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微生物发酵实验指导生命科学学院2014年8月目录：第一部分碱性磷酸酶工程菌株的筛选及发酵条件优化实验一工程菌株的初筛实验二工程菌株的复筛实验三碱性磷酸酶活力的测定实验四生产菌株发酵条件的优化第二部分生物反应器的使用实验五发酵罐的构造实验六发酵罐参数的设置及控制实验七发酵罐的操作方法第三部分机械搅拌发酵罐发酵生产碱性磷酸酶实验八种子的制备实验九发酵罐培养实验十菌株生长曲线的绘制实验十一发酵过程中还原糖的测定注意事项：本实验内容涉及到分析化学、有机化学、生物化学、微生物学、发酵工艺学及化学过程等学科的基本实验操作，对学生综合实验能力要求较高。
学生在上课之前，应对相应内容进行复习。
本实验上课期间，希望同学们注意以下几点要求。
1．实验时，每个授课班级学生将分为4个小组。
各小组设组长一名，负责协调工作及实验工作分工。
在充分征求组员意见的基础上，分工一旦确定，组员必须服从工作安排，自觉、认真完成自己应负责工作。
2．该实验属开放性实验，所有实验内容必须由学生自己完成。
在同一时间内，每个小组内将进行不同的实验内容。
学生必须对实验内容非常熟悉，思路清晰，才能尽量减少失误。
因此学生要对实验内容进行预习。
3．本实验学生分组实验，学生要团结友爱，既要合理分工，也要互相合作，保证实验顺利完成。
每个小组实验数据共享，但数据处理过程不共享，否则将影响最后成绩。
4．实验需要使用仪器较多，共用小型仪器放于固定位置，不得随意搬动。
5．实验中要随时保持实验室及实验台面的清洁，以免发酵过程中污染。
6．实验过程中，蒸馏水用量较大，各组要轮流负责打水。
7．使用仪器必须按照教师指导进行，以免发生危险。
第一部分碱性磷酸酶工程菌株的筛选及发酵条件优化实验一工程菌株的初筛一、实验目的了解生产菌种筛选过程中初筛的意义。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种底物专一性较低的磷酸单脂酶，在酶联免疫测定、非同位素探针、生物传感器、标记和测序方面有着重要的用途。
菌种筛选一般分初筛和复筛，前者以量为主，后者以质为主。
初筛可在培养皿或摇瓶中进行，优点是快速、直观、简便、工作量小，但测试条件与工业发酵时有很大差别，因此结果不一定可靠。
本实验将采用微孔板法对碱性磷酸酶工程菌株进行初筛。
三、实验材料1．菌株（1）阴性对照菌株：不含表达载体的E.coli BL21（教师提供）。
（2）阳性对照菌株：表达碱性磷酸酶的工程菌株（教师提供）。
（3）待测菌株：基因工程大实验构建获得的阳性工程菌株（学生自备）。
2．培养基（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂18g，水1000ml，pH 7.0。
121℃灭菌20min。
3．溶液（1）0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠0.64g，碳酸氢钠3.4g，4-氨基安替比林0.15g，100ml蒸馏水定容。
（2）0.02mol/L磷酸苯二钠溶液：称取二水磷酸苯二钠0.51g，用80ml沸水溶解，冷却后定容至100ml，并加入0.5ml氯仿。
置4℃冰箱保存。
（3）铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾0.25g，硼酸1.7g，各溶于40ml水中，将两种溶液混合后定容至100ml。
置4℃冰箱保存。
以上试剂置冰箱保存一般不超过一周，每次都尽量现配现用。
4．器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，天平，电炉；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，微孔板，试管。
四、实验方法1．培养基制备：配制LB固体培养基200ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。
2．灭菌：将配制好的LB固体培养基121℃灭菌20min。
将培养皿、牙签用报纸包好，121℃灭菌20min。
3．倒平板：将灭过菌融化的LB固体培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，每皿约20ml。
冷却凝固待用。
4．菌株活化：取保藏菌种划线接种于固体培养基平板，37℃培养24~48h。
5．初筛：将0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.0）50μL点样于微孔板中（对照孔加量为55μL），用灭菌牙签取阴性对照菌株、阳性对照菌株及待测菌株等量菌苔与缓冲液充分混匀，于37℃水浴5min。
再加入己预热的0.02mol/L磷酸苯二钠溶液50μL，37℃反应15min。
加入铁氰化钾溶液150μL，显色并终止反应。
重复二次（板）。
以红色深浅初筛磷酸酶产生菌。
6. 保存菌种：将初筛后表达活性较高的3株菌株划线转接至LB固体培养基平板上，37℃培养24～48h，待菌苔长好后，Parafilm膜封口，4℃保存。
实验二工程菌株的复筛一、实验目的1．学习发酵菌种的复筛方法。
2．2．从已分离到的微生物中找出具有工业应用前景的菌株。
二、实验原理复筛是对生产性能作较精确的定量测定工作。
复筛时应尽可能模拟工业生产条件，一般通过摇瓶培养对培养液进行精确的定量分析测定，所得的数据比较有说服力，但工作量较大。
为了尽可能使复筛条件与大生产相近，复筛培养基中应加入一些生产性原料。
三、实验材料1．菌株：实验一初筛得到的性能优良的碱性磷酸酶工程菌株。
2．培养基：复筛培养基（LB液体培养基）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000ml，pH 7.0。
