第6章--分子生物学技术
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分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
分子生物学第5章、第6章
•DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为 遗传重组，或基因重排。→ 重组DNA •真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染 色体之间的交换；细菌及噬菌体的基因组为单倍体， 来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传 重组。 •DNA重组对生物进化起着关键的作用。 •重组分类：同源重组(homologous recombination) 、 位点特异性重组(site-specific recombination)、 转座重组(transposition recombination)和 异常重组(illegitimate recombination)。
1. 互变异构体：碱基发生烯醇式-酮式互变异构或者氨 基-亚氨基互变异构时，使碱基错配。 2. 脱氨基作用：碱基上氨基自发脱落，或在诱变剂的 作用下脱去氨基，则C→U、A →I、G →X，引起子 链错误。 3. DNA聚合酶“打滑”：DNA复制时发生碱基的环出现 象，引起一个或数个碱基的插入或缺失，易发生于 几个相同碱基串联的部位。 4. 活性氧（O3）引起的诱变：①氧化碱基与C、A配对， 造成GC → TA颠换，这种损伤可以积累；②H2O2造成 的DNA氧化损伤，此类损伤一般能被修复。
核苷酸切除修复
错配修复
错配修复对 DNA复制忠实 性的贡献力达 102-103，DNA 子链中的错配 几乎完全都被 修正，充分反 映了母链的重 要性。
大肠杆菌甲基化引 导的错配修复
重组修复
易错修复和SOS反应
•SOS反应：当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而
诱发出一系列复杂的反应。
•这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。
5.3.4 基因突变的后果
基因突变的后果主要是生物功能的丧失。 某一基因突变后使其所表达的蛋白质或酶失活， 有时还会引起多种酶的缺乏。 有些突变可产生功能获得性显性表现型。 典型的人体细胞突变每个基因每代发生率为107～10-5，但并非所有的突变都会导致疾病。
分子生物学内容整理
第一章绪论问答：1、分子生物学的发展大致可分为哪几个阶段①准备和酝酿阶段：确定蛋白质是生命活动的主要物质基础确定DNA是生物遗传的物质基础②现代分子生物学的建立和发展：建立遗传信息传递中心法则对蛋白质结构和功能的进一步认识③初步认识生命本质并改造：重组DNA技术的建立和发展基因组研究的进展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展基因表达调控机理细胞信号转导机制研究成为新的前沿领域新技术平台驱动分子生物学的发展第二章基因、基因组、基因组学名解：1、基因（两个定义）：遗传学角度---是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子．．．．。
分子生物学角度---是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA，包括编码．．蛋白质或RNA的核酸序列及为保证转录所必需的调控序列．．．．。
2、开放阅读框架（ORF）：是指DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码。
3、C值（C value）：是指一种生物体单倍体基因组DNA的总量。
4、基因组（genome）：是指生物体全套遗传信息，包括所有基因和基因间的区域5、基因重叠：是指同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。
6、多顺反子mRNA（polycistronie mRNA）：是指病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。
它们可被一起转录成含有多个mRNA的分子。
7、类核（nucleoid）：是指原核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个致密的区域。
8、质粒（plasmid）：是指一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。
9、质粒的不相容性（incompatibility）：是指两个不同的质粒因利用同一复制和维持机制，在复制和随后向子代细胞分配的过程中会发生竞争，从而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失的现象。
分子生物学全面复习之填空
第2章一、1. DNA聚合酶I(E．coli)的生物功能有（聚合作用）、（5’→3’外切酶作用）和（3’→5’外切酶）作用。
