个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们结构相似、功能相关、进化 上同源。
•
特点
• 基因突变发生在单一分子内，为无性进化。
• 操作简便、随机突变丰用于较小基因
的定向进化。
• 因此要控制好突变率，一般一个目的基因错配碱基数目应 控制在2~5个
的过程，以各种细胞为进化对象，通过人工随机
突变，改良细胞的各种特征，主要包括微生物细
胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞
的定向进化等。
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定
向进化的过程。通过从细胞内提取或者通
过PCR等方法获得目标分子的基因，在体
• 概念断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突 变的技术过程。
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
酶切
突变本过程
基因家族若干同源基因 酶切 DNA随机片断 无 酶切
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步 • 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而DNA重 排技术则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上 的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。
三、基因家族重排技术
• 概念：又称为基因家族改组技术，是从基 因家族的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割成随机片断，经过不加引物的多次 PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排 布而引起基因突变的技术过程。
基因家族：是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两 个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们结构相似、功能相关、进化 上同源。
•
特点
• 基因突变发生在单一分子内，为无性进化。
• 操作简便、随机突变丰用于较小基因
的定向进化。
• 因此要控制好突变率，一般一个目的基因错配碱基数目应 控制在2~5个
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
定向进化与自然进化的异同 点
定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸 和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：
•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；
•进化方向不同： 适应突变的积累；
•进化速度不同： 非常漫长
•
只需几年、甚至几天； 超越生物学意义的要
定向进化的应用
目标酶
卡那霉素核苷基 转移酶 枯草杆菌蛋白酶
所需功能
热稳定性 作用于有机溶 剂 作用于新底物 有机溶剂中的 底物特异性和 活性
方法
定位诱变+选择 易错PCR+选择
结果
在60-50℃酶半衰期 增加200倍 在60％二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170 倍 对cefotaxime的抗性 增加32000倍 活力增加60-150倍
• 优点：简便，随机的定向进化
DNA 重组技术(DNA Shuffling)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
• DNA改组具有以下有用的特征： • ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的 有利突变； • ②重组可伴随点突变同时发生； • ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。 • 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率 会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突 变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变 会被有害突变的负背景所掩盖。
生物多样性：整个生态系统中的生物
什么是定向进化技术
• 概念提出： • 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出 酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶 的改造或构建新的非天然酶。
• 酶分子改造：
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化
• 模拟自然进化的过程，进行人工随机突变， 并在特定的环境条件下进行选择，使进化 朝着人们所需方向发展的技术过程。
交换催化反应的专一性
• 来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物p-硝 基-苯基-2-甲基葵酸盐的S构型的选择性2%。 • 经过4轮易错PCR突变和筛选后，它对底物 的S型的选择性达到81%
Fig. 1. Publication rate of the ‘directed evolution’ articles in biomedical literature between 1995 and 2004. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which contain the key words ‘directed evolution’ in their titles.
