【CN110373388A】一种用于类器官培养的培养基及类器官培养方法【专利】

专利名称：一种用于培育转基因植物的培养基专利类型：发明专利
发明人：漆小泉,赵素珍
申请号：CN201210078381.6
申请日：20120322
公开号：CN103320377A
公开日：
20130925
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种用于培育转基因植物的培养基。

本发明提供的培养基组由愈伤诱导培养基、继代培养基、共培养培养基、筛选培养基和再生培养基组成；本发明的实验证明，本发明提供的转化体系及转化方法，平均每100个二穗短柄草幼胚就能产生约103个阳性转化苗，阳性苗转化率达到103.4％，远远高于传统的和谷类模式植物水稻。

水稻阳性苗的最高转化率为47.6％(植物学通报，2008年，25(3)，322-331)。

短柄草高效的农杆菌转化体系为温带和谷类植物基因功能研究提供了重要的技术手段。

申请人：中国科学院植物研究所
地址：100093 北京市海淀区香山南辛村20号中国科学院植物研究所发育中心
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：关畅
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类器官培养用细胞培养基培养方法及类器官细胞培养是一种通过体外培养细胞来研究细胞生长、分化和功能的方法。

细胞培养基是细胞培养的重要组成部分，可以提供细胞所需的营养物质和环境条件，以促进细胞的生长和增殖。

类器官培养是将特定类型的细胞在培养基中进行培养，以模拟真实的器官环境，从而形成类似于原始器官的组织结构和功能。

常用的细胞培养基包括基本培养基和特定培养基。

基本培养基包含基本的营养物质，如糖、氨基酸、维生素和无机盐等，以提供细胞的生长和代谢所需的能量和物质。

特定培养基根据细胞类型的不同而有所不同，可以通过添加特定的生物因子如生长因子、激素、抗生素等来促进细胞的增殖和分化。

培养细胞的方法可以分为悬浮培养和附着培养两种。

悬浮培养是将细胞以悬浮状态培养在液体培养基中，常用于细胞的大量培养和蛋白质的生产。

附着培养是将细胞固定在培养基的底部，需要使用培养皿或培养瓶等具有附着面的容器，常用于细胞的扩增和形成组织结构。

类器官是通过培养特定类型的细胞或多种类型的细胞，使其形成类似于真实器官的组织结构和功能的模型。

类器官培养可以通过选择合适的细胞类型和培养条件来实现。

以下是几种常见的类器官培养：1.血管系统类器官：血管系统类器官是通过培养内皮细胞和平滑肌细胞来模拟血管组织。

这种类器官可以用于研究血管生成和血管功能，以及药物的药理活性。

2.肝脏类器官：肝脏类器官是通过培养肝脏细胞来模拟肝脏组织。

这种类器官可以用于研究肝脏的功能、毒性和药物代谢。

3.心脏类器官：心脏类器官是通过培养心肌细胞来模拟心脏组织。

这种类器官可以用于研究心脏的收缩功能、心电活动和心脏病的机制。

4.肺类器官：肺类器官是通过培养肺细胞和支气管上皮细胞来模拟肺组织。

这种类器官可以用于研究呼吸功能、气道炎症和肺部疾病的机制。

5.肾脏类器官：肾脏类器官是通过培养肾小管上皮细胞来模拟肾脏组织。

这种类器官可以用于研究尿液形成、体液平衡和肾脏疾病的机制。

类器官培养不仅可以用于基础研究，还可以用于药物筛选和毒性评估等应用。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811638443.8(22)申请日 2018.12.29(71)申请人 创芯国际生物科技(广州)有限公司地址 510000 广东省广州市黄埔区瑞发路1号自编(1)栋四层016房(72)发明人 郑鸿平　黄敏　(74)专利代理机构 深圳市兴科达知识产权代理有限公司 44260代理人 许尤庆(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种肾脏组织类器官3D培养的培养基及类器官培养方法(57)摘要本发明公开了一种3D培养肾脏组织类器官的培养基及类器官培养方法，本发明的培养基针对于肾脏组织来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照一定的比例进行调和，经过调和的培养基中细胞因子，信号通路调控因子含量适宜，肾脏细胞及肾癌细胞能够有效的在3D环境中形成类器官。