2. （解旋酶）作用是使DNA双螺旋打开，反应需要A TP提供能量。
3. 在DNA复制过程中，改变DNA螺旋程度的酶叫（拓扑异构酶）。
4. DNA生物合成的方向是（5’→3’），冈奇片段合成方向是（5’→3’）。
5. 在DNA合成中负责复制和修复的酶是（DNA聚合酶）。
6. DNA后随链合成的起始要一段短的（RNA引物），它是由（DNA引发酶）以核苷酸的底物合成的。
7. 帮助DNA解旋的（单链结合蛋白（SSB））与单链DNA结合，使碱基仍可参与模板反应。
8. 在DNA复制和修复过程中，修补DNA双螺旋上缺口的酶称为（DNA连接酶）。
9. 复制叉上DNA双螺旋的解旋作用由（DNA解旋酶）催化的，它利用来源于A TP水解产生的能量沿DNA链单向移动。
10. DNA引发酶分子与DNA解旋酶直接结合形成一个（引发体）单位，它可在复制叉上沿后随链下移，随着后移链的延伸合成RNA引物。
11. 证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎双球菌的转化实验）、（噬菌体的侵染实验）。
12. 大肠杆菌的基因组是（一股双螺旋（或双股、双股环状））DNA，它的复制是由单一原点出发按（θ（或双向θ））方向进行。
13. 在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为（DNA连接酶）。
14. 染色体一般由（DNA）和（蛋白质）两部分组成。
15. 核小体一般由（DNA）和（组蛋白）两部分组成16. DNA复制是一个（半保留）的过程，即子代分子的一半来自亲代，而另一半是新合成的。
这个复制特点保证了遗传信息的（高保真性）。
17. DNA后随链合成的起始要一段短的（RNA引物），它是由（DNA引发酶）以核糖核苷酸为底物合成的。
18. 紫外线照射可在相邻两个（胸腺）嘧啶间形成（嘧啶二聚体）。
19. DNA复制时，随后链的延长方向与解链方向相反，其中刚合成的短片段叫做（冈崎片段）。
分子生物学考点整理1
分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。
四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。
根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。
这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。
二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。
2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。
3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。
5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。
重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。
分子生物学教学大纲
分子生物学教学大纲一、引言分子生物学是生物学中重要的分支之一，研究生物体内分子结构和功能的基本规律，对于理解生命现象和指导生物科研具有重要意义。
本教学大纲旨在系统性地介绍分子生物学的基本知识，帮助学生建立正确的分子生物学思维方式，培养分子生物学研究的基本技能。
二、课程设置1.第一章：绪论- 介绍分子生物学的研究对象和研究方法- 解释基本的分子生物学术语和概念2.第二章：DNA结构和功能- 讲解DNA的结构特点和功能- 探讨DNA复制和修复的机制3.第三章：RNA结构和功能- 介绍RNA的类型和功能- 讨论转录和翻译的原理及过程4.第四章：基因调控- 解释基因表达的调控机制- 探讨基因调控与细胞分化的关系5.第五章：蛋白质结构和功能- 介绍蛋白质的合成和功能- 分析蛋白质的结构与功能之间的关系6.第六章：基因工程技术- 介绍基因克隆、DNA测序等基因工程技术的原理- 探讨基因工程技术在生物科学和医学领域的应用7.第七章：分子生物学研究方法- 介绍PCR、Western blot等分子生物学实验技术的原理和操作方法- 开展分子生物学实验操作训练三、教学目标通过本课程的学习，学生将能够：1. 掌握分子生物学的基本概念和基本原理2. 理解DNA、RNA、蛋白质的结构与功能3. 熟练掌握分子生物学实验技术的操作方法4. 熟悉基因工程技术的原理和应用5. 培养科学研究和实验操作的能力四、教学方法本课程将采用多种教学方法，包括讲授、实验操作、案例分析、小组讨论等，以帮助学生全面理解和应用分子生物学知识。
五、教学要求1. 学生需认真听讲，积极参与课堂讨论和实验操作2. 学生需完成规定的课程作业和实验报告3. 学生需按时参加考试，考核其对分子生物学知识的掌握情况六、总结通过本课程的学习，学生将能够全面了解分子生物学的基本原理和实验技术，奠定坚实的分子生物学基础，为今后的学术研究和职业发展奠定基础。
愿学生在本课程中取得优异的成绩，不断提升自己对于生物科学的理解和实践能力。
