微生物限度检查解读

• ②阴性菌对照组：
检查大肠、大肠菌群、沙门----金葡为阴性 检查绿脓、金葡、梭菌----大肠为阴性
进行阴性试验时，取供试液及阴性对照 菌，然后按控制菌检查的方法进行试验， 例如，验证控制菌大肠菌的检查方法时， 应取供试液及金葡菌，按大肠菌检查方 法进行增菌检查，应不得检出金葡菌。 本阴性菌对照组试验的目的是为了验证 大肠菌检查方法的专属性
3.1.2平皿法菌数报告规则
• （2）当比值≤2时，与2000年版相同， 以两级均数报告 • 当比值>2时，规则与2000年版不同， 如比值为2~5时，说明两级之间存在 较大差别，应以低稀释级的菌落数乘 以稀释倍数的值报告菌数 • 增加了比值大于5，或出现高稀释级菌 数大于或等于低稀释级，应查明原因。 如试液有较强的抑菌作用，就不能象 上述一样忽略，必须调整方法
• (3)按药典要求进行验证，主 要实验操作 • (4)验证数据、结果，列表表 示 • (5)得出结论
• 总而言之，无菌检查、微生物限度检 查，目的是检查药品中是否污染了微 生物，污染的程度怎样？为了要能准 确地检测其结果，必须排除实验环境、 实验仪器设备、实验用试药材料、实 验操作以及药品本身等等，对所污染 微生物的生存、生长，产生任何不良 影响的因素。上面所涉及的内容，就 是为了达到这个目的
3.2薄膜过滤法
(为2005年版药典新增内容) 3.2.1操作： • 1）取相当于供试品1g（ml）的供试液 [如取供试品1g（ml）或1：10供试液 10 ml或1：100供试液100 ml]，加至 适量稀释剂 ，混匀，过滤 • 2）冲洗方法、冲洗液、冲洗量（应验 证） • 3）每种培养基至少制备一张膜
培养基约15~20ml 每稀释级每种培养基至少制备2个 平皿 培养和计数栏增加对同级的两个平 板，当菌落数大于等于15个时，则 两个平板的菌落数不能相差1倍或1 倍以上
3.1.1平皿法两版药典比较
（续）
2000年版药 典
（5）培养基的 适用范围，规 定比较乱，表 达不清，不易 理解
2005年版药典
3.2薄膜过滤法(续)
• 3.2.2阴性对照试验: 等同于“空白试验”，即不 加供试品，按同法操作所得 结果，每种培养基均需做。
3.2薄膜过滤法(续)
• 3.2.3培养和计数: 与平皿法相同。但每张滤膜上菌数应 不得过100个，如果超过100个，也 就是每1g（ml）供试品含菌量较多， 可取适宜稀释级供试品1ml检查，例 如，1：10取10ml检查，菌落150个 （150个/g），则改用1：10取1ml检 查，菌落为15个（150个/g）
营养琼脂培养基用于进行细 菌计数；玫瑰红琼脂培养基 用于进行霉菌及酵母菌计数； 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培 养基用于进行酵母菌计数, 或用于特殊品种（含蜂蜜、 王浆的液体制剂）进行酵母 菌计数
3.1.2平皿法菌数报告规则
• 2000年版药典存在许多不足， 2005年版作了较大改动
– 1) 规定取两位有效数字报告。在计 数及中间计算过程中可多保留一位。 – 2) 2005年版中： – （1）与2000版相同
4. 控制菌检查(续)
• 2) 增加大肠菌群检查。 • 3) 沙门、金葡、绿脓也和大肠菌一 样作了调整，大同小异。沙门菌规 定取供试品1 0 g（ml），另加阳性 对照10 g（ml）。 • 4) 增加了梭菌检查（无论试管或平 皿都要注意厌氧条件培养）。
5. 微生物限度标准
• （略）
• 主要变化是由按剂型控 制改为按给药途径控制。
3.2薄膜过滤法(续)
• 3.2.4菌数报告规则: • 1) 报告每1g（ml）供试品菌落数； • 2) 若膜上无菌落生长时，如果（每张 膜过滤1g(ml)供试品或1：10×10ml供 试液，如每张膜过滤1：10×10ml供 试液，则报告<10个，依此类推，为<1 乘以稀释倍数
4. 控制菌检查
• 1) 大肠菌基本相同，主要修改是：当 MUG和靛基质两项中有一项为阳性时， 大肠菌的进一步确认通过大肠菌菌落 形态特征比较进行鉴别排除，增加大 肠菌形态特征，对进一步确认做什么 生化试验不作硬性规定（是否妥？）， 所以原有的生化试验结果判断删除了。
6. 方法验证(续)
