细菌生长曲线测定生05 边晔 2010030026周四班同组成员：徐竞吴国梁夏川两位学弟实验时间 2012年11月29日一、实验目的1.了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时2.学习液体培养基的配制以及接种方法3.反复练习无菌操作技术4.了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同5.掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法二、实验原理将一定量的菌种接种在液体培养基内，在一定的条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性，如以细菌活菌数的对数做纵坐标，以培养时间做横坐标，可绘成一条曲线，称为生长曲线。
单细胞微生物发酵具有4个阶段，即调整期（迟滞期）、对数期（生长旺盛期）、平衡期（稳定期）、死亡期（衰亡期）。
生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的的全过程动态。
不同微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。
因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。
测定微生物生长曲线的方法很多，有血细胞计数法，平板菌落计数法，称重法和比浊法。
本实验才用比浊法，由于细胞悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的菌液的浓度。
将所测得的光密度值（OD600）与对应的培养时间做图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。
注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌和死菌，因此所测生长曲线的衰亡期不明显。
三、实验仪器、材料和用具大肠杆菌，枯草杆菌，金黄色葡萄球菌菌液及平板；培养基(100mL/250mL三角瓶X10瓶/大组)，牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基；取液器(5000ul, 1000ul 各一支)；培养箱，摇床，722s分光光度计；比色皿3个+共用参比杯一个。
四、实验步骤1.准备菌种（已做）：将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37℃振荡培养18h，另外准备单菌落平板各1块；2.接种，分成3小组做，实验结果共享：第（1）小组1)取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm2)取2.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm3)取4.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm第（2）小组4)取1.0ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm5)取1.0ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培养基，37 ℃ 110rpm6)取1.0ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培养基，30 ℃ 200rpm第（3）小组7)取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm8)取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 110rpm9)取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，30 ℃ 200rpm每培养一小时取样一次(2.5h,3.5h加测1次)。
对照组测量起始pH，所有瓶子测量发酵9h结束测pH。
注意全班同时取样，同时开始振荡，取样期间时间不算。
发酵时间7小时。
3.测量：取500ul培养液到2000ul自来水中，以自来水为对照，测OD600；注意固定参比杯和每个比色皿；固定取样器；固定波长；固定一台分光光度计；零小时也要测，把结果填入下表。
表1. 生长曲线OD600值123456789五、实验结果与讨论1.数据1)第一组a) 1.0ml大肠杆菌,37 ℃ 200rpmb) 2.0ml大肠杆菌,37 ℃ 200rpmc) 4.0ml大肠杆菌,37 ℃ 200rpm一个大肠杆菌菌落，37 ℃ 200rpm1.0ml大肠杆菌，37 ℃ 110rpm1.0ml大肠杆菌，30 ℃ 200rpm表2. 第一组生长曲线OD600值注：由于5:15-5:30没有开摇床，故往后顺延15min，下同。
2)第二组d) 1.0ml金黄色葡萄球菌，37 ℃ 200rpme) 1.0ml金黄色葡萄球菌，37 ℃ 110rpmf) 1.0ml金黄色葡萄球菌，30 ℃ 200rpm3)第三组g)一个大肠杆菌菌落，37 ℃ 200rpmh) 1.0ml大肠杆菌，37 ℃ 110rpmi) 1.0ml大肠杆菌，30 ℃ 200rpm4)pH2.OD曲线的绘制1)第一组a) 1.0ml大肠杆菌菌液,37 ℃ 200rpmb) 2.0ml大肠杆菌菌液,37 ℃ 200rpmc) 4.0ml大肠杆菌菌液,37 ℃ 200rpm图1 第一组生长曲线2)第二组d) 1.0ml金黄色葡萄球菌，37 ℃ 200rpme) 1.0ml金黄色葡萄球菌，37 ℃ 110rpmf) 1.0ml金黄色葡萄球菌，30 ℃ 200rpm图2 第二组生长曲线3)第三组g)一个大肠杆菌菌落，37 ℃ 200rpmh) 1.0ml大肠杆菌，37 ℃ 110rpmi) 1.0ml大肠杆菌，30 ℃ 200rpm图3 第三组生长曲线3.代时计算根据表2中的数据，做lgOD-t函数。