分子生物学教学资料第6章rna剪接
Primary transcript定义：Exons (外显子):编码序列Introns (内含子) : 间隔序列RNA splicing(RNA剪接): 从前mRNA中除去内含子的过程Alternative splicing (可变剪接): 有些前mRNA存在不止一种的剪接方式，从而产生不同的mRNA。
通过这种方式一个基因可以产生多个多肽产物。
通过可变剪接，从一个基因得到的不同产物数量可以从2种到数百甚至数千种。
Why RNA splicing is important?1.RNA剪接的化学基础2. 剪接体Spliceosome:执行RNA的剪接的大复合体，有5种snRNA(核内小RNA: U1,U2,U4,U5,U6)，主要执行功能是RNA非蛋白质。
snRNA的三个功能：Recognizing：识别5’剪接位点和分支位点Bringing：将这两个位点集结到一起U2 取代BBP3. 剪接过程可变剪接Alternative splicing and regulation通过可变剪接一个基因可以得到多个产物。
RNA剪接的5种模式①正常剪接②外显子遗漏③外显子延伸④内含子保留⑤可变剪接可变剪接：组成型：同一个基因总是产生多种不同产物调控型：不同的时间、条件下或不同的细胞、组织中，产生不同mRNA剪接调控蛋白结合到特殊序列上：外显子/内含子剪接增强子enhancer(ESE or ISE)-增强附近剪接位点的剪接(剪接->未剪接)外显子/内含子剪接减弱子silencer（ESS or ISS)–减弱附近剪接位点的剪接(未剪接->剪接) (在不同条件下引导剪接体到不同的剪接位点发挥作用；在发育的某个阶段或在某种类型的细胞中，一种特定的SR蛋白的存在与否或者活性高低，就可以决定某一个特定的剪接位点是否得到利用)特殊内含子剪切体：AT-AC型剪接体催化的剪接反应：U1->U11，U2->U12自剪接内含子Self-splicing introns and mechanisms自剪接：前体RNA中的内含子自身折叠成一种特殊的构象，然后催化自身释放的化学过程。
分子生物学常用实验技术(精)
分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。
细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。
质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。
F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。
第6章 分子生物学研究方法(下)
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝
胶在上的方式将其放臵在一个真空室上，利用真空作用
将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真 空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或
硝酸纤维素膜上。
各种转移方法的比较：
6.1.2 RNA选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、 5’ 选择性剪切、 3’ 选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。 果蝇 Dscam 基 因可 以通过可变 剪接产生38000多 种 可 能 的 mRNA 异构体
Illumina Solexa 测序 Workflow
Illumina Sequencing Technology
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化
• 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
5.4.1 RACE 法克隆基因全长 (Rapid Amplification of cDNA Ends)
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
分子生物学 第六章
摆动性
• 反密码子与密码子之间的配对并不完全遵照 碱基互补规律，称为摆动配对。
二、tRNA
（一）结构特点 1.二级结构：三叶草结构
四环： 二氢尿嘧啶环 反密码子环 额外环 胸腺嘧啶假尿嘧啶胞嘧啶环 一臂： 氨基酸接受臂
2.三级结构——“倒L型”
（二）起始tRNA
密码子 氨基酸 表示方法
（二）延伸
1.进位 • 氨酰-tRNA 按照mRNA 分子的编码 信息进入并 结合到核糖 体A位。
（二）延伸
2.成肽
• 转肽酶催化 肽酰-tRNA 上的肽酰基 转移到A位 氨酰-tRNA 上的氨基酸 α-氨基上。
（二）延伸
3.转位
• 转位酶催化核 糖体沿mRNA 的3‘方向移动 一个密码子的 距离，使 mRNA上的下 一个密码子进 入A位，肽酰tRNA由A位移 入P位。
三、修饰