• ④ 稀释剂对照组：以相应稀释液替代 供试品，按③试验组同法测定 • 计算稀释剂对照组的回收率：
稀释剂对照组（加入试验菌的测定值） 菌液组（加入试验次独立 的平行试验，即分别平行取来自 同一批样品的三份供试品，平行 操作，作三次验证测定。每次验 证试验的试验组和稀释对照组回 收率必须两项同时≥70%，所被验 证的检查法成立，否则 ……
3. 细菌、霉菌、酵母菌计数（续）
• 3.2薄膜过滤法(为2005年版药典 新增内容)
– – – – 3.2.1操作 3.2.2阴性对照试验 3.2.3培养和计数 3.2.4菌数报告规则
3.1.1平皿法两版药典比较
2000年版药典
（1）连续3个稀释 级
2005年版药典
连续2~3个稀释级
（2）培养基约15ml （3）每稀释级应作 2~3个平皿 （4）无
谢谢大家
6.2控制菌的验证
根据各品种项下微生物限度 检查标准中规定检查的控制菌， 进行相应的验证；根据检查的 控制菌选择对应的验证菌，大 肠菌群选大肠埃希菌。 • 试验分二组
• ①试验组（操作略）：规定量 一般为1：10供试液10ml（相 当于1g或1ml供试品），沙门菌 除外。取供试液、试验菌加入 增菌培养基中。按拟定方法检 查。
• ③试验组（操作略）：取已知含菌数的 供试液（试验可能用的最低稀释级供试 液1ml）和一定量的试验菌，进行测定。 测得试验组的总菌量，测定两份（两个 平皿），求平均值 • 计算试验组的回收率：
试验组-供试品对照组（加入试验菌的测定值） 菌液组（加入试验菌的已知值）
6. 方法验证(续)
（应≥70%）
供试液制备以加至一定体积 表示
供试液分三类七种，但分类 更合理，函盖面更全
增加了新的制备方法，对培 养基稀释作了进一步详细规 定
3. 细菌、霉菌、酵母菌计数
• 3.1平皿法： – 3.1.1平皿法两版药典比较 – 3.1.2平皿法菌数报告规则 – 3.1.3平皿法其他内容，如阴性对 照试验等等与2000年版相同
•
二、具体内容
• 1. 检验量： 指明了检验量是一次试验所用的量； 对贵重药、微量包装药可酌减，但 不规定3g或5g；因沙门菌检查的报 告单位为10g或10ml，所以检验量应 另增10g或10ml（不含阳性对照用 量）。
2. 供试液制备（与2000年版药典相比的不同点）
2000年版药典 （1）使用0.9%无 菌NaCl溶液 （2）供试液制备 以加一定体积表示 （3）供试液分三 类六种 （4）制备方法有 限 2005年版药典 使用pH7.0无菌NaCl-蛋白胨 缓冲液
7.总结
• 作为研发者，需要做的工作是：
– – – (1)．建立方法； (2)．验证方法； (3)．制订质量标准
•
作为检验者，应该做的工作是：
--按制订的方法（质量标准）检验
10号资料（质量标准研究资料）
(1)实验仪器、试药（包括培养基、 稀释液、冲洗液、菌液……，包括 培养基的相关试验） (2)根据什么原因、理由、依据 拟定的方法
(续)
3.1.2平皿法菌数报告规则
(续)
（3）与2000年版相同 （4）与2000年版相同
3.1.2平皿法菌数报告规则
(续) 3) 还删除了2000年版中不合理 的3条;把培养基稀释列为具抑 菌活性供试品在任何情况下通 用的方法，不仅仅局限于某种 情况,而且方法也进行了合理 的调整，取样改为2ml，每1 ml所注平皿多个(不定)
6. 方法验证
• 6.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证： • 1) 菌液制备（略） • 2) 验证方法：主要分四组，测得四组数据。 • ①供试品对照组：按拟定的菌落计数方法，准 确测定规定量(与试验组的相同)的供试液中的 菌落数，得供试品的已知含菌数----相当于已 知供试品的含量。 • ②菌液组：测定所加的试验菌的菌数----相当 于精密称定对照品，得对照品的已知加入量。
微生物限度检查解读
蔡美明 2005.11
一、前言
• • • • 1. 规定了微生物限度检查的定义及检查内容。 2. 实验的环境设施及操作的无菌要求。 3. 对检查中使用的助溶剂、中和剂、灭活剂 的作用及对微生物生长和存活的影响应进行 验证 4. 霉菌培养温度改为23~28℃，控制菌培养 温度改为以35~37℃表示，细菌不变。 5. 增加检验结果的单位：10g，10ml。