权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 109609441 A 2019.04.12C N 109609441A1.一种3D培养肾脏组织类器官的培养基，其特征在于，上述培养基包括以下成份：B27、N -acetylcysteine、EGF、Noggin、R -spondin 1、A83-01、FGF10、Nicotinamide、Y -27632、Prostaglandin E2和SB202190。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，肾脏组织为肾脏正常组织或肾脏癌组织。

3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，肾脏组织选自人或小鼠的肾脏组织。

4.如权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于，培养基各成分的含量如下：B27，40-60X稀释；N -acetylcysteine，1-5mM；EGF，1-100ng/ml；Noggin，50-200ng/ml；R -spondin 1，200-1000ng/ml或体积分数为10-50％的条件培养基；A83-01，200-1000nM；FGF10，5-50ng/ml；Nicotinamide，1-20mM；Y -27632，1-20μM；Prostaglandin E2，0.1-2μM；SB202190，1-20μM。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811316386.1(22)申请日 2018.11.07(71)申请人 复旦大学地址 200433 上海市杨浦区邯郸路220号(72)发明人 林鑫华　赵冰　王鑫　(74)专利代理机构 上海正旦专利代理有限公司31200代理人 张磊(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途(57)摘要本发明公开了一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途，所述培养基包含基础培养基和小分子的组合，所维持的小分子的组合为CBF。

其中C为CHIR -99021,B为Blebbistatin，C 为Forskolin。

本发明在基础培养基中添加小分子CHIR，Blebbistatin，Forskolin，从而取代添加生长因子，在体外能够长期培养肝脏胆管的类器官，并可进一步诱导分化形成肝实质细胞。

本方法有利于肝脏类器官在体外的大量扩增，并为肝脏相关疾病的研究及治疗提供基础。

权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 109517783 A 2019.03.26C N 109517783A1.一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，其特征在于：包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N -乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、CHIR -99021、blebbistatin和forskolin，其中：所述CHIR -99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM。

2.根据权利要求1所述的全小分子培养基，其特征在于：所述全小分子培养基还包括SUN11602、FH1和A83-01。

3.根据权利要求1所述的全小分子培养基，其特征在于：所述基础培养基为Advanced DMEM/F12，所述血清替代物为N2或B27中一种或两种，所述双抗为青霉素或链霉素中任一种或两种，所述谷氨酸盐/酯的浓度为2m M ，所述N -乙酰半胱氨酸的浓度为1m M ，所述Nicotinamide的浓度为10mM。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010892337.3(22)申请日 2020.08.31(71)申请人 深圳市犀锐生物科技有限公司地址 518000 广东省深圳市盐田区海山街道田东社区深盐路2028号大百汇生命健康产业园1栋三单元704(72)发明人 魏文博　王丽　陈宗正　张筱晴　蓝晓瑞　(74)专利代理机构 苏州市方略专利代理事务所(普通合伙) 32267代理人 石磊(51)Int.Cl.C12M 3/00(2006.01)C12M 1/00(2006.01)(54)发明名称一种类器官培养芯片及其使用方法(57)摘要本发明属于类器官芯片领域，具体公开了一种类器官培养芯片及其使用方法，所述芯片包括薄片结构（100）、微孔（101）、微孔开口（1011）、微孔底面（1012）、微孔侧壁（1013）、围栏结构（102）；本芯片可以放置在常用的细胞培养皿和孔板内，细胞接种到芯片后，在重力和倾斜的侧壁产生的机械力的共同作用下，使细胞聚集在微孔的底部，并自发形成三维细胞球，所形成的细胞球可以进一步培养形成所需的类器官组织。

权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 111909846 A 2020.11.10C N 111909846A1.一种类器官培养芯片，其特征在于，所述芯片包括薄片结构（100）、微孔（101）、微孔开口（1011）、微孔底面（1012）、微孔侧壁（1013）、围栏结构（102）；所述微孔（101）成阵列式的排布于所述薄片结构（100）上，所述微孔（101）的顶部为微孔开口（1011），所述微孔（101）的底部为所述微孔底面（1012），所述微孔（101）的侧方为所述微孔侧壁（1013）；所述薄片结构（100）的上表面的周边设有围栏结构（102），所述围栏结构（102）高出所述薄片结构（100）的表面；所述微孔开口（1011）与所述薄片结构（100）的表面平齐，所述微孔底面（1012）伸入所述所述薄片结构（100）内部，低于所述薄片结构（100）的表面；所述微孔开口（1011）的形状与所述微孔底面（1012）的形状相同，所述微孔开口（1011）的尺寸大于所述微孔底面（1012）的尺寸；所述微孔（101）至少含有两个倾斜的微孔侧壁（1013）。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010348114.0(22)申请日 2020.04.28(71)申请人 江苏信安佳医疗科技有限公司地址 210009 江苏省南京市鼓楼区高云岭39号(72)发明人 罗国安　王义明　范雪梅　罗喆明　(74)专利代理机构 北京同辉知识产权代理事务所(普通合伙) 11357代理人 刘洪勋(51)Int.Cl.C12N 5/09(2010.01)(54)发明名称一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法(57)摘要本发明公开了一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法。