121℃灭菌20min。
3．器材高压灭菌锅，超净工作台，天平，电炉；烧杯，量筒，三角瓶，移液管。
四、实验方法1．培养基制备：配制复筛培养基300ml，分装于250ml三角瓶中，每瓶30ml，共9瓶，6层纱布封口，灭菌。
2．摇瓶培养：挑取1环菌苔（或1个单菌落），转接于复筛培养基中（每株菌接3瓶），37℃，150r/min摇床培养24h。
3．菌株生产性能的测定：取下摇瓶，参照实验三方法对碱性磷酸酶活力进行测定，每瓶测三次，取平均值。
实验三碱性磷酸酶活力的测定一、实验目的1．掌握对硝基苯磷酸二钠法测定碱性磷酸酶活力的基本原理和方法2．从初筛所获得的菌株中筛选出碱性磷酸酶活力高的菌株二、实验原理碱性磷酸酶在碱性的环境下可以将对硝基苯磷酸二钠水解为游离磷酸及对硝基苯酚。
对硝基苯酚在强碱性条件下呈亮黄色，在405nm处有强烈的吸收峰。
因此可以根据405nm处的吸光值来计算产物对硝基苯酚的生成量，进而计算出碱性磷酸酶的活性。
三、实验材料1．粗酶液：实验二的摇瓶发酵液离心破壁后的上清液作为粗酶液。
2．试剂（1）对硝基苯磷酸二钠溶液（NPP）：p-NPP 5mmol/L，Tris-HCl（pH10.0）100mmol/L，MgCl2 1mmol/L。
（2）0.25mol/L NaOH溶液：称取10g NaOH溶于水，定容至1000ml。
121℃灭20min。
室温保存。
（3）磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g，加水充分搅拌溶解，滴加盐酸调节pH至7.4，加水定容至1000ml。
121℃灭20min。
室温保存。
（4）碱性磷酸酶标准溶液：取碱性磷酸酶标准品1μL，加入99μL PBS缓冲液。
3．器材：分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表；试管，移液管，烧杯，离心管。
四、实验方法1. 粗酶液的制备取实验二所得发酵液5ml离心（4℃，5000r/min，10min），弃上清；细胞沉淀加入500μL PBS缓冲液洗涤一次，离心（4℃，5000r/min，10min），弃上清；再加入500μL PBS缓冲液制备成细胞悬液；冰水浴超声波粉碎细胞（处理3s，间隔3s，共处理15min）；离心（4℃，5000r/min，10min），收集上清液即为粗酶液，备用。
2. 碱性磷酸酶活力测定按下列程序操作：试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）↓↓加NPP溶液1.00ml 加NPP溶液1.00ml↓37±0.2℃，5min ↓37±0.2℃，5min加酶标准溶液100μL（摇匀）加粗酶液100μL（摇匀）↓37±0.2℃，5min ↓37±0.2℃，5min加NaOH溶液150μL（摇匀）加NaOH溶液150μL（摇匀）↓↓测定A405 测定A4053. 碱性磷酸酶活力的计算酶活力单位的定义：在37℃下，每分钟水解对硝基苯磷酸二钠产生1μg对硝基苯酚所需的酶量定义为一个活力单位（U）。
式中：X—样品的酶活力，U/ml A405待测—待测样品平行试验的平均吸光度A405标准—标准品酶液的吸光度五、注意事项1. 温度与酶的反应速度密切相关。
温度相差1℃，就可使结果产生明显偏差。
此外反应时间5min也应精确控制至秒。
2. 酶液应该根据情况进行适当稀释。
3. 酶的稀释倍数对酶活力也有一定影响。
一般将稀释度控制在酶反应后的A405为0.2～0.8，吸光度过高或过低都可能带来测定上的误差。
实验四生产菌株发酵条件的优化一、实验目的1．了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出筛选菌株的最佳发酵条件。
2．掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。
二、实验原理发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响，其中培养基pH、培养温度和通气状况是三类最主要的发酵条件。
培养基pH一般指灭菌前的pH，可以酸碱溶液调节控制，因发酵过程中pH会不断改变，所以最好用缓冲溶液来调节；通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量，封口纱布的厚度也会影响氧气的传递，一般以6～8层为好。
发酵培养基是指大生产时所用的培养基，一般碳源含量较高。
若产物含氮量高，还应增加培养基中氮源比例。
但必须注意培养基的渗透压，如果渗透压过高，会反过来抑制微生物的生长，可考虑以流加的方法逐步加入碳氮源。
工业发酵培养基与菌种筛选时所用培养基不同，以经济节约为主，一般选用廉价的农副产品为原料。
由于天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，因此发酵前必须进行培养基的优化试验。
本实验将对菌株的培养基配方进行优化。
三、实验用品1．菌种实验二筛选得到的碱性磷酸酶生产菌。
2．初始培养基：葡萄糖6g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 3g，Na2HPO4 0.05g，水1000ml。
pH7.0。
121℃灭20min。
3．器材摇床，高压灭菌锅；三角瓶，烧杯，移液管，试管。
四、实验方法1．培养基制备：分别在初始培养基中添加0.8%（W/V）的黄豆粉、玉米粉、可溶性淀粉和酵母膏作为主要氮源，配制发酵培养基，分装于250ml三角瓶，每瓶30ml，6层纱布封口，灭菌。
取13ml蒸馏水加入50ml三角瓶中，灭菌。
2．接种：挑取斜面菌苔13环接入13ml无菌水中，摇匀后用无菌移液管吸取1ml菌悬液，接到每一瓶培养基中。
37℃，150r/min摇床培养24h左右。
3．结果测定：参照实验三方法测定菌株在各培养基中培养后产生的碱性磷酸酶活力。
