甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用_刘戬丰
- 格式:pdf
- 大小:481.91 KB
- 文档页数:9
㊀山东农业科学㊀2024ꎬ56(1):164~173ShandongAgriculturalSciences㊀DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2024.01.022收稿日期:2023-03-27基金项目:国家重点研发计划项目(2022YFD1500602-1)ꎻ国家现代农业产业技术体系项目(CARS-06-14.5-B16)作者简介:王晓东(1996 )ꎬ男ꎬ研究实习员ꎬ主要从事高粱栽培与育种工作ꎮE-mail:1009124737@qq.com通信作者:肖继兵(1976 )ꎬ男ꎬ研究员ꎬ主要从事旱作农业研究ꎮE-mail:xiaojb2004@126.com高粱抗旱性研究进展王晓东ꎬ李俊志ꎬ窦爽ꎬ肖继兵ꎬ辛宗绪ꎬ吴宏生ꎬ朱晓东(辽宁省旱地农林研究所ꎬ辽宁朝阳㊀122000)㊀㊀摘要:干旱是限制植物生产力和威胁粮食安全的重要因素之一ꎮ高粱(SorghumbicolorL.Moench)是全球主粮和饲料作物ꎬ因其具有较强的抗旱性和能够在恶劣的环境条件下生存而广泛种植于干旱半干旱地区ꎬ在作物抗旱领域中具有重要的研究价值ꎮ深入解析干旱胁迫下高粱的形态和生理特性㊁鉴定和筛选抗旱品种㊁挖掘相关抗旱基因ꎬ对推动高粱抗旱育种进程㊁提高品种抗旱性㊁提高产量具有重要意义ꎮ本文从干旱胁迫对高粱生长的影响㊁高粱对干旱胁迫的生理响应㊁高粱耐旱性鉴定方法和鉴定指标㊁高粱抗旱性分子生物学和提高高粱抗旱性方法5个方面对高粱抗旱性研究进展进行综述ꎬ并对高粱抗旱性研究方向进行展望ꎬ以期为进一步研究高粱抗旱的形态㊁生理特性及分子机制奠定基础ꎮ关键词:高粱ꎻ干旱胁迫ꎻ生理响应ꎻ分子生物学ꎻ鉴定ꎻ抗旱性中图分类号:S514㊀㊀文献标识号:A㊀㊀文章编号:1001-4942(2024)01-0164-10ResearchProgressonDroughtResistanceofSorghumWangXiaodongꎬLiJunzhiꎬDouShuangꎬXiaoJibingꎬXinZongxuꎬWuHongshengꎬZhuXiaodong(LiaoningInstituteofAgriculture&ForestryinAridAreasꎬChaoyang122000ꎬChina)Abstract㊀Droughtisoneoftheimportantfactorsthatlimitplantproductivityandthreatenfoodsecurity.Asaglobalstaplefoodandforagecropꎬsorghum(SorghumbicolorL.Moench)hasgoodcharacteristicsindroughtresistancealongwithabilitiestosurviveinharshenvironmentsꎬandiswidelyplantedinaridandsemi ̄aridareasꎬwhichgiveitimportantresearchvaluesinthefieldofcropdroughtresistance.Itisofgreatsignifi ̄canceinacceleratingbreedingprocessofdrought ̄resistantvarietiesandincreasingdroughtresistanceandyieldofsorghumtofurtheranalyzethemorphologicalandphysiologicalcharacteristicsunderdroughtstressꎬidentifyandscreentheexcellentdrought ̄resistantvarietiesꎬanddigoutdrought ̄resistantgenes.Inthispaperꎬthere ̄searchprogressindroughtresistanceofsorghumwasreviewedfrominfluencesofdroughtstressonsorghumgrowthꎬphysiologicalresponsesofsorghumtodroughtstressꎬidentificationmethodsandindexesꎬmolecularbiologyꎬandimprovementmethodsꎬandtheprospectofresearchdirectionofdroughtresistanceinsorghumwasproposedꎬinordertolayafoundationforfurtherstudyofthemorphologicalandphysiologicalcharacteris ̄ticsandmolecularmechanismsofdroughtresistanceinsorghum.Keywords㊀SorghumꎻDroughtstressꎻPhysiologicalresponseꎻMolecularbiologyꎻIdentificationꎻDroughtresistance㊀㊀干旱是限制作物生产发展的最重要因素之一ꎬ有发生范围广㊁频次高㊁持续时间长等特点[1-2]ꎮ目前ꎬ世界上有三分之一以上总陆地面积的干旱和半干旱地区ꎬ我国现有干旱㊁半干旱和亚湿润干旱区近300万km2ꎬ占国土总面积近四成[3]ꎮ其中ꎬ绝大部分是因为缺乏灌溉条件而以雨养农业为主ꎬ其作物产量占全国总产量的比重较小ꎮ选育耐旱性强的作物品种是保证干旱地区高产稳产的重要举措ꎮ干旱可能会发生在作物生长发育的各个阶段ꎮ然而ꎬ在干旱和半干旱地区ꎬ作物生长季开始和结束时发生干旱的可能性较高ꎮ生长季节开始时的干旱胁迫严重影响植物的生长发育ꎮ如果干旱发生在作物开花期或灌浆期ꎬ可能会导致产量严重下降或歉收[4]ꎮ高粱(SorghumbicolorL.Moench)是禾本科一年生草本植物ꎬ主要种植于热带㊁亚热带和温带的干旱半干旱区ꎬ也是我国主要的杂粮作物之一ꎬ是重要的酿用㊁食用㊁饲用㊁帚用作物ꎬ同时也是全球仅次于水稻㊁玉米㊁小麦㊁大豆种植面积的第五大粮食作物ꎮ高粱具有很强的抗旱㊁耐涝㊁耐盐碱㊁耐瘠薄㊁耐高温等抗逆特性[5]ꎮ高粱不同品种间抗旱能力存在较大差异ꎮ近些年从多个方面开展了高粱抗旱性遗传和抗旱品种选育相关研究[6-7]ꎮ本文综述干旱胁迫对高粱生长的影响㊁高粱耐旱性鉴定方法和鉴定指标ꎬ以及高粱对干旱的生理响应ꎬ并从转录组分析㊁抗旱QTL定位和全基因组关联分析方面进行梳理和整合ꎬ并对高粱抗旱性的分子调控机制㊁鉴定体系及抗旱性品种选育进行展望ꎬ以期为后人开展相关研究提供理论参考ꎮ1㊀干旱胁迫对高粱生长的影响1.1㊀干旱胁迫对高粱种子萌发和幼苗生长的影响水分缺乏使植物发育迟缓ꎬ干旱胁迫达到一定阈值时ꎬ会显著抑制种子萌发和幼苗生长[8]ꎮ王志恒等[9]研究了高粱萌发阶段受干旱胁迫的响应特性ꎬ发现随着干旱胁迫程度的增加ꎬ高粱种子的发芽率㊁发芽势等显著降低ꎬ种子残留干重逐渐增加ꎬ干物质转移㊁转化效率逐渐下降ꎬ根冠比逐渐增大ꎬ比根重逐渐减小ꎮ长期干旱胁迫降低幼苗的苗高㊁叶长ꎬ幼苗地上部和根的鲜重不同程度的下降[10]ꎮ1.2㊀高粱萌发期及苗期的抗旱性研究大多数农作物在种子萌发㊁幼苗形成和开花阶段对干旱胁迫较为敏感ꎬ干旱胁迫下萌发期和苗期表现出耐旱性是作物生长发育的前提ꎮ对高粱萌发期和苗期耐旱性的研究发现ꎬ高粱萌发期和苗期的耐旱性是不一致的ꎮ张笑笑[11]对73份高粱品种进行萌发期和苗期耐旱性鉴定ꎬ初筛结果发现萌发期和苗期都抗旱的品种5份ꎬ苗期抗旱品种10份ꎬ田间和室内采用多重表型分析最终得到苗期抗旱品种1份ꎮ郝培彤等[12]在20%PEG干旱胁迫下评价21份饲草高粱材料的耐旱性ꎬ筛选出萌发期耐旱和苗期耐旱材料各3份ꎬ萌发期和苗期共同耐旱材料1份ꎮ由此可见ꎬ高粱品种萌发期和苗期耐旱性是不同的ꎬ萌发期耐旱品种苗期不一定耐旱ꎬ苗期耐旱品种萌发期也可能不耐旱ꎮ针对高粱萌发期和苗期耐旱性ꎬ许多学者是分开进行研究的ꎬ而在大田干旱生产条件下ꎬ种子从萌发阶段就已经受到干旱胁迫的影响ꎮ因此研究植物的耐旱性ꎬ应该从种子萌发到苗期进行不间断的干旱胁迫处理ꎬ这样可以更加全面地反映出植物在萌发期和苗期对干旱胁迫的各种反应ꎮ1.3㊀干旱胁迫对高粱光合作用的影响Zhang等[13]研究发现ꎬ在干旱胁迫处理后ꎬ高粱叶片叶绿素总含量及叶绿素a㊁叶绿素b含量降低ꎬ且叶绿素a的降低幅度显著大于叶绿素bꎮ干旱胁迫下叶绿素含量降低主要是由于叶绿素生物合成下降ꎬ从而导致叶绿素加速分解ꎮ植物进行光合作用时ꎬ要保证充足的光照ꎬ然而光照过强ꎬ会造成叶片吸收的光能超出同化所需ꎬ进而造成光抑制或者光破坏[14]ꎮ因此植物会通过植物激素㊁外源物质等来减缓由于光能过多引起的光抑制ꎬ促进光合活性ꎬ避免PSⅡ系统受到破坏[15]ꎮ张姣等[16]的研究表明ꎬ干旱胁迫下ꎬ高粱叶片的净光合速率(Pn)㊁气孔导度(Gs)㊁最大光化学效率(Fv/Fm)㊁光化学淬灭系数(qP)㊁电子传递速率(ETR)出现不同程度的下降ꎬ初始荧光(Fo)与对照组相比有所升高ꎬZhang等[13]也得出相同的结论ꎮ说明干旱胁迫会使光合相关酶活性丧失ꎬ导致光能过剩而产生积累ꎬ通过热耗散等途径消耗多余的光能ꎬ可以让作物适应干旱胁迫环境ꎮ干旱胁迫导致光合作用