所述培养基含有以下成分：Advanced DMEM/F12、FBS、双抗、N -2、Noggin、B -27、EGF、FGF -10、Y -27632、A83-01、S B 202190、R -S p o nd i n 、N -乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、Wnt3A、HGF和Primocin TM 。

培养方法是将分离获取原代肿瘤细胞加入上述专用培养基重悬，计数后接种至超低吸附U型孔板中，离心培养，至形成类器官。

本发明培养基及培养方法可实现肝癌原代细胞的体外增殖，可快速构建肝肿瘤无支架类器官，并能保持肝肿瘤类器官的长期稳定生长。

采用本发明技术形成的肿瘤类器官保留了患者肿瘤组织的异质性，适用于体外肝癌化疗药物的药敏检测及肿瘤发生、发展相关研究。

权利要求书1页 说明书6页 附图5页CN 111411084 A 2020.07.14C N 111411084A1.一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基，其特征在于，由血清替代物N2和B27、Noggin、双抗、表皮生长因子、成纤维生长因子、选择性ROCK1抑制剂、ALK5抑制剂、p38 MAPK 抑制剂、N -乙酰半胱氨酸、R -Spondin蛋白、烟酰胺、Wnt3A细胞因子、肝细胞生长因子、Primocin TM 、胎牛血清和基础培养基Advanced DMEM/F12组成。

专利名称：一种乳腺癌无支架类器官专用培养基及培养方法专利类型：发明专利
发明人：罗国安,王义明,范雪梅,罗喆明
申请号：CN202010441931.0
申请日：20200522
公开号：CN111575237A
公开日：
20200825
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种乳腺癌无支架肿瘤类器官培养基及培养方法，包括
N‑2，B27，Noggin，青霉素/链霉素双抗，EGF，FGF10，Y‑27632，A83‑01，SB202190，N‑乙酰半胱氨酸，R‑Spondin，烟酰胺，Wnt3A，KGF，庆大霉素，Heregulin，胎牛血清和
DMEM‑F/12。

该培养基及培养方法可以帮助建立一种无需支架材料、且能高度保持肿瘤特异性的乳腺癌肿瘤类器官，实现大小可控，球形规则，且成功率高、时间短、药敏结果特异性高。

本发明培养基及培养方法可为乳腺肿瘤的发生、发展、体外药敏筛选及耐药机制研究提供理想模型。

申请人：江苏信安佳医疗科技有限公司
地址：210009 江苏省南京市鼓楼区高云岭39号
国籍：CN
代理机构：北京同辉知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：刘洪勋
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911344271.8(22)申请日 2019.12.24(71)申请人 江苏信安佳医疗科技有限公司地址 210009 江苏省南京市鼓楼区高云岭39号(72)发明人 罗国安　马立东　王乙同　王义明　(74)专利代理机构 北京同辉知识产权代理事务所(普通合伙) 11357代理人 刘洪勋(51)Int.Cl.C12N 5/09(2010.01)(54)发明名称一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基(57)摘要本发明公开了一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基，由基础培养基、表皮生长因子10-25ng/mL、成纤维生长因子10-25ng/mL、细胞生长因子0.5-2ng/mL、胰岛素生长因子1-3ng/mL、丙酮酸钠1mmol/L、谷氨酰胺2mmol/L、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL和体积分数为10％的血清组成；所述培养基针对肝癌组织来源细胞的培养生长特点，该培养基组分简单合理，营养丰富，配方价格适中；所述培养基培养的肝癌类器官细胞球能有效的长期稳定生长，细胞球紧密聚集，表面光滑圆润，边界清晰，无崩解现象，并且细胞活性，特异性功能及代谢功能均能显著提升。

