pcr技术介绍

ARMSPCR技术介绍

基因的变异类型有多种（点击查看），对应的分⼦检测⽅法亦有多种，当前资本市场驱动着分

⼦检测市场，并极⼒追捧NGS技术，因为其通量⾼，灵敏度⾼且性价⽐⾼。⼩编承认NGS是分

⼦检测的必然发展趋势，但是短时间内，NGS并不会取代其他分⼦检测⽅法，因为针对不同的

需求，都有对应的理想检测⽅法，每个检测平台都有着⾃⼰的优势，⽐如：

操作简单：PCR，ARMS-PCR，HRM等

时间快速：ARMS-PCR，HRM等

成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等

准确：Sanger等

通量⾼：NGS等

灵活性：Pyrosequencing等

结果分析简单：ARMS-PCR等

⾃动化：核酸提取等......

⼩编⼀直认为：没有最好的技术，只有最合适的技术！最好的，不⼀定是最合适的；最合适

的，才是真正最好的。

今天，我们聊⼀聊⼀直以来都⽐较⽕的ARMS-PCR技术，⾸先，我们先了解下什么是ARMS-PCR？

ARMS-PCR：扩增阻滞突变系统PCR（Amplification Refractory Mutation System

PCR，ARMS-PCR），⼜称为等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）。

ARMS-PCR技术建⽴在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的

3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进⾏延伸反应。常规PCR扩增DNA所⽤的上、下游

引物与靶序列完全匹配，⽽等位基因PCR采⽤等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷

酸不同，⼀个对野⽣型等位基因特异，另⼀个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作⽤

下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退⽕，不能⽣成PCR产物，⽽与模板匹配的引物体系

则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有⽆，从⽽确定SNP

基因型，⽬前市场主流为ARMS+qPCR技术，采⽤TaqMan探针进⾏检测。（⽐如肿瘤靶向⽤

PCR技术介绍

1、聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR），是一项在短时间内采用两引物大量扩

增特定的DNA片段的分子生物学技术。每个循环之后，模板量为原来的2倍。它可将极微

量的靶DNA特异地扩增上百万倍。极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵

敏度可以达到一个细胞甚至一个分子水平。

2、PCR扩增模式图

PCR反应的特点：高度特异性、高度敏感性、高丰度产量

3、PCR技术原理

循环次数DNA的链数121222243238102101024202201,048,576302301,073,741,82410亿

一、PCR的基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补

的寡核苷酸引物。PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成：

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经

PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，

引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、引物的延伸：DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原

料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半

保留复制链。

4、重复循环变性——退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种

新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

（一）普通PCR系统

1.PCR反应体系：DNA聚合酶DNA靶序列两端引物脱氧核苷酸dNTPs缓冲液

2.DNA的合成方向：5’→3’

3.TaqDNA聚合酶

4.PCR循环：变性退火

延伸

（二）PCR循环

第一步——变性（93~98℃）：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时

PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

3、引物内部不应出现互补序列。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

PCR技术的简单介绍

聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）是在体外酶促扩增特定DNA片段的技术，由美国Kary Mullis及其同事于1985年发明。热稳定性Taq DNA聚合酶的应用和自动化装置的发明与完善，使PCR技术进入实用阶段。该技术的发明和广泛应用，大大推动了分子生物学各相关学科的发展，发明者也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

随着PCR技术的成熟，派生了不少相关技术。这类技术具有敏感、特异、快速和简单等优势，在微生物检验中的应用越来越广，不少国家将其纳入检验的标准方法；我国检验检疫领域对其应用也日益扩大，国家要求市级以上疾病预防控制中心具有PCR检测技术能力，用于突发公共卫生事件的快速检测和食品安全的有效监管等。

PCR技术的基本原理和DNA在体内天然复制过程相似，是在体外重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新DNA链的过程，只是整个过程在体外进行，而且反应体系比体内更简单。

1．体系组成和基本过程

（1）体系组成

经典PCR以DNA为模板，体系组成包括原始模板、引物、原料、DNA聚合酶以及合适的盐、缓冲液以及温度循环参数等。原始模板是指长的双链DNA待扩增目的片段，微生物检验中往往是待测标本中的DNA。引物是两段单链寡核苷酸，其序列与待扩增片段的两端分别相同和互补。原料则是4种脱氧核苷三磷酸。

（2）基本过程 PCR基本过程分为变性、退火和延伸三个阶段，经过多次循环实现目的片段的扩增。

变性是指将反应体系混合物加热至93℃~95℃，维持较短的时间，一般30s，使待测的双链DNA在高温作用下变性，解链为2条单链DNA模板的过程。退火是指将反应体系混合物冷却至特定温度（也称退火温度）。延伸是指将反应体系的温度提高到72℃，在耐热DNA聚合酶作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为原料，按碱基配对原则，合成与两条模板DNA互补的2条新的DNA链。