耐吉非替尼的肺癌细胞株的建立及其耐药机制研究
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耐吉非替尼的肺癌细胞株的建立及其耐药机制研究
[摘要]目的：探讨耐吉非替尼的肺癌细胞珠的建立及其耐药机制研究。
方法：本次研究取吉非替尼加入到人肺癌细胞系PC9培养条件中培养直至耐药情况产生，回顾相关特点及耐药机制。
结果：应用0.5μmol·L-1吉非替尼向普通PC9细胞的培养基中持续加入，行3个月的培养后，再加入吉非替尼不再引起细胞死亡，获得耐药的细胞株（PC9-IR）。
用同等浓度的吉非替层对敏感和耐药的细胞行72h处理，在5μmol·L-1下具体PC9-IR对吉非替尼仍缺乏一定敏感性，而在吉非替尼具体浓度在0.5μmol·L-1时，显著抑制了敏感PC9细胞生长。
耐药细胞0.5μmol·L-1生长率为98%，敏感细胞为35%，差异有统计学意义（P<0.05）。
异鼠李素（美国ChromaDex公司）对PBMNCs细胞和PC9细胞增殖作用显示，100μmol·L-1浓度下第1d的生长率为39%，远低于5μmol·L-1第1d 86%的生长率，差异有统计学意义（P<0.05）。
于6个孔板中接种PC9-IR，每孔存在100个细胞，健康志愿者培养应用正常培养基，试验组选择异鼠李素40μmol·L-1加入，培养10d，共重复3次，可见异鼠李素明显抑制PC9-IR细胞的克隆形成能力，有明显差异性（P<0.05）。
结论：通过建立耐吉非替尼的肺癌细胞株，对其耐药机制进行分析，并选择PI3K-AKt类药物治疗，可显著改善预后，提高患者生存质量。
关键词：吉非替尼；肺癌；细胞株；耐药机制
临床肿瘤常见类型中，肺癌占有较高发生比例，其中以非小细胞肺癌最为多见[1]。
吉非替尼为治疗晚期肺癌的药物，是一种酪氨酸激酶（表皮生长因子受体，ECFR）选择性抑制药[2]。
但药物使用过程中有耐药情况存在，寻找耐药后联合用药及替代用药方案，是临床重点关注的问题，本次研究取吉非替尼加入到人肺癌细胞系PC9培养条件中培养直至耐药情况产生，回顾肺癌细胞株的建立及其耐药机制，现将相关内容报告如下。
1 资料与方法
1．1 一般资料常规准备人肺癌细胞系PC9，10%胎牛血清培养剂，达尔伯希必需基本培养基。
取二甲亚砜（DMEM）配制储备液（10mmol·L-1），工作浓度采用DMEM配制，为10μmol·L-1，异鼠李素用DMSO配制成20mmol·L-1。
1．2 方法首先行药物诱导细胞耐药，用浓度为超过半数致死量的吉非替尼（0.5μmol·L-1）购自英国TORICS公司，对原始的PC9细胞进行处理，液体每3日更换1次，并取相同浓度的吉非替尼在换液时继续加入，选择磷酸盐缓冲液仔细清洗悬浮的死亡细胞，实施持续培养操作直至细胞出现无药物性死亡。
充分检测细胞增殖情况，将细胞以每孔5×103接种在孔板上，孔板共96个，放置二氧化碳培养箱中培养，调整箱温度为37。
C，设定实验时间，给予噻唑蓝（MTT）溶液购自美国CST公司，加入行4h孵育，将含MTT的培养基弃去，每孔给予DMSO各100μL加入，在摇床上放置并振荡，使结晶完全溶解，对吸光度（A）值在490nm波长处测量，每个浓度梯度设置5个复孔，共行3次试验。
行克隆分析，细胞消化后采取计数板计数，于6孔板上接种，细胞在每孔为100个，采用培养基培养，培养液每3d换一次，行10d培养后，用4%多聚甲醛固定后将细胞结晶紫色，于倒置显微镜下加以观察，>30个细胞行一个克隆。
行蛋白质印迹检测，用NP-40lysis buffer制备蛋白样品，冰上行10min裂解后于温度为4。
C下行10min离心，蛋白浓度采用BCA法测定，制备10%的SDS-PAGE凝胶并点样。
孵育后行电化学发光检测，并应CELL成像仪对图像进行获取。
分离并培养外周血单个核细胞（PBMNCs）。
具体方法为5ml健康志愿者（对照组）的肝素化静脉血，离心，用60%密度将得到的细胞于培养板上种植，并用培养机完成培养操作。
1．3 统计学分析统计学软件采用SPSS13.0版，计量资料行t检验，计数资料行X2检验，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
应用0.5μmol·L-1吉非替尼向普通PC9细胞的培养基中持续加入，行3个月的培养后，再加入吉非替尼不再引起细胞死亡，获得耐药的细胞株（PC9-IR）。
用同等浓度的吉非替层对敏感和耐药的细胞行72h处理，在5μmol·L-1下具体PC9-IR对吉非替尼仍缺乏一定敏感性，而在吉非替尼具体浓度在0.5μmol·L-1时，显著抑制了敏感PC9细胞生长。