权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 110878286 A 2020.03.13C N 110878286A1.一种用于肝癌类器官细胞球培养的培养基，其特征在于，由基础培养基、表皮生长因子、成纤维生长因子、细胞生长因子、胰岛素生长因子、丙酮酸钠、谷氨酰胺、青霉素、链霉素和血清组成。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，各组成成分的含量为：表皮生长因子10-25ng/mL，成纤维生长因子10-25ng/mL，细胞生长因子0.5-2ng/mL，胰岛素生长因子1-3ng/mL，丙酮酸钠1mmol/L，谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL和体积分数为10％的血清。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710512944.0(22)申请日 2017.06.28(71)申请人 中国科学院生物物理研究所地址 100101 北京市朝阳区大屯路15号(72)发明人 王晓群　吴倩　李睿　孙乐　方艾　(74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任公司 11021代理人 穆彬(51)Int.Cl.C12N 5/0793(2010.01)(54)发明名称一种类脑器官器的制备方法和应用(57)摘要本发明涉及一种类脑器官器的制备方法和应用，具体是提供干细胞在体外分化发育形成三维结构且具有血管结构的类皮层组织结构(cortical organoid )的方法和培养条件。

而且随着持续的培养还能够建立具有神经元功能和成熟神经环路连接的3D体系，使其更加接近于大脑皮层从胚胎期神经发生到出生后突触发育和功能建立的发育过程。

用此培养系统培养的产品可以应用于疾病研究和药物筛选等。

权利要求书1页 说明书8页 附图6页CN 109136185 A 2019.01.04C N 109136185A1.一组诱导干细胞向具有血管结构的类脑组织分化的培养基，所述培养基包括以下各项：1)DMEM/F12/KSR(血清替代物)培养基：其是在DMEM/F12基础培养基中添加血清替代物KSR，IWR1，LDN和/或SB431542。

2)神经诱导培养基：其是在DMEM/F12基础培养基中添加N2添加剂和/或B27添加剂。

3)神经分化培养基：其是在neurobasal和DMEM/F12基础培养基中添加N2添加剂和/或B27添加剂。

2.权利要求1所述的培养基，其中所述DMEM/F12/KSR培养基还含有glutamax，非必须氨基酸和/或β巯基乙醇。

3.权利要求1所述的培养基，其中所述神经诱导培养基还含有glutamax，非必须氨基酸，β巯基乙醇，FGF2。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111590436.7(22)申请日 2021.12.23(71)申请人 北京基石生命科技有限公司地址 100195 北京市海淀区杏石口路65号益园文化创意产业基地C区11号楼西段2层(72)发明人 张函槊　刘勇　(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人 张立娜(51)Int.Cl.C12N 5/09(2010.01)B01J 13/00(2006.01)(54)发明名称一种培养肿瘤类器官的方法(57)摘要本发明公开了一种培养肿瘤类器官的方法。

本发明提供了一种用于培养肿瘤类器官的水凝胶是以离体的绵羊血浆或其他哺乳动物血浆或人血浆为基质，添加促凝剂和蛋白交联剂后形成的。

本发明水凝胶具有成本低、制备简便、结构疏松、强度适中、透水性好、短时间可完全凝胶化、细胞生物相容性好、既适用于上皮组织来源也适用于间叶组织来源恶性肿瘤类器官培养的优点。

权利要求书2页 说明书7页 附图4页CN 114317439 A 2022.04.12C N 114317439A1.一种用于培养肿瘤类器官的水凝胶，是以离体的绵羊血浆或其他哺乳动物血浆或人血浆为基质，添加促凝剂和蛋白交联剂后形成的。

2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于：所述促凝剂为含钙离子的无机盐或/和有机盐中的任一种或多种；进一步地，所述促凝剂选自如下任一种或多种：氯化钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙；更进一步地，所述促凝剂为氯化钙。

3.根据权利要求1或2所述的水凝胶，其特征在于：所述蛋白交联剂选自如下任一种或多种：戊二醛、1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双琥珀酰亚胺酒石酸酯、m‑马来酰亚胺基苯甲酰‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺3‑(2‑吡啶基二硫基)‑丙酸酯；进一步地，所述蛋白交联剂为戊二醛。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110951313.5(22)申请日 2021.08.18(71)申请人 川北医学院地址 637000 四川省南充市顺庆区涪江路234号(72)发明人 胥正敏　周春阳　温虎玲　何冠军　王玉泉　陈健　赵永生　雍玺　尤俊　卞娇娇　黄蓉　夏天琴　郭文　林鑫静　(74)专利代理机构 北京研展知识产权代理有限公司 16009代理人 高歌(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种甲状腺类器官培养基、甲状腺类器官培养及传代方法(57)摘要本发明公开了一种甲状腺类器官培养基、甲状腺类器官培养及传代方法，甲状腺类器官培养基包括Advanced DMEM/F12培养基和如下组分：B ‑27、N ‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R ‑spondin1重组蛋白、头蛋白、Wnt ‑3a、表皮细胞生长因子、A83‑01、促甲状腺激素、氢化可的松、胰岛素、成纤维细胞生长因子‑10以及Y27632。