（一）磷酸化 是指在蛋白激酶的催化作用下，ATP的γ-磷酸 基被转移到蛋白质特定位点上的过程。 通常蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和在糖基转移酶的作用下，蛋白质的特定 氨基酸残基被共价连接上寡糖链的过程。 • 糖链与氨基酸的连接主要有O型连接和N型 连接两种方式。
终止密码子： 琥珀石（UAG） 赭石（UAA) 卵白石(UGA)
起始密码子： AUG（甲硫氨酸）
2.特性
(1)完整性：有始有终 (2)方向性：5’到3’ (3)连续性：不中断、无重叠 (4)简并性：多对一 (5)统一性：万物统一 (6)摆动性：：3’位可变 (7)偏爱性：使用频率各异
简并性
• 一种氨基酸具有 两个或两个以上 的密码子为其编 码，这一特性称 为遗传密码的简 并性。
一、mRNA （一）结构特点
原核 生物
真核 生物
什么是分子生物学技术
什么是分子生物学技术
分子生物学技术是以基因重组技术和细胞融合技术为基础，利用生物体或者生物组织、细胞及其组分的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品种，以便与工程原理相结台进行生产加工，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。
分子生物学主要致力表现于对细胞中不同系统之间相互作用的理解，包括DNA，RNA和蛋白质生物合成之间的关系，以及了解它们之间的相互作用是如何被调控的。
以上信息仅供参考，建议查阅专业书籍或者咨询专业人士。
分子生物学全套课件(2024)
2024/1/26
17
蛋白质在细胞中的作用
蛋白质可以作为酶催化生物体内 的化学反应，维持生命活动的正 常进行。
蛋白质可以作为载体运输物质， 如血红蛋白运输氧气和二氧化碳 。
蛋白质可以作为抗体参与免疫反 应，保护机体免受病原体的侵害 。
蛋白质是细胞结构和功能的基础 ，参与细胞的各种生命活动，如 催化、运输、免疫、调节等。
2024/1/26
21
基因表达调控的分子机制
DNA结合蛋白的作用
识别并结合特定DNA序列，影响基因转录。
染色质结构与基因表达
染色质结构的变化可影响基因的可及性和转 录活性。
2024/1/26
信号转导与基因表达调控
细胞外信号通过信号转导途径影响基因表达 。
转录后调控机制
包括mRNA剪接、转运、定位和降解等过程 对基因表达的调控。
比较基因组学分析
通过比较不同物种或不同个体之间的基因组差异，揭示物种进化、基 因功能等生物学问题。
生物信息学在基因组学中的应用
利用生物信息学方法对基因组数据进行挖掘和分析，发现新的基因、 突变位点以及与疾病相关的遗传变异等。
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THANK YOU
感谢观看
2024/1/26
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2024/1/26
8
DNA的复制与修复
01
02
03
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶 段，涉及多种蛋白质和酶 的参与。
2024/1/26
DNA复制的特点
半保留复制、半不连续复 制等。
DNA修复的机制
直接修复、切除修复、重 组修复和SOS修复等，用 于纠正复制过程中产生的 错误。
9
DNA的转录与表达
现代分子生物学实验技术PPT(下)
第6章基因功能研究技术SAGE基因表达系列分析技术•serial analysis of gene expression: SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。
•首先，一段来自于任一转录本特定区域的"标签"（Tag），即长度仅9-14 bp的核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。
例如：一个9碱基的序列能有49=262144种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个9碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。
•如果将短片段标签相互连接、集中形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可对数以千计的mRNA转录本进行批量分析。
•各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数进行定量。