1)第一组图4 第一组lg(OD600)-t 曲线2)第二组图5 第二组lg(OD600)-t 曲线3)第三组图6 第三组lg(OD600)-t 曲线图4,5,6中取直线部分，用公式： G＝（t1-t2）/[(lgW1-lgW2)/lg2]来计算各瓶的代时。
计算结果见表7。
表7. 各发酵条件下的代时组号t1/h t2/h lgOD600 lgOD600 代时G/mina 1 2.5 -1.823909-0.82102327.01474b 1 2.5 -1.72125-0.7304927.34537c 1 2.5 -1.67778-0.7212528.32394d 2 4 -1.01323-0.3819557.22278e 2 3.5 -1.27572-0.6143940.96699f 2 3.5 -0.97469-0.3893446.28462g 2 3.5 -1.35655-0.5482133.51647h 1 3 -1.65758-0.3968628.65315i 1 4 -2.1549-0.3615130.21393由上表可以看出大肠杆菌代时短于金黄葡萄球菌，但是也有一些数据不太合理，比如说d 组，其数值与同一组相比差距很大，且不符合预期，这可能是由以下原因造成的：i.人为误差。
我们是分组实验，无论是取样稀释，还是测量OD600时，都存在个人操作上的差异，所以实验数据有一些随机波动。
尤其是在取样的过程中，吸取菌液的位置不同，会对结果产生较大影响。
ii.实验方法误差。
我们是采取隔一个小时或者半个小时测量一个点的OD值，没有实时监控，所以做出来的曲线会有差异。
另外，由于我们每隔一段时间就停止摇床，开始取样，这样干扰了细菌的生长，导致了生长周期的改变。
并且，使用OD值来代表菌体的量的改变误差比较大，死亡的菌体，培养基的变化等都会影响到样品的OD值，我们没有办法得到真实的细菌浓度。
另外本次实验有个重大的问题，就是有15分钟摇床没有开启，大约在2.5h的时候，而此时正是细菌生长最旺盛处于对数期的时候。
4.不同因素对于生长曲线的影响1)接种量图7 第一组生长曲线由图7可以看出，虽然三组几乎同时达到顶峰，但是c最先进入对数期，a最晚进入，说明接种量在一定范围内增大，能缩短延迟期。
2)菌液接种和固体平板接种图8 菌液与菌落接种大肠杆菌生长曲线由图8可以看出，菌落接种要比另外三组更晚进入对数期，将其数据与同样条件下的菌液接种（第一组实验结果）进行对比，发现菌落接种确实造成较长的延迟期。
这可能是因为大肠杆菌从固体培养基环境移动到溶液环境需要较长时间适应，而液体的接种只需要适应不同的培养基成分和浓度即可。
3)摇床转速图9 第二组生长曲线由图9可以看出，d(1ml金黄色葡萄球菌，37 ℃,200rpm)与e(1ml金黄色葡萄球菌，37 ℃,110rpm)相比仅转速不同，d较早进入对数期。
说明在一定范围内，提高转速，有利于细菌生长。
这是因为增加转速能提高溶氧量。
但是转速也有一定限度，转速过高，会使细胞破裂。
不过摇床不是离心机，应该问题不大。
4)温度由图9可以看出，d(1ml金黄色葡萄球菌，37 ℃,200rpm)与f(1ml金黄色葡萄球菌，30 ℃,200rpm)相比，d温度较高，但似乎要慢于f，但是差别不大。
可能是实验中有其它因素干扰。
但理论上讲，温度影响细菌细胞内酶的活性，会影响细菌的新陈代谢，一定范围内升高温度有助于尽快进入对数期。
不过也可能是因为30 ℃比37 ℃更接近于金黄色葡萄球菌的最适生长温度。
六、思考题1.为什么可用比浊法来表示细菌的相对生长状况？细胞悬液的浓度与混浊度成正比（lambert-beer公式）因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的菌液的浓度，从而在一定程度上反应细菌的相对生长状况。
但是需要注意的是吸光度所指示的为培养瓶内的菌体总含量，而非瓶内的活菌量，所以在生长曲线中并没有明显的死亡期。
2.生长曲线中为什么会有平衡期和死亡期？平衡期：由于本次实验所使用的培养环境为封闭式的培养环境，中间没有加料，所以随着营养物质的消耗，代谢产物的积累和pH等环境因素的变化，培养基内环境不再适于细菌的生长繁殖，从而导致细菌的净生长速率逐渐接近于零，单位时间内细菌二分裂增加的细胞数量接近于细菌死亡的细胞数量，从而使生长进入平衡期（总菌量基本不变）。
这时，死亡细胞数和繁殖细胞数处于平衡状态，细胞总数将处于稳定状态。
死亡期：平衡期后如果继续培养，细胞总数不再稳定，由于培养基中营养物质和氧气的消耗不利于细菌繁殖，并且细菌开始合成次级代谢产物，影响培养基的PH或者造成培养基的毒性等，对细菌的生存有害，死亡细胞数将逐渐增加，死亡速度超过繁殖速度，使进入死亡期。
3.什么条件下接种为宜？液体种子比固体种子有什么优越性？通过本次实验，我们可以看到，接种量、接种方式和培养条件（溶氧量和温度等）对细菌调整期的长短，细菌的代时即生长速度均有非常关键的影响。
只有在采取最佳接种方式和接种量，在该菌种最适条件下进行培养，才能使得细菌迅速渡过调整期，并快速进行生长繁殖。
最适宜的接种菌种应该是处在生长曲线的对数区的菌液。
此时细菌已经度过调整期，生长繁殖最为旺盛，生命力最强大，各种分解和合成代谢反应都被充分激活，对环境有最强的适应能力。
从实验结果可知，在细菌的最适温度、溶氧条件下，接种适当数量的对数期液态种子最好。
液体种子相比于固体种子，调整期短很多，可以快速进入对数期，工业生产周期短，设备利用效率高。
原因如下：液体种子所含细菌易于扩散和分布到培养基中，如采用固体种子，可能会使接种环上附着的菌体不能完全进入液体培养基中，而且固体种子在培养基中不宜均匀分散。
用液体种子向液体培养基中接种，特别是如果接种前后培养基的成分和培养条件一致，则细菌前后的生活环境基本相同，调整期很短，而固体种子接种则由于环境变化比较大，调整期较长。
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