(完整word版)稳定转染细胞系的一般建立方法
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细胞转染技术原理及应用(瞬时转染和稳定转染)常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说,超螺旋质粒DNA 转染效率较高,在转染后24-72 小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β 半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染,外源DNA 既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小,大约1/104 转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B 磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。
一些传统的转染技术,如DEAE 右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下表:(各种转染方法的比较)除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。
猪PBD-1稳定转染细胞系的建立传统抗生素的广泛使用导致耐药菌株大量产生,特别是多重耐药菌的出现给感染性疾病的治疗带来了许多新的问题,因此寻找和开发无耐药性的新型抗菌药物对于畜牧业具有非常重要的现实意义。
近年来在生物体内发现的防御素类物质就具有这种特殊的抗菌活性,Ganz等将其命名为防御素(Defensins)。
猪的β防御素l(porcine β defensin 1,PBD-1)广泛分布于肝、呼吸道、胸腺、脾脏、脐带等多种细胞内,在猪防御系统中有重要作用,既可用作畜禽饲料添加剂,也可用于食品保鲜剂,还可开发成新的广谱抗菌药物,因此猪防御素的成功获取能带来极大的、经济效益。
但是,猪体内天然防御素表达量低、分子小,分离困难,化学合成防御素成本又太高,所以利用基因工程技术重组表达外源基因已成为获取目标蛋白的有效途径之一[3-7]。
本研究将猪PBD-1真核表达载体稳定转染marc-145细胞,通过单克隆筛选,建立了稳定的转基因细胞系,为进一步研究猪PBD-1的生物学特性及其在兽用生物制品上的应用奠定了基础。
1材料与方法1.1主要试剂转染试剂Lipofectamine 20XX年和筛选试剂G418均由1/ 6Invitrogen公司生产;DMEM高糖培养基、胎牛血清由Gibco公司生产;胰蛋白酶、PBS等为国产。
限制性内切酶EcoRI、BamH I、T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、DNA marker、DNA Gel Extraction Kit均购自华美生物工程公司;RNeasy Mini RNA 提取试剂盒由Qiagen(德国)公司生产;蛋白胨和酵母浸提液来自Oxoid公司;引物由上海生物工程公司合成。
1.2菌种、质粒和细胞大肠杆菌DH5α为本室保存,质粒pMD18-T 由TaKaRa公司提供。
质粒载体pIRES2-EGFP-PBD-1由本实验室构建。
marc-145细胞购自武汉中博生物股份有限公司,在本实验室传代保存。
稳定转染细胞株的制备带质粒的大肠杆菌的激活和扩增(1)取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻,或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。
(2)LB培养基的制备按照如下配方配制胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 10g/L用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4,高温高压灭菌后室温保存,使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml)(3)LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌,待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀,分别倒入6-7个培养皿中,用封口膜封边,并倒置放于4℃保存。
(4)扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上,待凉干后,用封口膜将培养皿封闭,然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃),根据情况可适当延长培养时间。
观察培养基上的单克隆工程菌,待长出后,用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中,放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜,第二天观察,待LB液体培养基变浑浊后,4℃冰箱保存,以待进行下一步质粒的提取。
质粒的提取准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液(1)取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。
(2)5,000×g离心10分钟,弃去上清液,将试管倒置在滤纸上空干。
(3)取出质粒提取盒,用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。
(4)加入3ml细胞裂解液,轻轻摇晃试管混匀,室温下孵育3分钟,产生白色絮状沉淀,然后加入5ml中和液混匀(5)将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管,将上述试管中裂解后的液体倒入兰管,孵育2分钟,1500×g离心5分钟,效果不佳的话可再离心一次,离心液待用。