能力下降主要原因是非气孔限制[17]ꎮ王祁等[18]的研究还发现ꎬ在轻度干旱胁迫下ꎬ高粱叶片PSⅡ系统结构和功能损伤较小ꎬ然而在重度胁迫下ꎬ叶片PSⅡ系统遭到破坏ꎬ进而发生光抑制现象ꎮ光合作用的强弱可以直接反映出植物抵御干旱胁迫的能力ꎬ保证叶绿素含量的稳定㊁保护光合相关酶活性ꎬ可抵561㊀第1期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王晓东ꎬ等:高粱抗旱性研究进展御干旱胁迫对其光合作用的影响ꎮ2㊀高粱对干旱胁迫的生理响应2.1㊀有机渗透调节干旱胁迫下ꎬ植物细胞通过调节可溶性物质的浓度来维持细胞内外渗透压平衡ꎬ进而应对干旱胁迫带来的影响ꎮ参与渗透调节的物质可分为两类ꎬ第一类是外界环境提供的无机离子ꎬ第二类是胞内合成的有机溶质ꎮ第二类渗透调节物质主要包括甜菜碱㊁脯氨酸㊁糖和糖醇等有机化合物[19]ꎮ近些年来ꎬ可溶性蛋白㊁可溶性糖㊁脯氨酸等渗透调节物质被广泛研究ꎮ脯氨酸的积累可以使许多植物应对渗透胁迫反应ꎬ作为一种相容的渗透剂ꎬ其可以提高细胞或组织的保水能力ꎬ同时可以作为碳水化合物的来源ꎻ作为一种酶的保护剂ꎬ也可以减轻蛋白质变性ꎬ具有很强的抗氧化能力ꎮ张玉霞等[20]用聚乙二醇溶液模拟干旱胁迫ꎬ结果表明饲用高粱品种脯氨酸含量与对照组相比显著升高ꎮ王艳秋等[21]研究发现ꎬ干旱胁迫下高粱叶片的脯氨酸含量显著增加ꎬ且其显著性较大ꎬ是高粱调节适应干旱胁迫的重要指标ꎮ可见ꎬ脯氨酸在干旱胁迫下至关重要ꎬ但是也有不同观点:董喜存等[22]的研究发现ꎬ在不同程度干旱胁迫下ꎬ甜高粱品种叶片脯氨酸含量变化趋势并不一致ꎮ因此认为ꎬ单纯测定脯氨酸含量不能准确反映抗旱性ꎬ可以将其作为一种抗旱胁迫下的保护性反应ꎮ可溶性糖主要包括葡萄糖㊁蔗糖㊁果糖和半乳糖ꎮ可溶性糖既可以为植物生长发育提供能量ꎬ并且具有信号功能ꎬ又是植物生长发育的重要调节因子[23]ꎮ何玮等[24]研究不同干旱胁迫下甜高粱叶片可溶性糖含量的变化时发现ꎬ轻度干旱胁迫下可溶性糖含量先下降然后突然升高ꎬ再下降之后突然升到最高ꎻ在重度干旱胁迫下ꎬ可溶性糖含量先下降ꎬ然后升到最高ꎬ再下降ꎮ总体表明ꎬ在受到干旱胁迫时ꎬ高粱叶片可溶性糖含量整体呈升高趋势ꎮGill等[25]研究不同非生物胁迫下高粱可溶性糖含量变化的结果表明ꎬ干旱胁迫下总的可溶性糖含量呈升高趋势且高于对照ꎬ其中果糖含量始终高于葡萄糖和蔗糖ꎮ此外ꎬ在干旱胁迫下ꎬ可溶性糖还可以作为蛋白质渗透保护剂而发挥作用ꎮ可溶性蛋白含量的变化可以直接反映植物渗透调节能力的大小ꎬ它不仅可以提高细胞的保水能力ꎬ而且可以有效地保护生物膜以及细胞的生命物质ꎮ荣少英等[26]研究不同高粱品种在不同干旱条件下可溶性蛋白的变化时发现ꎬ甜高粱㊁普通高粱和对照相比可溶性蛋白含量随着干旱胁迫的加剧呈上升趋势ꎮ有研究[27-28]表明ꎬ在逆境胁迫下ꎬ膜质过氧化产物丙二醛抑制蛋白质的生物合成ꎻ长时间重度干旱使植物体内分解代谢加剧ꎬ导致大量可溶性蛋白分解ꎮ2.2㊀抗氧化防御系统活性氧具有很强的氧化能力ꎮ植物在进行有氧代谢的过程中会产生活性氧ꎬ低浓度的活性氧可以作为信号分子参与调控植物非生物胁迫反应[29-30]ꎮ抗氧化防御系统具有维持植物体内活性氧平衡的功能[31]ꎮ该系统包括两大类ꎬ一类是非酶促抗氧化物质ꎬ其中最为重要的是水溶性抗坏血酸(Asc)ꎬ其次是谷胱甘肽(GSH)ꎬ还有脂溶性生育酚㊁类胡萝卜素等ꎻ另一类是酶促抗氧化剂ꎬ包括超氧化物歧化酶(SOD)㊁过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)[32]ꎮ植物抗氧化调控系统中ꎬ提高酶活性和抗氧化物的表达量是作物抵御逆境胁迫的关键因素ꎮ陈敏菊等[33]研究发现ꎬ高粱幼苗叶片SOD和CAT活性因干旱胁迫的强度不同而存在差异ꎬ土壤含水量在55%~60%时SOD活性逐渐升高ꎬ随着干旱程度加剧ꎬSOD活性逐渐下降ꎻCAT活性在土壤含水量为40%~60%时高于对照ꎬ随着干旱加剧活性逐渐降低ꎻPOD活性的变化规律和SOD一致ꎮ这表明轻度干旱胁迫可以提高高粱幼苗叶片抗氧化酶活性ꎮ卢峰等[34]研究高粱幼苗不同生长阶段受到干旱胁迫时酶活性的变化情况表明ꎬ胁迫6㊁8㊁12㊁24d时SOD活性显著高于对照ꎬ干旱胁迫12d时酶活性达到峰值ꎬPOD活性的变化和SOD基本一致ꎮ说明高粱幼苗在受到干旱胁迫时ꎬ通过提高叶片保护酶活性来抵御其危害ꎮ2.3㊀激素调节植物激素参与干旱胁迫调节ꎮ通过外源激素来提高作物的抗旱性是现阶段重要的科学途径之一[35-36]ꎮ细胞分裂素通过促进细胞分裂ꎬ延缓植物叶片中叶绿素的降解来提高植物的抗旱性[37]ꎮ661山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第