测序并用计算机辅助分析锚定酶AE 酶切后，与抗生物素蛋白包裹的微磁珠相连，分离3‘端酶切片段生物素分两份分别与接头相连标签酶TE 酶切锚定酶AE 酶切分离纯化双标签串联入载体连接并根据接头1,2 设计引物进行PCR末端补平Anchoring Enzyme: AE识别位点：CATGTag1Tag2Tag3Tag4Tagging Enzyme ：TE距识别位点约20碱基的位置切割DNAbiotin-oligo dT 5’AAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTTT-5’3’mRNAcDNA biotin-oligo dTAAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTTT-5’3’5’ds cDNA 锚定酶（AE ）Nla III 进行酶切收集3'端部分TTTTTTTTTTT-5’biotin-oligo dT 3’-XXXXXXXXXX GTAC AAAAAAAAAAA-3’5’-XXXXXXXX CATG biotin-oligo dT AAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTTT-5’3’-GTAC 收集大量不同的cDNA 3‘端序列部分锚定酶通常为识别4碱基位点的III 类限制性内切酶，如Nla III 、Sau3A I 等。
分子生物学第六章真核生物基因表达调控
教案首页课程名称分子生物学任课教师李市场第6 章真核生物的表达调控计划学时 6教学目的和要求：a)真核生物的基因结构与转录活性b)真核基因的转录c)反式作用因子*d)真核基因转录调控的主要模式e)其他水平上的基因调控重点：真核生物翻译调控的影响因素及其转录调控的主要模式。
难点：真核生物翻译调控的影响因素及其转录调控的主要模式。
思考题：1真核基因转录调控的主要模式有哪些？第六章真核基因表达调控原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。
真核生物（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。
人类细胞单倍体基因组就包含有3×109bp总DNA，约为大肠杆菌总DNA 的1000倍，是噬菌体总DNA的10万倍左右！真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现"预定"的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。
真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。
第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。
转录水平调控（transcriptional regulation）；转录后水平调控（post transcriptional regulation）；翻译水平调控（translational regulation）；蛋白质加工水平的调控（regulation of protein maturation）等。
分子生物学
第一章绪论名词解释1.分子生物学广义：研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规侓性和互相关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
狭义：研究范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程。
2.信号传导：外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能的应答过程。
3.转录因子：一群能与基因5’端上特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
4.RNA剪辑：当基因转录成pre—mRMA后，除了在5’端加帽及3’端加多聚A（ployA）之外，还要切去隔开各个相邻编码区的内含子，使外显子（编码区）相连后成为成熟MRNA。
简答题1.简述分子生物学的含义及研究内容（1）广义：研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规侓性和互相关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
狭义：研究范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过（1）分子生物学的三条基本原理：构成生物体各类有机大分子的单体在不同的生物体中都是相同的。
生物体内一切有机大分子的建成都遵循共同的规则。
某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。
（2）研究内容DNA重组技术基因表达调控研究生物大分子的结构、功能研究2.简述DNA重组技术的应用前景用于大量生产某种在正常细胞代谢中产量很低的多肽：如激素、抗生素、酶类、抗体等，提高产量，降低成本，使许多有用多肽得到广泛的应用。
用于定向改造某些生物基因组结构,使其具备的特殊经济价值或功能提高、扩大用于基础研究3.简述真核生物基因表达调控的三个水平。
调控：三个水平上信号传导：外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能的应答过程。
分子生物学
从细菌和真菌细胞中提取的环状 DNA 分子
通常是负超螺旋， σ 值约为-0.06
唯一含有正超螺旋DNA 的生物体是 某些生活在极端高温环境（如温泉）中的嗜热微生物 ???