(6)将Binding Column(白色)放入一新的50ml离心管,取上述离心液倒入白管,1500×g离心3分钟,弃去离心液。
稳定转染细胞株(系)详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上,使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株,稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株,同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看,稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的:先对哺乳动物细胞进行转染,再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时,我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染,通常质粒中带有选择标记,选择标记会与目的基因共表达,由此可以筛选出阳性克隆(外源基因已稳定整合至细胞的基因组上),同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程,将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融,防止在解冻过程中,产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体(载体需带有抗性),随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染,用于转染细胞的方式有多种,包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等,在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池,想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选:先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆,再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株,需要对细胞池进行压力筛选(GS筛选系统或DHFR筛选系统),最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率:外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度;拷贝数:一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰;结合位点:不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性,有些区域易发生重组或者丢失,从而使稳转株筛选后出现丢失的现象;整合位点转录活跃度:整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量;稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异,同一类型细胞,不同个体细胞基因组存在差异,会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后,外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强,瞬时RNA干扰作用周期短,无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选,实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本,也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选,能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性,稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
稳转细胞系构建简单原理概述说明以及解释1. 引言1.1 概述在细胞生物学和遗传学领域,稳转细胞系构建是一项重要的技术,用于研究基因表达、蛋白质功能以及疾病的发生机制等。
稳转细胞系构建是指将外源基因或RNA序列引入目标细胞系中,并使其表达并稳定地传递给后代细胞。
这项技术为科学家们提供了一个探索和理解生命活动的重要工具。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。
首先,在引言部分对稳转细胞系构建进行概述和解释,介绍文章主要内容。
第二部分将详细介绍稳转细胞系构建的基本概念以及常用的方法。
接着,第三和第四部分将侧重于讨论关键要点一和关键要点二,并解释其原理、提供示例或案例分析,并对应用场景进行分析。
最后,在结论与展望部分,将对已述内容进行总结,并提出对未来发展的展望或建议。
1.3 目的本文的目的是向读者介绍稳转细胞系构建的简单原理,包括基本概念、构建方法和原理解释。
同时,通过讨论关键要点一和关键要点二的实例和案例分析,以及对其应用场景的分析,帮助读者更好地理解该技术在科学研究中的意义与应用。
通过本文的阅读,读者将能够对稳转细胞系构建有一个全面且清晰的认识,并为未来相关研究提供参考依据。
2. 稳转细胞系构建简单原理2.1 基本概念解释稳转细胞系是指通过基因转染或基因编辑技术,使得一种细胞在经过多代分裂之后,其特定基因的表达能够被持续稳定地维持。
这样的细胞系在科学研究和生物制药领域中具有重要的应用价值。
2.2 稳转细胞系构建方法构建稳转细胞系的方法主要包括基因转染、基因编辑和选择标记等步骤。
a) 基因转染:常见的基因转染方法包括质粒DNA介导的转染、病毒载体介导的转染以及利用脂质体或者聚合物等载体传递外源基因到目标细胞中。