56卷㊀生长素可以正向调控四种抗氧化酶(SOD㊁CAT㊁POD㊁GR)活性来降低干旱胁迫对植株的抑制作用ꎻ同时生长素可以通过调节根生物量㊁增加根的分支来提高水分吸收效率进而提高抗旱性[38]ꎮ脱落酸(ABA)对植物在逆境胁迫下的应答起着关键作用ꎬ其参与气孔的开关ꎬ保卫细胞的通道活动ꎬ调节转录钙调蛋白的表达ꎬ诱导相关基因的表达[39]ꎮ植物在受到干旱胁迫时ꎬ也可以通过减少赤霉素的方式来适应胁迫环境[40]ꎮ关于干旱胁迫下植物激素调节机制ꎬ国内外对水稻㊁小麦等作物的报道较多ꎬ逆境胁迫下高粱中植物激素的作用机制还需进一步探讨和研究ꎮ高粱的抗旱性在生理上涉及到三个方面:第一是干旱胁迫下需要维持高的含水量ꎬ维持高粱水分平衡ꎬ通过增加脯氨酸㊁可溶性糖㊁可溶性蛋白质等物质含量提高渗透调节能力ꎬ维持细胞或者组织持水ꎬ进而维持膨压ꎻ第二是干旱胁迫下保证其基本的生理功能ꎬ通过激素调节㊁酶活性提高等来维持高粱正常的生理功能ꎻ第三是干旱胁迫解除时高粱含水量和生理功能的恢复能力ꎮ做好以上三点ꎬ可以有效地抵御干旱胁迫带来的负面影响ꎮ3㊀高粱耐旱性鉴定方法及鉴定指标因为各个时期的耐旱机制不同ꎬ一般将高粱耐旱性鉴定分为萌发期㊁苗期和全生育期鉴定ꎮ萌发期是作物在干旱胁迫条件下能否完成生长周期的关键时期[41]ꎬ对高粱群体结构和数量起着决定性作用ꎮ高粱萌发期抗旱性鉴定多采用聚乙二醇(PEG)㊁葡萄糖溶液等模拟干旱胁迫环境进行ꎬ通过种子发芽率㊁萌发抗旱指数等反映高粱的抗旱性ꎮ其中PEG-6000是目前被广泛应用的鉴定萌发期抗旱性较为理想的溶液ꎮ陈冰嬬等[41]使用15份保持系㊁18份恢复系和8份杂交种ꎬ通过PEG-6000水溶液模拟干旱胁迫环境ꎬ筛选出1份恢复系和1份保持系萌发期抗旱性亲本材料ꎻ通过抗旱性因子分析ꎬ认为萌发抗旱指数㊁根长和剩余干物质量可以作为高粱萌发期抗旱性筛选的鉴定指标ꎮ候文慧等[42]利用15%的聚乙二醇溶液进行干旱胁迫处理ꎬ采用隶属函数分析方法对8个饲用高粱萌发期抗旱性进行排序ꎬ得出SU9002为抗旱性最强的材料ꎬBJ0602为抗旱性最为敏感的材料ꎻ并利用主成分和聚类分析方法ꎬ对萌发期5个抗旱指标进行分析ꎬ结果表明ꎬ发芽指数和发芽率可以作为饲用高粱萌发期抗旱性评价的指标ꎮ采用聚乙二醇等高渗溶液不仅方法简单ꎬ而且排除了外界环境的干扰ꎬ可以获得更加准确的数据ꎬ有效地缩短了鉴定周期ꎬ提高鉴定效率ꎮ苗期是高粱整个生长发育阶段的关键时期之一ꎬ其生长好与坏直接影响着最终的产量和品质ꎬ因此ꎬ苗期抗旱性鉴定尤为重要ꎮ高粱苗期抗旱性鉴定方法可以分为三种ꎮ第一种较为常见的是使用PEG-6000溶液模拟干旱胁迫环境ꎮ赵晓倩[43]采用25%PEG-6000对259份高粱品种进行干旱胁迫处理ꎬ筛选出极抗旱品种14份㊁极敏感品种33份ꎬ并通过主成分分析方法对9个指标进行分析ꎬ结果表明ꎬ苗高㊁成活率㊁根冠比㊁根长和根鲜重可以作为评价高粱苗期抗旱性的指标ꎮ第二种是干旱复水法ꎬ是指在干旱胁迫后进行复水处理ꎬ用复水后的恢复能力指标评价高粱抗旱性ꎮ刘婷婷等[44]利用盆栽控水法对8个高粱品种幼苗进行干旱复水处理ꎬ通过研究生物量㊁水势㊁渗透式㊁光合参数等生理指标的变化情况来分析不同高粱品种的抗旱能力以及干旱适应能力和旱后复水恢复能力的关系ꎬ分析鉴定出了一份抗旱性强的品种辽杂21和旱后复水能力强的品种Moench.cv.Gadambaliaꎮ干旱胁迫时维持较高的叶片净光合速率和相对含水量有助于其提高干旱复水能力ꎬ因此ꎬ叶片净光合速率和相对含水量可以作为筛选高粱苗期抗旱性的生理指标ꎮ第三种是反复干旱法ꎬ是指通过高粱苗期连续两次干旱胁迫控水ꎬ以材料存活率为评价指标的一种鉴定方法ꎬ适用于大批量的品种鉴定ꎮ李舒凡[45]通过反复干旱法ꎬ对200份高粱品种进行苗期耐旱性鉴定ꎬ将叶片与根系的长势作为抗旱性的评价指标ꎬ能够从存活的质量上区别品种的抗旱性差异ꎬ进一步提高了筛选抗旱性品种的准确性ꎮ对高粱苗期抗旱性的鉴定只能反映出营养生长阶段的情况ꎬ需要结合生殖生长阶段的抗旱性ꎬ对不同品种抗旱能力进行综合评价ꎮ作物全生育期抗旱性鉴定对于抗旱新品种的选育㊁抗旱机制的研究以及抗旱基因的挖掘有着重要意义ꎬ共有两种鉴定方式ꎮ一种是通过人工761㊀第1期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王晓东ꎬ等:高粱抗旱性研究进展控制水分和环境ꎬ通过干旱棚㊁人工气候箱等模拟干旱环境ꎬ研究各个生育期干旱胁迫对籽粒产量和品质的影响ꎮ汪灿等[46]通过在干旱棚内设置两个处理对50份酒用高粱材料进行成株期抗旱性鉴定ꎬ测定了成株期8个农艺性状ꎬ筛选出两个成株期酒用高粱抗旱性强的品种粱丰141-3和粱丰247-3ꎻ通过主成分㊁灰色关联度分析ꎬ认为分蘖数㊁穗粒数和单株粒重可作为酒用糯高粱