负超螺旋储存自由能 帮助完成DNA 复制和转录等需要双链解等过程
与松弛状态DNA 相比，负超螺旋DNA 更易于 解链
真核细胞中核小体引入了负超螺旋 以左手方式缠绕组蛋白核心（螺线管） 相当于负超螺旋 见第七章
分子生物学
刘青珍 武汉大学生命科学学院
第6章 DNA 和 RNA 的结构
DNA 和 RNA 的结构如何影响其功能
本章内容
1. DNA 的结构 2. DNA 拓扑学
3. RNA 的结构
2. DNA 拓扑学（1）
DNA 是一种柔性结构 它精确的分子参数与 周围的离子环境和 与它形成复合体的DNA 结合蛋白的性质有关
线性DNA
可自由旋转以适应双螺旋两条链彼此缠绕次数的变化
环状DNA
如果两条链的糖-磷酸骨架没有断裂 DNA 分子的两条链彼此缠绕的次数就不能改变 这样的共价闭环 DNA (cccDNA) 的拓扑结构是受限的 真核细胞染色体 长度极长、形成染色质结构、与其他细胞成分相互作用
真核细胞染色体线性DNA 分子的拓扑结构也是受限的
生理条件下cccDNA 的连环数 (Lk) 表示为Lk0
这样分子的 Lk0 等于碱基对数目除以 10.5 所得的值
细胞中DNA 呈负超螺旋
连环差 用 Lk 和Lk0 的差值衡量超螺旋的程度
∆Lk =Lk - Lk0
超螺旋密度: σ = ∆Lk / Lk0 如果 ∆Lk < 0, DNA 为负超螺旋 如果 ∆Lk > 0, DNA 为正超螺旋
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2、核酸的分离与纯化
将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸 与其他物质分离
非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖 和脂类分子）、非目的核酸分子、试剂
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
➢沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 ➢ 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后
使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）
➢少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅， DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
4 异丙醇沉淀法： 基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代
乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶 状态）。
5 表面活性剂快速制备法： 用Triton X-100或NP-40表面活性剂破
碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙 醇沉淀或透析。
主要试剂及其作用： EDTA： ①二价金属螯合剂，抑制核酸酶； ②降低细胞膜的稳定性。 SDS： ①溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜破裂； ②溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
释放出来； ③对RNA、DNA酶有抑制作用； ④与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。
蛋白酶K： 消化DNA酶和细胞中的蛋白质。可与SDS、 EDTA同时使用，仍保持较高活性。 酚： 使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酶活性。 pH8.0的Tris溶液： 使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层 滞留。 酚或酚-氯仿中少许的异戊醇： 减少气泡的产生，利于分相，保持分相的稳 定性。
➢液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中 进行杂交反应。
（一）膜上印迹杂交
将待测核酸序列结合到一定的支持物 上，然后与存在于液相中的核酸探针进行 杂交的过程称为膜上印迹杂交。 印记的方法： 虹吸印迹法；真空转移法；电转移法
DNA或RNA ↓
电泳分离核酸片段 ↓
转移至固相支持物（印迹技术） ↓
杂交 ↓
Tm值与核酸含量的关系 ① <20bp Tm = 4(G≡C)+2(A＝T) ② >20bp Tm = 69.3+0.41(G≡C)%
4、杂交
• 来源不同的两条单链核酸分子通过碱 基互补形成异源双螺旋分子，称为核 酸分子杂交。
• 杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、 DNA与RNA之间的杂交。
（二）措施 ①温度不要过高； ②控制pH值范围(pH值5-9)； ③保持一定离子强度； ④减少物理因素对核酸的机械剪切力； ⑤所用器械和一些试剂需高温灭菌； ⑥提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸 链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
（三）核酸分子抽提的技术设计
1、核酸的释放--破裂细胞，释放核酸。 ⑴高速组织捣碎机捣碎 ⑵玻璃匀浆器匀浆 ⑶超声波处理法 ⑷液氮研磨法 ⑸化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） ⑹生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
第二节 核酸杂交技术
一、核酸分子杂交的基本原理
核酸分子杂交 （nucleic acid hybridization）
指具有互补序列的两条核酸单链在一定 条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子。
1、DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素的作用下，核酸双链分
• 核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA 或RNA片段上带上可检测的标记，可用 来检测样品中未知的核酸序列。
影响核酸分子杂交的因素
① 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越 高，复性速度越快。但双链探针浓度过 高会增加自我复性而影响杂交；浓度过 高也会增加非特异结合，使杂交背景增 强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越 高，配对难度也增大。
洗去未杂交探针 ↓
杂交信号检测
限制性酶切割 DNA分子
限制片段 琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA
至膜上（尼龙膜或 硝酸纤维素滤膜）
凝胶
滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
Southern 印迹杂交
杂交、显影
Southern 印迹杂交
Southern 印迹杂交
Southern 印迹杂交Leabharlann 5、核酸的储存DNA：
①溶于pH8.0的TE（tris和EDTA）缓冲液中， 4 ℃或-20 ℃保存；
②长期保存样品中可加入1滴氯仿。
RNA：
①溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70 ℃保存;
②溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液 中，-20 ℃保存。或加1滴0.2 mol/L VRC( 氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃。
↓←
核酸酶S1（专一降解未杂交 的DNA和RNA单链）
酶解
↓
杂交体系纯化
↓
脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳
↓
放射自显影
待测RNA样品
↓ ← 单链RNA探针
液相杂交
↓
RNA-RNA杂交双链
↓←
RNA酶（专一降解未 杂交的RNA单链）
酶解
↓
杂交体系纯化
↓
脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳
↓
放射自显影
第三节 PCR技术
聚合酶链式反应： 在引物指导下由 酶催化的对特定 克隆或基因组 DNA序列进行的 体外扩增反应。
常用的探针标记物： 放射性同位素（3H、32P、35S、125I）；
非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根 过氧化酶、碱性磷酸酶等）。
三、核酸分子杂交信号的检测
➢放射性同位素标记探针： 放射自显影。
➢非放射性同位素标记探针： 偶联反应+显色反应。
四、核酸分子杂交技术
➢固相杂交：结合于某种固相支持物上的待 测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂 交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。
Western印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并
染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗 原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴 别滤膜上的蛋白质。
斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
适于核酸样品定量检测。
（二）原位杂交
用标记的已知核酸序列为探针，使其与 细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法 称为原位杂交。
2 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺
解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。 高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合 物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽 提的步骤。
适用于从标本中制备高分子量的DNA样 品--可得200kb左右的DNA。
3 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙
子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双 链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结 构被破坏，形成单链分子的过程。 常用的变性方法： ①热变性；②酸碱变性；③化学试剂变性
2、DNA的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性DNA的两条互补链
可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，
此过程称为退火(annealing)。
3、解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环境温度。
增色效应： DNA变性后对 260nm紫外光 收增加的现象。
减色效应： 变性DNA复性 后对260nm紫 外光吸收减少 的现象。
影响复性的因素
二、基因组DNA的分离与纯化
（一）样品准备 • 常见的标本：血液、尿液、唾液、组
织、培养细胞、细菌等。 • 生物组织：最好新鲜组织，若不能马
上提取，应贮存－70℃或液氮中。
（二）DNA提取
1、酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细
胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚 或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇 进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。
② 离子强度：高离子强度溶液中，有利于 杂交分子形成。
③ 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进 行杂交。
④ 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯 酸可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而 加速杂交反应。
⑤ 杂交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸杂 交的Tm。含30%—50%甲酰胺的杂交温度能 降低到30—42℃。较低的杂交温度，使探 针更稳定，并能更好地保留非共价结合的 核酸。
原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、 RNA-RNA杂交。
取材 ↓
组织、细胞固定 ↓
预杂交 ↓
杂交 ↓
放射自显影或免疫酶法显色 ↓
观察结果
菌落杂交法
（三）液相杂交
1. RNA酶保护分析法 2. 核酸酶S1保护分析法
待测RNA样品
↓ ←单链DNA探针（M13体系合成）
液相杂交
↓
DNA-RNA杂交双链
（四）DNA的浓缩
1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋 外敷PEG至合适量。
2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到 正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重 复几次可显著减少DNA体积。
（六）DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率，去除回
收DNA样品中的污染物。 电泳到DEAE-纤维素膜：500bp-5kb的DNA片 段回收率较好，纯度高。但不适用于分子 量超过10kb和单链DNA。 透析袋电洗脱： 低熔点琼脂糖凝胶：有机溶剂提取法、玻 璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。
Northern 杂交
原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分 离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经 过杂交，分析mRNA的大小及含量。
应用：半定量分析mRNA的含量；确定 mRNA分子的大小。
方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量 →变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂 交→洗膜→压片→洗片→图像分析
PCR反应的特点
➢ 特异性强：引物与模板结合的特异性及 聚合酶的忠实性。