b) 基因编辑:目前常用的基因编辑技术为CRISPR-Cas9系统,通过引入Cas9核酸酶和相应的寻找序列(sgRNA),实现对目标基因组进行特异性剪切、插入或敲除等修饰。
这种方法可以直接修改目标细胞内特定基因座位,从而实现特定功能蛋白的表达。
转染克隆的G418筛选和分离对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA(通过稳定或永久转染)的细胞系来说,理想的是使用选择标记,通常也是必要的。
虽然有许多标记可利用,但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。
G418是一种氨基糖苷类似物,在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。
因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH(氨基糖苷类磷酸转移酶)基因将产生G418的解毒作用。
这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导,特殊条件由研究者个人决定。
1.建立死亡曲线,确定最佳筛选浓度(参考建立方法见附录);2.细胞铺板:转染后24小时将贴壁的细胞传代(传代时,注意通过在显微镜下观察,控制细胞密度,不能使细胞太密集,应该少于生长表面的50%,参考为20%-30%)至15cm 培养皿,加入15~20ml培养基(DMEM,含血清)进行培养;3.用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选:铺板完成后,再过24小时,抗性表达,用最佳筛选浓度的G418进行筛选(对于Hela细胞,一般筛选终浓度为800ug/ml)。
具体操作是去除旧的培养基,用PBS洗一次,将含有浓度为800ug/ml(以Hela为例)的培养基15~20ml加入培养皿内即可;4.换液:每日及时观察细胞,根据培养基的颜色和细胞生长情况,及时更换相同浓度(800ug/ml)的培养基,大概持续筛选一周左右,直至空白对照组(未转染组)细胞死亡大部分(至少30%以上);5.撤药维持阶段:待空白组细胞大部分死亡后,将实验组(转染组)进行换液,此时所用培养基含G418的终浓度为200ug/ml(维持浓度),维持生长(若细胞仍有死亡,需要继续降低药的浓度,参考为50-100ug/ml),直至筛选克隆可见为止(大约2~3天);6.分离克隆以获得最大数量细胞(提高克隆成活可能性),减少单个克隆受其他细胞污染的机会。
稳定细胞株(系)构建实验要求稳定细胞系(stable cell line),是指质粒整合到染色体上后,用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系,就成了稳定表达的cell line。
以下实验,构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求:1),外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。
虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率,但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。
而非分裂细胞,可以使用腺相关病毒载体转导外源基因,因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。
2),需要构建使用诱导表达系统,这主要是由于:a),过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素; b),目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。
3),希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数,以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。
构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。
4),部分细胞种类,病毒载体亦无法达到高转导效率,通过构建稳定株,达到外源片段的高效表达。
5),长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能,通过构建稳定株,可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本,也极大方便实验研究。
6),部分蛋白稳定性极强,瞬时RNA干扰因为作用周期短,只能抑制目的基因的表达,但无法去除已经表达的目的蛋白,所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。
7),需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。
需要构建稳定细胞株,以防止注射入动物体内后,很快外源片段表达丢失。
8),细胞个体差异(同一类细胞,不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰,需要构建单克隆细胞株去除干扰。
9),需要将外源片段插入基因组中,比如基因敲除,基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。
应用:研究发现了一种在这些癌症干细胞上表达的蛋白,同时制备了能与该蛋白特异结合的抗体。
当抗体注射入此前已注射癌症干细胞的小鼠后,抑制了癌症细胞向其他器官转移。
稳定细胞株构建稳定细胞株的构建是分子生物学和基因工程学领域中的重要技术之一。
它是研究基因在体内作用和基因功能的实验研究中必不可少的工具。
稳定细胞株指细胞在一定条件下能够长期稳定地表达特定基因的细胞系。
本文将从稳定细胞株的定义、构建方法、选择与鉴定等方面进行介绍。
一、稳定细胞株的定义稳定细胞株是指在体内、外转染过程中,选用合适的筛选、克隆和鉴定方法后,成功获得细胞固有基因改变或是外源DNA转移并集成到基因组的一种特殊细胞株。