资源成株期抗旱性评价指标ꎮ另一种是自然环境法ꎬ设置干旱和水地两个处理ꎬ操作简便ꎬ没有设备的要求ꎬ测定的结果更具说服力ꎬ但受环境因素影响较大ꎬ需要多年的试验数据进行支撑ꎮ袁闯等[47]采用自然环境法ꎬ设置灌水和干旱两个处理ꎬ通过测定高粱成熟期株高㊁穗重㊁千粒重㊁产量等10个性状ꎬ对22份不同品系的甜高粱进行成熟期耐旱性鉴定ꎬ筛选出3份抗旱品种和2份抗旱敏感性品种ꎻ通过主成分分析和逐步线性回归分析ꎬ认为千粒重㊁单株粒重㊁穗粒数和穗茎粗可以作为甜高粱成熟期抗旱性的评价指标ꎮ现阶段ꎬ高粱各抗旱指标评价鉴定基本都是局限于某一个时期ꎬ因此ꎬ需要综合高粱生长发育每个时期的指标来进行综合分析ꎬ建立综合指标评价体系ꎬ以提高高粱品种抗旱性鉴定的可靠性和真实性ꎮ4㊀高粱抗旱性分子生物学研究现阶段ꎬ国内外对于高粱抗旱性鉴定㊁抗旱生理生化以及干旱对农艺性状影响的研究已趋于完善ꎬ并且对于以基因为基础的转基因和分子标记技术也广泛应用到抗旱性分子遗传研究领域ꎬ通过转录组分析㊁QTL定位和全基因组关联分析(GWAS)构建分子遗传图谱ꎬ挖掘抗旱相关基因是高粱抗旱性分子遗传研究的发展方向ꎮ4.1㊀转录组分析转录组分析对于研究未知基因功能和特定调节基因的作用机制起着关键作用[48]ꎮ近年来新一代的转录组测序技术(RNA-seq)应运而生ꎬ它可以研究作物在干旱胁迫下的基因表达模式㊁分析抗旱分子机制㊁确定候选基因并进行功能注释[49]ꎮDugas等[50]通过渗透胁迫和脱落酸对高粱植物的转录组进行了分析ꎬ利用转录组测序技术揭示高粱的抗旱机制和基因筛选ꎮZhang等[51]使用转录组测序方法对干旱胁迫下高粱的叶和根进行转录组分析ꎬ鉴定出了差异表达基因ꎬ通过富集(GO)分析出耐旱性相关转录因子ꎮ王志恒等[52]用PEG-6000对甜高粱进行干旱胁迫ꎬ对高粱幼苗进行转录组测序分析并建立包含cDNA的文库ꎬ对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG分析ꎬ发现有两个代谢通路与干旱胁迫响应相关ꎬ这两个通路都属于遗传信息代谢通路ꎮ表明甜高粱通过激活与干旱胁迫相关的蛋白表达和与碳水化合物相关的基因表达而增强渗透调节能力来响应干旱胁迫ꎮXu等[53]对两个抗旱性不同的高粱品种进行转录组分析ꎬ运用转录组测序技术确定了候选基因并进行了基因功能注释ꎬ分析了代谢通路ꎮ转录组测序技术促进了基因功能和表达水平的研究ꎬ通过分析干旱胁迫下基因的表达网络和富集通路ꎬ挖掘相关的新基因ꎬ可为今后进一步揭示干旱胁迫调节机制提供理论支撑ꎮ4.2㊀抗旱基因QTL定位植物的抗旱性是受多基因控制的数量性状ꎬ遗传复杂ꎮ干旱对作物的影响程度变化较大ꎬ常规育种方法费时㊁费力ꎬ难以选育优质的抗旱品种ꎮ随着分子生物学的发展ꎬQTL分析被广泛应用到分子遗传领域ꎮ赵辉[54]利用籽粒高粱654和甜高粱LTR108组成244个RIL群体ꎬ并构建了分子遗传连锁图谱ꎬ利用QTL定位分析耐旱性相关性状ꎬ分别在1㊁4㊁6㊁7染色体上检测出3㊁1㊁1㊁3个与抗旱系数相关的QTLs位点ꎬ并且在LG-1㊁LG-6㊁LG-7上定位到5个影响株高的QTLsꎮHaussmann等[55]用IS9830和N13与E36-1分别构建226个RIL群体ꎬ通过构建遗传图谱ꎬ发现标记分别位于10个连锁群和12连锁群中ꎬ利用复合区间作图检测到的3个性状的QTL数量在5个到8个之间ꎬ解释了31%和42%的遗传变异ꎮSakhi等[56]对107份孕穗期的高粱材料进行干旱胁迫处理ꎬ使用10条染色体上98个SSR标记位点的基因型数据对23对性状进行关联分析ꎬ鉴定出9个QTL与8个抗旱性状相关ꎮ持绿性是高粱干旱胁迫耐受性的一个组成部分ꎮSukumaran等[57]对Tx436(非持绿性)和00MN7645(持绿性)构建重组自交系进行遗传定位ꎬ利用全基因组单标记扫描和复合区间影射互补方法ꎬ检测到了15个与抗旱性状相关的QTLꎻ在1号染色体上发现了籽粒产量QTLꎬ解释了8%~16%的表型变异ꎬ861山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第56卷㊀在第2㊁6㊁9号染色体上发现了开花时间QTLꎬ解释了6%~11%的表型变异ꎬ在3㊁4号染色体上发现了持绿性QTLꎬ解释了8%~24%的表型变异ꎮ有关高粱QTL定位的研究可为后续高粱抗旱基因的精细定位㊁挖掘抗旱性相关基因和分析抗旱性机理奠定基础ꎮ4.3㊀全基因组关联分析(GWAS)GWAS是对多个个体在全基因组范围内进行遗传标记多态性检测ꎬ将基因型和表型进行关联并应用到寻找遗传图谱和挖掘性状相关候选基因的一种方法ꎮ近年来ꎬ为解析高粱抗旱性的遗传基础ꎬXin等[58]研究354份甜高粱在两种不同干旱处理下的株高性状ꎬ并将基于株高的平均生产力㊁干旱指数和胁迫耐受指数作为表型数据ꎬ结合甜高粱再测序获得的6186个SNPsꎬ使用三种不同的数量性状遗传模型进行GWAS分析ꎬ结果表明ꎬ在GLM㊁MLM和FarmCPU下分别检测到49㊁5个和25个耐旱相关的遗传位点ꎬ发现2个耐干旱的候选基因ꎬ其中ꎬSb08g019720.1基因与Athali ̄anaEFMTF基因同源ꎬ而Sb01g037050.1基因与玉米bZIPTF基因同源ꎮ高奇[59]用401份甜高粱材料进行干旱胁迫处理ꎬ并通过三个与干旱相关的性状筛选出耐旱评价指标并作为表型数据ꎬ利用高粱全基因组SNP标记ꎬ对三个性状耐旱指数进行全基因组关联分析ꎬ检测到两个株高性状基因可能是耐旱候选基因ꎮ赵晓倩[43]对259份高粱的7个苗期耐旱性相关性状进行全基因组关联分析ꎬ检测到102个显著的SNP位点ꎬ筛选出7个抗旱候选基因ꎮ通过全基因组关联分析揭示耐旱候选基因可为后续基因功能验证和高粱耐旱分子机制研究奠定基础ꎮ5㊀提高高粱抗旱性的方法5.1㊀传统育种方法传统的育种方法包括杂交育种㊁回交育种㊁系统选育㊁混合选育等ꎬ其中较为常见的是杂交育种ꎮ杨伟等[60]通过母本不育系7501A和父本恢复系RHMC386进行组配杂交ꎬ选育出优质抗旱高粱新品种潞杂9号ꎮ杨婷婷等[61]研究发现ꎬ以不育系SX605A为母本㊁以恢复系SX870为父本杂交育成高粱品种晋杂31号ꎮ其选育过程中ꎬ亲本都是通过杂交再连续多代自交得到的稳定品种ꎬ都具有很强的抗旱性ꎬ通过该方法可以提高选育品种的抗旱性ꎮ李继洪等[62]同样用不育系亲凡A为母本㊁以恢复系苏丹草黑壳3号为父本杂交选育出抗性强的品种吉草3号ꎮ由此可见ꎬ选育抗旱性强的不育系和恢复系是提高高粱杂交种耐旱性的重要途径ꎮ5.2㊀施加外源物质通过对高粱施加外源营养元素㊁生长调节剂以及进行种子引发等都可以提高其抗旱性ꎮAhmed等[63]发现硅营养对高粱的生长和生理参数有显著影响ꎬ通过在干旱胁迫条件下对高粱进行施加硅营养处理ꎬ可以提高耐旱基因型品种(系)的叶片水势㊁叶面积指数㊁蒸腾速率和SPAD值ꎬ同时在硅处理下净同化和相对生长量表现出最大值ꎮ张瑞栋等[64]分别用聚乙二醇(PEG)㊁KCl㊁CaCl2和水杨酸(SA)对高粱种子进行引发处理ꎬ显示其可以促进干旱胁迫下种子萌发率ꎬ促进胚根和胚芽的伸长ꎮ其原因可能是引发处理提高了胚芽内抗氧化酶活性ꎬ同时促进糖代谢ꎬ增加脯氨酸含量ꎬ解决了干旱胁迫下发芽率低㊁胚根胚芽生长受抑制的问题ꎬ进而提高高粱萌发期的抗旱性ꎮTounekti等[65]的研究也得到一致的结果ꎮKamali等[66]研究发现ꎬ使用固氮菌和丛枝菌根真菌(AMF)的高粱比不使用的受干旱胁迫程度较轻ꎬ固氮菌和丛枝菌根真菌可以减少高粱电解质渗漏和丙二醛含量ꎬ通过提高花青素㊁类胡萝卜素㊁黄酮㊁生长素(IAA)等物质含量和抗氧化酶活性来缓解干旱胁迫的影响ꎮKamali等[67]同时也发现细菌和丛枝菌根真菌也可以通过增加光合色素㊁可溶性蛋白等物质含量提高高粱渗透调节能力ꎬ继而应对干旱胁迫环境ꎮShehab等[68]研究发现ꎬ脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)可以减轻干旱胁迫引起的负面效应ꎬ降低干旱胁迫下高粱中氰化氢(HCN)的含量ꎮ植物生长调节剂(PGRs)改善高粱抗旱性归因于可溶性蛋白㊁丙二醛㊁活性氧㊁过氧化氢等的积累减少ꎬ光合参数的改善以及抗氧化酶活性的变化ꎬ进而提高其抗旱能力ꎬ特别在甜高粱中尤为明显ꎮ5.3㊀转基因方法植物抗旱性是受多基因控制的数量性状ꎬ其中包括参与调控植物活性氧㊁可溶性糖㊁抗氧化酶㊁叶绿素和ABA信号转导等生理生化过程的基961㊀第1期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王晓东ꎬ等:高粱抗旱性研究进展。
第41卷第3期2005年5月林业科学SCIE NTI A SI LVAE SI NIC AE V ol 141,N o 13May ,2005PMI/甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用3杨 莉 徐昌杰 陈昆松(浙江大学园艺系农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 杭州310029)摘 要: 介绍了一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法———磷酸甘露糖异构酶(P MI )法,与传统筛选体系不同,它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选。