耐药细胞0. 5μmol·L-1生长率为98%，敏感细胞为35%，差异有统计学意义（P<0.05）。
异鼠李素对PB MNCs细胞和PC9细胞增殖作用显示，100μmol·L-1浓度下第1d的生长率为39%，远低于5μmol·L-1第1d 86%的生长率，差异有统计学意义（P<0.05）。
于6个孔板中接种PC9-IR，每孔存在100个细胞，健康志愿者培养应用正常培养基，试验组选择异鼠李素40μmol·L-1加入，培养10d，共重复3次，可见异鼠李素明显抑制PC9-IR细胞的克隆形成能力，有明显差异性（P<0.05）。
见表1。
表1 两组PC9-IR细胞克隆数比较（x±s，个）
实验组600 6.01±3.43*
对照组600 30.17±5.75
t - -4.176
P 0.05
3 讨论
依据本次试验显示，先制成耐吉非替尼相关的人肺癌细胞株（PC9-IR），完成后再行异鼠李素完成后续处理操作[3]。
结果显示，结果显示，采用异鼠李素时可显著抑制PC9-IR 细胞生长，异鼠李素有较小细胞毒性。
以往有研究表明，肿瘤细胞的生长信号通路可被异鼠李素明显抑制，且对PI3K-Akt的途径造成影响，故应用Western blot法无成各项检测操作，在具体药物浓度为40μmol/L·L-1时，在PC9-IR细胞中相关AKt473位的磷酸化水平已被明显抑制，表明异鼠李素可对PI3K产生影响的情况下对肿瘤细胞的生长起到抑制效果。
40μmol/L·L-1浓度在持续10d作用后，明显抑制了PC9-IR的克隆形成能力[4]。
细胞生长中PI3K-AKt信号通路作用显著，可对细胞的应激反应、糖代谢及相关细胞周期产生影响。
肿瘤细胞中PI3K信号通路被过度激活，故肿瘤治疗中此通路为重要靶点，众多研究显示，肿瘤细胞的PI3K-AKt通路采用黄酮类药物治疗可被抑制，将细胞于C2/M期阻滞，进而抑制肿瘤生长。
ECFR参与介导的PI3K、MAPK等信号通路的激活在肺癌细胞生长中发挥着重要作用，吉非替尼对EGFR进行抑制进而起到显著的治疗肺癌的效果，但EGFR随即的突变，降低了药物的疗效，EGFR突变后生长信号向下游的PI3K-AKt通路传递，造成继发性耐药[5]。
应用PI3K抑制剂对吉非替尼耐药的肺癌可发挥治疗作用，而异鼠李素即为PI3K抑制剂的一种。
结合本次研究结果显示，与上述观点符合。
且癌细胞的生长依赖MAPK、PL3K等信号通路的激活，PI3K途径在下游通路中作用显著，吉非替尼对EGFR 抑制治疗肺癌作用明显，但EGFR突变时，易使吉非替层失去作用，变突的EGFR将生长信号向下PI3K-Akt通路传递，出现继发性耐药。
综上，通过建立耐吉非替尼的肺癌细胞株，对其耐药机制进行分析，并选择PI3K-AKt 类药物治疗，可显著改善预后，提高患者生存质量。
参考文献：
[1] 倪虹，杨茂，邹朝辉，等.新型小分子药物特异性抑制吉非替尼原发耐药肺癌的体内实验研究[J].中国肿瘤杂志，2011，38（10）：553-555.
[2] Mok T,Wu YL,Zhang L.A small step towards personalized medic ine for non-small cell lung cancer[J].Discov Med,2009,8(43):227-231.
[3] 王珊珊，刘明，刘英，等.MTT法测定多柔比星和氟尿嘧啶及顺铂对肝癌耐药细胞
Bel-7402/ADM的IC50值[J].医药导报，2010，29（5）：579-581.
[4] Wei X,Guo W,Wu S,et al.Inhibiting JNK dephosphorylation and induction of apoptosis by novel anticancer agent NSC-741909 in cancer cells[J].J Biol Chem,2009,284(25):16948-16955. [5] Y ang Y,Zhou J,Zhou X,et al.Discovery of chrysoeriol,a P13K-AKT-mTOR pathway inhibitor with potent antitumor activity against human multiple myeloma cells in vitro[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2010,30(6):734-740.。
