免疫组织化学技术(immunohistochemistry)

免疫组织化学技术（immunohistochemistry） 由于免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高及能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起的显著特点，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景。此方法经不断改进和发展已日趋成熟，应用范围逐渐扩大。目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。 一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围 （一） 免疫组织化学技术的基本原理 免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应，对组织和细胞中抗原的准确定位，使其可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察，并进行形态与功能相结合的研究。 （二）免疫组织化学技术的应用范围 近年来，随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是自70年代中期杂交瘤技术与单克隆抗体技术的引入，使制备的抗体具有高度的特异性。简便而敏感的免疫酶标技术能够用于普通培养细胞（株）、常规福尔马林固定石蜡包埋的组织切片、若干年前的存档标本等，从而使该技术在生物医学研究和临床病理学、微生物学诊断中，日益显示出巨大的实用价值。目前主要应用在如下几个方面： 1 确定细胞类型 通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞）光镜下不易辨认，但免疫组化标记（S-100蛋白等）能清楚显示其形态。 2 辨认细胞产物 利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。 3 了解分化程度 大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原（EMA）着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。 4 鉴定病变性质 通过标记Ig轻链（κ、λ）可区分部分B细胞性淋巴瘤与B细胞反应性增生，前者常表达单一的Ig轻链（κ+/λ+），后者常为多克隆Ig轻链（κ+、λ+）。而标记bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达bcl-2蛋白，而套细胞则表达。 5 发现微小转移灶 某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。 6 探讨肿瘤起源或分化表型 一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定其来源。 7 确定肿瘤分期 判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。 8 指导预后和治疗 免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类：①类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受体阳性者内分泌治疗效果较好，预后也较好。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。②肿瘤基因标记：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者预后较差；而nm23蛋白高度表达者，肿瘤转移率较低，预后较好。③细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体（EGFR）、增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67等，表达指数越高，表明其增殖越活跃，恶性度增高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67、 PCNA 、EGFR阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。 9 辅助疾病诊断和分类 人体的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等，可用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分泌功能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型；胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖素瘤等6种；恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面标志不同可分为T细胞性、B细胞性。肾小球肾炎的免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技术。 10 寻找感染病因 人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部位以及定量，如巨细胞病毒（CMV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、单纯疱疹病毒（HSV）、乙型肝炎病毒（HBV）等，已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。 二、 免疫组织化学技术细节处理总论 （一）标本的处理——细节注意 标本的处理是良好免疫细胞组织化学结果的前提，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存良好，抗原物质的抗原不丢失，不扩散或被破坏。标本的处理过程中应该注意以下两个方面：取材、固定。 1 取材 细胞标本取材可有印片法、穿刺吸取涂片法、体积沉淀涂片法、培养细胞标本取材及离心涂片机法。 1.1 印片法 主要应用于活检组织标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落细胞便粘附于玻片上，立即浸入细胞固定液内5~10分钟，取出后自然干燥，低温保存备用。 1.2 穿刺吸取涂片法 主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细胞针穿刺吸取病变区内液体成分，可直接涂抹在玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法，即将穿刺液滴入盛有1~2ml Hank（或RPMI-1640）液的试管内，轻轻搅拌，以500r/min低速离心5~10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（1×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂抹或用离心涂片机制成涂片，待涂片略干即可固定。 1.3 体积沉淀涂片法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，不宜加固定剂。根据标本内细胞数量多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上；②细胞数量少者，可将液体沉淀，然后取沉淀液以1500r/min离心10min，弃上清，将细胞涂片或用离心涂片制成涂片，略干后固定备用。 1.4 培养细胞标本取材 根据培养细胞特性分别采用不同的方法。对某些贴壁生长的细胞，只需将载玻片插入培养瓶内即可制备理想的细胞标本。而对于浮悬培养的细胞，可用离心涂片机制成涂片。 1.5 离心涂片机法 将待涂片的细胞样品成2×105~6/ml的细胞悬液，吸取50～100μl加入涂片机内，1000r/min离心2min后细胞就均匀地分布于玻片上。 制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤后，细胞黏附性降低，在免疫染色过程中易脱落，因此，在制片前载玻片上应涂黏附剂；②为节省试剂和便于观察，应将细胞集中在0.6~1cm2的圆圈内，细胞总数以105个为宜；③黏液丰富的标本，如痰液、胃液，未经特殊处理，一般不宜作免疫组织化学染色。 组织标本的取材常受各种因素的影响，应注意：①活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；②取材部位主要是病变区，但必须取病灶与正常组织交界区；③必要时取远距病灶区的正常组织作对照；④为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即处理或速冻进行冷冻切片，或立即用固定液固定，进行脱水、浸蜡、包埋。如不用迅速制片，也可贮于液氮或-70℃保存。 2 固定 固定在整个免疫组织化学技术中是关键所在。首先，通过固定可使细胞内蛋白质凝固，防止细胞内酶反应过程，防止细胞自溶，保持细胞固有形态和结构；其次，通过固定可以保存组织细胞的抗原性。固定不足，抗原会丢失；固定过度，则抗原性质改变或抗原成分被遮蔽。 2.1 固定液的选择 固定液的选择是免疫组化技术成功与否的基础。用于免疫组织化学技术的固定液种类较多，性能各不一样。不同抗原，其稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。所以，除要了解不同固定剂的特性外，不同的抗原和标本需经过反复试验，必要时可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。选择最佳固定液的标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构；②最大限度地保存抗原的免疫活性。中性缓冲多聚甲醛（或福尔马林）液是适应性较为广泛的固定液。值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。 2.2 固定时间因固定液而异 组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。 2.3 固定方法的选择 常用的固定方法有两种：浸入法和灌注法。浸入法即将组织浸泡在固定液内（必要时在4℃下），固定时间根据抗原的稳定性以及固定液的性质而定，一般在2-12h之间。灌注法主要适用于动物研究，灌注固定不仅可以使固定液迅速到达全身组织充分固定，而且灌注能冲洗掉红细胞，排除过氧化物酶的干扰。 2.4 固定时应注意 力求保持组织新鲜，勿使其干燥；组织块不宜过大过厚，以体积<2cm×1.5cm×0.3cm为宜，组织块厚度必须控制在0.3cm以内；固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中固定不良而影响效果；组织固定后，应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。 （二）切片方法-细节注意 1 切片方法的选择 光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。 1.1 冰冻切片 是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多，对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内， 进行短暂预固定干燥后贮存于低温。 1.2 石蜡切片 用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失；②组织块大小应＜2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡；浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低的软蜡较好。组织块脱水、透明和浸蜡时间可参考下表：