P MI 能将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸,使转化细胞以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长;非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长。
该筛选体系受基因型、培养基中其他糖和磷酸根离子浓度及培养条件等因素的影响。
目前已应用于多种模式植物和经济作物的转基因筛选,在木本植物甜橙上也首获成功。
其检测方法多样,除了常规转基因检测方法外,还可对酶活性进行检测,其中氯酚红法简单可靠,且无需昂贵试剂。
安全评估结果表明P MI 基因对人体健康和环境无害。
P MI/甘露糖筛选体系有望成为植物转基因的又一有效筛选手段。
关键词: 磷酸甘露糖异构酶(P MI )基因;甘露糖;植物;转基因中图分类号:S718146;Q94312 文献标识码:A 文章编号:1001-7488(2005)03-0137-05收稿日期:2003-12-09。
基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)项目(G 2000046806),国家自然科学基金(30100125)和浙江省自然科学基金(301291,Z D0004)资助。
3陈昆松为通讯作者。
Application of PMI /Mannose Selective System in Plant G enetic T ransformationY ang Li Xu Changjie Chen K unsong(Department o f Horticulture ,Zhejiang Univer sity The State Agriculture Ministry Laboratory o fHorticultural Plant G rowth ,Development &Biotechnology Hangzhou 310029)Abstract : A novel selective system ideal for plant trans formation was introduced.The system uses E scherichia coli phosphomannose isomerase (PMI )gene as the selectable marker gene and mannose as the selective agent.PMI is an enzyme catalyzing the conversion of mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate ;the latter can be further metabolized in glycolysis.T rans formed cells can grow normally utilizing mannose as carbon source ,while non-trans formed cells cannot because of non-metabolizable nature of mannose-6-phosphate.The trans formation frequency was affected by genotypes ,sugars other than mannose ,concentrations of phosphate and culture conditions.The system has been evaluated in w oody plants ,sweet orange and grape ,as well as in annual crops and is regarded to be an ideal replacement for traditional antibiotic or herbicide selective systems.Besides general methods for detecting transgenic plants ,plants trans formed with PMI gene can be assayed by enzyme activity analyses.Especially ,the chlorophenol red (CPR )method for PMI activity analysis is sim ple ,reliable ,and need no expensive reagents.The