与病毒感染后获得的短暂性表达不同,这种稳定细胞株能够持续稳定地表达需求的基因,从而称其为经过稳定转染的细胞株。
这种细胞株的构建对于探究生物分子的功能及其相关基因及信号通路的研究具有非常重要的意义。
1. 选择适当的载体:要构建稳定细胞株首先需要选择合适的载体,常用的载体有质粒、病毒、人工染色体等。
选择载体的关键是该载体能否满足待表达基因的大小、结构和表达水平要求。
2. 转染DNA:将表达目的基因的DNA载体导入到目标细胞内,并带入一个选择性基因,用来区分携带目标DNA的细胞和不携带的细胞。
转染方法可以选择化学法、电转法、导出法、生物法等。
3. 筛选细胞:待转染完成后,可以通过添加对应抗生素或药物,选择对基因表达有利的细胞,最终选择转染成功且能够稳定表达目的基因的细胞。
4. 克隆稳定细胞株:将稳定表达目的基因的单个细胞进行克隆成纯种,常用方法有限制性酶切,PCR扩增等。
5. 筛选和鉴定:对克隆的细胞进行筛选和鉴定。
其中,鉴定的指标需要依据实验需要进行调整,如基因表达水平、蛋白质水平等。
同时,也需要确保稳定细胞株在长期维护中能够稳定表达目的基因。
选择稳定细胞株时,需要确保细胞具备稳定性、高的表达水平和特异性。
同时,还需要有合理的对照组。
常用的鉴定方法有:Western blotting、流式细胞术等。
四、一些常见的问题1. 容器类型:选择扁平形状且易于吸附细胞的容器,如96孔板、24孔板等。
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方,大家补充。
筛选之前确定G418浓度:1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验:3x106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1,由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
稳转细胞系的构建方法以稳转细胞系的构建方法为标题,写一篇文章细胞系是指从原始组织或细胞中获得的具有相同遗传特征和生物学行为的细胞的连续生长和传代。
稳转细胞系即指在细胞系中稳定表达外源基因的细胞系。
构建稳转细胞系是细胞和分子生物学研究中常用的技术手段之一,它可以为我们研究基因功能和细胞信号传导提供重要的工具。
构建稳转细胞系的方法有很多种,下面将介绍其中的几种常用方法。
1. 转染法转染法是最常见的构建稳转细胞系的方法之一。
它通过将外源基因导入到目标细胞中,使细胞表达该基因。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体法等。
其中,化学法是最简单和常用的方法之一,它通过利用化学试剂将外源基因导入细胞内。
电穿孔法则是利用电脉冲使细胞膜发生短暂的孔洞,从而导入外源基因。
病毒载体法则是利用病毒作为载体将外源基因导入细胞内。
转染法的优点是操作简单,适用于多种细胞类型,但其缺点是转染效率低,稳定性差。
2. 质粒整合法质粒整合法是构建稳转细胞系的另一种常用方法。
该方法利用特定的质粒将外源基因整合到细胞染色体中,使其稳定表达。
常用的质粒整合方法包括选择性抗生素筛选法和荧光素酶报告基因法等。
选择性抗生素筛选法是将外源基因与抗生素抗性基因连接在一起,然后将其导入细胞中,再通过选择性培养基对细胞进行筛选,只保留表达外源基因的细胞。
荧光素酶报告基因法则是将外源基因与荧光素酶基因连接在一起,然后通过荧光素酶活性检测来筛选表达外源基因的细胞。
质粒整合法的优点是构建的稳转细胞系稳定性较好,但其缺点是构建过程较复杂,适用细胞类型有限。
3. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术,也可以用于构建稳转细胞系。
该技术利用CRISPR/Cas9系统的导引RNA和Cas9蛋白靶向编辑细胞染色体中的特定位点,使外源基因整合到细胞染色体中。
CRISPR/Cas9技术具有高效、精准和灵活的特点,使得构建稳转细胞系变得更加简单和快速。
第 49 卷第 6 期2023年 11 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.49 No.6Nov.2023DOI:10.13481/j.1671‑587X.20230603SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建黄少婷1,2, 李友1,2, 吴钊淳2, 何嘉文2, 廖科棋2, 李胜男1,2(1. 广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室,广东湛江524002;2. 广东医科大学附属医院神经病学研究所,广东湛江524002)[摘要]目的目的:构建性别决定区Y盒17(SOX17)过表达慢病毒载体,使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。
方法:在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列,将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接,构建GV492-SOX17过表达重组质粒。
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,筛选携带GV492-SOX17过表达重组质粒的阳性菌,克隆后测序。
将GV492空载质粒和GV492-SOX17过表达重组质粒分别转染至人胚肾HEK 293T细胞中,转染48 h后收集GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒进行包装并测定病毒滴度。
将PC12细胞分为空白组、GV492对照组和GV492-SOX17组,空白组不作处理,GV492对照组和GV492-SOX17组分别采用相应慢病毒感染细胞(感染复数=100),10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的PC12细胞,荧光显微镜观察各组PC12细胞生长状态及绿色荧光表达情况。