本发明甲状腺类器官培养基创新地添加了促甲状腺激素、氢化可的松和胰岛素，通过添加促甲状腺激素能够显著促进甲状腺类器官形成，通过添加氢化可的松能够有效促进细胞增殖生长效应,能提高克隆形成率，通过添加胰岛素能够维持细胞干性，提高传代效率，本发明的甲状腺类器官培养基能够很好地进行甲状腺类器官培养。

权利要求书2页 说明书8页 附图5页CN 114317399 A 2022.04.12C N 114317399A1.一种甲状腺类器官培养基，其特征在于，包括Advanced DMEM/F12培养基和如下组分：B‑27、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R‑spondin1重组蛋白、头蛋白、Wnt‑3a、表皮细胞生长因子、A83‑01、促甲状腺激素、氢化可的松、胰岛素、成纤维细胞生长因子‑10以及Y27632。

专利名称：一种培养基及其应用、培养方法专利类型：发明专利
发明人：陈海佳,王一飞,葛啸虎,万桦
申请号：CN201510719086.8
申请日：20151028
公开号：CN105154402A
公开日：
20151216
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基及其应用、培养方法。

该培养基包括转铁蛋白、重组人胰岛素、孕酮、胎牛血清、干细胞生长因子、维生素C、白介素2、白介素4、硫酸锌和DMEM/F12培养基。

本发明培养基在培养CD19-CAR-T细胞时，能够提高细胞的增殖倍数，延长细胞培养天数，并能够保持表达CD19CAR等表面标志物。

申请人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
地址：510000 广东省广州市国际生物岛螺旋四路一号生产区第五层502单元
国籍：CN
代理机构：北京集佳知识产权代理有限公司
代理人：赵青朵
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011264732.3(22)申请日 2020.11.13(71)申请人 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院中山大学肿瘤研究所）地址 510000 广东省广州市东风东路651号(72)发明人 牟永告　蒋小兵　段昊　胡婉明　崔润　(74)专利代理机构 广州容大知识产权代理事务所(普通合伙) 44326代理人 刘新年(51)Int.Cl.C12N 5/09(2010.01)(54)发明名称一种垂体腺瘤类器官培养基及其应用(57)摘要本发明提供一种垂体腺瘤类器官培养基及其应用，该培养基包括基础培养基和特异性添加因子；所述基础培养基为NPMM培养基，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：FBS ，5‑15v％；氢化可的松，1‑10ug/ml；FGF，10‑50ng/ml；FGF8，100‑300ng/ml；EGF，5‑20ng/ml；HGF，10‑50ng/ml；GlutaMAX，0.5‑2X；Y27632，5‑20uM；BMP ‑4，5‑20nM；SAG:1‑5uM；SHH：200‑250ug/ml；Wnt5A：100‑300ng/ml；B27 supplement，0.2‑5X；重组人CNTF，1‑5ng/ml。

采用本发明的培养基培养垂体腺瘤类器官，所获得的垂体腺瘤类器官结构形态清晰完整、并且稳定可靠，因此可以作为有效的人源垂体腺瘤模型。

权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 112501119 A 2021.03.16C N 112501119A1.一种垂体腺瘤类器官培养基，其特征在于：包括基础培养基和特异性添加因子；所述基础培养基为NPMM培养基，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：FBS，5‑15v％；氢化可的松，1‑10ug/ml；FGF，10‑50ng/ml；FGF8，100‑300ng/ml；EGF，5‑20ng/ml；HGF，10‑50ng/ml；GlutaMAX，0.5‑2X；Y27632，5‑20uM；BMP ‑4，5‑20nM；SAG:1‑5uM；SHH：200‑250ug/ml；Wnt5A：100‑300ng/ml；B27 supplement，0.2‑5X；重组人CNTF，1‑5ng/ml。