丝 状 噬 菌 体 的 生 活 周 期
噬菌体显示筛选模式
噬菌体显示的几种类型
M13噬菌体pIII和pVIII的显示
酵母双杂交展示
• 典型的真核生物转录因子（如GAL4）含有两个不同结构域: DNA结 合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcriptionactivating domain)。 • 前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节 的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。 • 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而 且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
• 对酶分子的研究可以分为认识和改造两个 方面，前者是利用各种生物化学，晶体学 光谱学等方法对天然酶或其突变进行研究， 获得酶分子特征，空间结构和功能之间的 关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造，成为酶分 子的合理设计。如化学修饰，定点突变等。
澄清一个事实：定向进化不是定点突变 • 定向进化：突变 筛选
• 将对卡那霉素有抗性的卡那霉素核苷酸转 移酶基因转化进大肠杆菌，获得基因的突 变库 • 将突变库转入可以在高温下生长的耐热菌， 即嗜热脂肪芽孢杆菌中
• 通过在高温下进行筛选获得了一个在63℃ 下稳定的突变酶(Asp80Try)和一个在70℃ 稳定的突变酶(Asp80Try，Thr130Lys)
2.基本原理
提高底物的专一性
• Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于 癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍 • Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱 苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功
对映体选择性的定向进化
• S型选择性的转氨酶转化ß-丁酮，仅有65% 的手性专一性。 • 通过10 000个随机突变的菌株的筛选，获 得10个手性专一性在80%-94%之间的酶
3. 定向进化的基本过程
• 随机突变• 构建突变基因 • 定向筛选3.1 随机突变
• 易错PCR技术
• DNA 重排技术(DNA Shuffling) • 基因家族重排技术
易错PCR技术
降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ 提高Mg2+浓度
• DNA shuffling技术的改进
• 交错延伸技术 • 随机引物体外重组技术
交错延伸技术
在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一 步, 缩短其反应时间，从而只能合成出 非常短的新生链，经变性的新生链再作 为引物与体系内同时存在的不同模板退 火而继续延伸。此过程反复进行，直到 产生完整的基因长度。
——诺贝尔奖获得者
M. Eigen
内容简介
• 酶定向进化简介：基本原理、研究历史 • 定向进化的策略：、现状和未来
1.研究历史
• 第一次在分子水平上定向改造单一分子的是 Sol Spiegelman 在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q 进行的一个实验，当时他的目的是为了证明达尔 文的自然选择也可以发生在非细胞体。此实验并 没有实际的应用价值 • 1981年，B.G.Hall等报道了他们定向改变大 肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性， 开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。 • 1986年R。Hageman等进行了开发有效提高 常温生物中酶分子热稳定性的实验。
• 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋 白的相互作用。 • 主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNAactivating domain的载体。
4. 酶定向进化的应用
• • • • • 提高酶催化效率 改变底物特异性 改善酶的稳定性 获取具有新功能的酶 提高药用蛋白和疫苗的活性
• 利用基因工程原理在实验室中模拟生物进 化过程
– 化学进化 – 生物进化
• 生物的自然进化
进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
进化结果：
基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因(同源基因，或同工酶) 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（木糖——木酮糖）
代谢产物的多样性因的任何一种可能 的突变信息 • 完整性：尽可能完整反映基因的结构和功 能信息，以便筛选得到具完整功能的进化 酶
• 表达载体： • λ噬菌体载体系统：最早使用。适合大片段的克隆； 转染率高，可达106以上；质量控制较好；适合长 期保存。 • 质粒载体系统：体外操作简便，段再群体扩增时易丢 失；转化效率较低；不能长期保存。
最适生长温度提高了！
诱发突变的 因素
细菌
50 C培养
0
最适生长温度为 37 C
0
突变体库
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
– 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解 酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的 进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基 因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并 定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
• 组装
3.2 突变库的筛选
• 1.定向选择环境条件的设定
• 逐步改变调整所设定的环境条件
• 2.高通量筛选
• • • • • 平板筛选 荧光筛选 噬菌体表面展示 酵母表面展示 核糖体展示
平板筛选
依据重组细胞的表型，包括细胞生长状态、颜色变 化情况、透明圈情况等进行筛选。
使抗生素失效的酶类(如头孢菌素酶，b -乳糖酶） 提高耐热性 易于观察的菌落表型（如菌落颜色等） 营养缺陷型的辅助筛选
第八章 酶的定向进化
• 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转 化，已广泛应用于各个领域：医药方面、 食品工业方面、轻工、化工方面、能源开 发方面、环境保护方面等等
• 天然酶的局限：
• 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶 学研究和工业化应用的要求 • 而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低 • 还缺乏有商业价值的催化功能，尤其是对一些非 天然底物具有惰性 • 在非水环境下的低活力 • 对辅酶的依赖等
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
• 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
现代生物工程的要求
能具备长期稳定性和活性
能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的 合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物 或药物的原材料
•如何利用相对简单的方法以达 到对天然酶的改造或构建新的 非天然酶就显得非常有研究意 义和应用前景