采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平,Western blotting 法检测各组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平。
结果结果:GV492-SOX17过表达重组质粒的基因片段长度约为744 bp, GV492-SOX17过表达重组质粒基因序列与设计合成的SOX17过表达序列一致。
人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立论著文章编号:100025404(2007)0120032204人M CHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立袁成福,杨俊霞,魏丽丽,石华,陈济,宋方洲 (重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,教育部临床检验诊断学重点实验室,重庆400016)提要:目的构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。
方法采用PCR方法,以人胎脑c DNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长c DNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO 细胞系,用RT2PCR、W estern bl ot及免疫荧光法检测MCHR2的表达。
结果成功构建了pc DNA3.1(+)/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因。
结论真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础。
关键词:MCHR2;真核表达载体;稳定转染的CHO细胞系;基因表达中图法分类号:R338.2;R394233;R394.3 文献标识码:ACon structi on of eukaryoti c expressi on vector of hu man M CHR2and est ablish m en t of its stable tran sfected CHO cell li n eY UAN Cheng2fu,Y ANG Jun2xia,W E IL i2li,SH IHua,CHEN J i,S ONG Fang2zhou(Depart m ent of B i oche m istry and Molec2 ular B i ol ogy,ChongqingM edical University,Chongqing400016,China)Abstract:O b j ec ti ve T o construct eukaryotic ex p ressi on vect or of human melanin2concentrating hor mone recep t or2(MCHR2)and transfect CHO cells t o establish stable CHO cellline.M e tho d s The full2length MCHR2c DNA frag ment was a mp lified by PCR fr om the human fetal brain c DNA library and was inserted int o eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+),after the identificati on by digesti on and sequencing on the recom2 binant eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2,the recombinant was transfected int o CHO cell by li pofecta m ine T M2000.After screening culture by G418,stable transfected CHO cell line was established, and the transcri p ti on and exp ressi on ofMCHR2were identified by RT2PCR,W estern bl otting and i m munofluo2 rescence.R e su lts The eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2was constructed successfully.The stable transfected CHO cell line was established.The MCHR2p r otein was exp ressed successfully.Co nc lu2 s i o n The constructi on of the eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2and the establish ment of stable transfected CHO cell line p r ovide s olid f oundati on for further experi m ental studies on the functi on of MCHR2.Key words:MCHR2;eukaryotic exp ressi on vect or;stable transfected CHO cell line;gene exp ressi on肥胖是现代社会中常见的营养障碍性疾病,其发病率在发达国家和发展中国家逐年上升,已成为一个全球性的健康问题。
质粒瞬转构建稳定细胞系?稳定细胞系构建最常用的方法是采用慢病毒。
那是否一定要采用慢病毒呢?答案是非必须的。
采用质粒瞬转也能够构建稳定细胞系。
下面就和细胞君一起熟悉质粒瞬转构建稳定系:方法应用前题:目的细胞的瞬转效率?细胞君曾多次转染极易转染的HEK293,细胞数量约2*10^6个,最终能够存活的单克隆个数不到50,能够稳定表达外源基因的就更少了。
基于此,我们就了解到转染效率越高,我们获得稳定细胞系的概率就越大;转染效率低的情况下如不足5%,细胞君建议同学们只能是尝试不要浪费太多时间纠结。
有的同学会问既然瞬转效率低,那我是否可以直接放大细胞量进行操作呢?理论是可行的,但要面临更大的工作量和成本。
且转染效率太低,单克隆获得量的差别就是数量级,放大细胞量恐难以实现。
Tip:同学们可以通过摸索转染试剂添加量、质粒添加量等条件转染目的细胞荧光表达对照质粒预实验得到最佳转染效率条件。
构建稳定细胞系具体方法:相信同学们都知道大概如下流程,我们只聊聊单克隆筛选阶段:构建稳定细胞系流程:转染——单克隆筛选——扩增,检测——入库1、各操作时间节点单克隆筛选铺板:转染后24h。
因我们转染细胞密度较高,所以转染后24h要尽快铺板,防止细胞堆积状态变差。
单克隆筛选药筛:转染后48h。
该时间节点为瞬转外源基因表达高峰,若细胞状态差放缓至72h再药筛。
每3~4天,更换或补充含药培养基。
单克隆筛选扩增:筛选2~3周。
单克隆形成的时间一般为2~3周。
2、各操作变量单克隆药筛浓度:首轮药筛1/4~1/2的梯度药筛浓度。
3~4天后,观察存活的细胞数量,如只有极少量单个细胞存活,此时可依据细胞状态更换为无药物培养基或1/4的药筛浓度以维持筛选压力。
否则继续维持梯度的1/4~1/2药筛浓度筛选直至只有极少量单个细胞存活。
Tip:我们的目的是让整合的细胞能够存活,非整合细胞被灭杀,所以一定要梯度给药,只要有合适药物浓度筛选下的单克隆存活即可。
转染克隆的G418筛选和分离
对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA(通过稳定或永久转染)的细胞系来说,理想的是使用选择标记,通常也是必要的。
虽然有许多标记可利用,但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。
G418是一种氨基糖苷类似物,在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。
因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH(氨基糖苷类磷酸转移酶)基因将产生G418的解毒作用。
这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导,特殊条件由研究者个人决定。
1.建立死亡曲线,确定最佳筛选浓度(参考建立方法见附录);
2.细胞铺板:转染后24小时将贴壁的细胞传代(传代时,注意通过在显微镜下观察,控
制细胞密度,不能使细胞太密集,应该少于生长表面的50%,参考为20%-30%)至15cm 培养皿,加入15~20ml培养基(DMEM,含血清)进行培养;
3.用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选:铺板完成后,再过24小时,抗性表达,用最
佳筛选浓度的G418进行筛选(对于Hela细胞,一般筛选终浓度为800ug/ml)。
具体操作是去除旧的培养基,用PBS洗一次,将含有浓度为800ug/ml(以Hela为例)的培养基15~20ml加入培养皿内即可;
4.换液:每日及时观察细胞,根据培养基的颜色和细胞生长情况,及时更换相同浓度
(800ug/ml)的培养基,大概持续筛选一周左右,直至空白对照组(未转染组)细胞死亡大部分(至少30%以上);
5.撤药维持阶段:待空白组细胞大部分死亡后,将实验组(转染组)进行换液,此时所用
培养基含G418的终浓度为200ug/ml(维持浓度),维持生长(若细胞仍有死亡,需要继续降低药的浓度,参考为50-100ug/ml),直至筛选克隆可见为止(大约2~3天);
6.分离克隆以获得最大数量细胞(提高克隆成活可能性),减少单个克隆受其他细胞污染
的机会。
具体操作是:a.用PBS洗含有克隆的培养物,圈出欲分离的克隆。
从培养皿中除去液体,准备24孔板收集克隆;b.从培养皿中用牙签或者棉棒(经过高压)挑取已分离出的克隆(具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶,再蘸一下克隆);c.在24孔板的一个孔中(事先已加入完全培养基,不含G418)剧烈摇动牙签,使细胞沉于孔中,继续挑取下一个克隆;
7.CO2孵箱,温育细胞约两小时;
8.两小时后,镜检培养皿,确定细胞是否附着。
如果已经附着,用新鲜完全培养基(含
50ug/ml G418)更换24孔板培养基,除去残留的胰蛋白酶,继续培养直到培养物长满;
9.一旦小量培养物长满,转接到大的培养皿(通常先是6孔板),用50ug/ml的新鲜完全
培养基维持培养,然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。
附录:死亡曲线建立方法
1.G418的配制:取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中,加蒸馏水至10ml,过滤
除菌,4℃保存;
2.细胞培养:取待测培养细胞,制备成细胞悬液,按等量接种入多孔培养板中,培养6h
左右开始加药;
3.制备筛选培养基:在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度,比如先做个100、400、800、
1000ug/ml,按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基;
4.加G418筛选:吸除培养基,PBS洗涤一次,每孔中加入不同浓度的筛选培养基;
5.换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况,每隔3~5d更换一次筛选培养基;
6.确定最佳筛选浓度:在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选
浓度。