plants trans formed with PMI gene were dem onstrated to be safe to human health and environment.All the results indicate that PMI is an effective selective marker for plant trans formation.K ey w ords : phosphomannose isomerase (PMI )gene ;mannose ;plant ;genetic trans formation1983年首例转基因作物的问世为人们提供了一种新的育种方法,可将有益基因转入植物而不会改变原有品种的优良性状。
㊀南京农业大学学报㊀2021ꎬ44(2):208-216http://nauxb.njau.edu.cn㊀JournalofNanjingAgriculturalUniversityDOI:10.7685/jnau.202010034收稿日期:2020-10-29基金项目:国家自然科学基金项目(32070027ꎬ32000101ꎬ31700054)ꎻ江苏省现代农业面上项目(BE2020340)ꎻ中国博士后科学基金项目(2020M671513)作者简介:李周坤ꎬ副研究员ꎬE ̄mail:zkl@njau.edu.cnꎮ∗通信作者:崔中利ꎬ教授ꎬ研究方向为环境微生物学ꎬE ̄mail:czl@njau.edu.cnꎮ李周坤ꎬ叶现丰ꎬ杨帆ꎬ等.黏细菌捕食生物学研究进展及其在农业领域的应用潜力[J].南京农业大学学报ꎬ2021ꎬ44(2):208-216.LIZhoukunꎬYEXianfengꎬYANGFanꎬetal.Thepredationbiologyofmyxobacteriaanditsapplicationinagriculturalfield[J].JournalofNanjingAgri ̄culturalUniversityꎬ2021ꎬ44(2):208-216.特约综述黏细菌捕食生物学研究进展及其在农业领域的应用潜力李周坤1ꎬ叶现丰1ꎬ杨帆1ꎬ黄彦1ꎬ范加勤2ꎬ王辉4ꎬ崔中利1ꎬ3∗(1.南京农业大学生命科学学院/农业农村部农业环境微生物重点实验室ꎬ江苏南京210095ꎻ2.南京农业大学植物保护学院ꎬ江苏南京210095ꎻ3.南京农业大学作物免疫学重点实验室ꎬ江苏南京210095ꎻ4.中国科学院南京土壤研究所土壤环境与污染修复重点实验室ꎬ江苏南京210008)摘要:黏细菌(myxobacteria)是一类具有多细胞群体行为特征的捕食性微生物类群ꎬ能够以活的微生物细胞或者其他生物大分子作为食物获取营养ꎬ同时能够形成抗逆性强的子实体和黏孢子ꎬ从而使黏细菌具有良好的环境适应性ꎮ黏细菌对于植物病原真菌和细菌的捕食特性使其在植物病害防治方面具有重要的应用潜力ꎬ被视为是新的生防微生物类型ꎮ本文综述黏细菌对于微生物的捕食机制以及捕食行为的生态学功能ꎬ概述捕食性黏细菌作为一种新型的生防微生物在病害防治方面的应用潜力ꎮ在此基础上ꎬ也讨论目前黏细菌捕食生物学研究存在的问题ꎬ旨在为黏细菌捕食作用的深入研究及其在农业生产上的实际应用提供参考ꎮ关键词:黏细菌ꎻ捕食性微生物ꎻ生防微生物ꎻ植物病害防治中图分类号:Q939.96㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀文章编号:1000-2030(2021)02-0208-09ThepredationbiologyofmyxobacteriaanditsapplicationinagriculturalfieldLIZhoukun1ꎬYEXianfeng1ꎬYANGFan1ꎬHUANGYan1ꎬFANJiaqin2ꎬWANGHui4ꎬCUIZhongli1ꎬ3∗(1.CollegeofLifeScience/KeyLaboratoryofAgriculturalEnvironmentalMicrobiologyꎬMinistryofAgricultureandRuralAffairsꎬNanjingAgriculturalUniversityꎬNanjing210095ꎬChinaꎻ2.CollegeofPlantProtectionꎬNanjingAgriculturalUniversityꎬNanjing210095ꎬChinaꎻ3.KeyLaboratoryofPlantImmunityꎬNanjingAgriculturalUniversityꎬNanjing210095ꎬChinaꎻ4.KeyLaboratoryofSoilEnvironmentandPollutionRemediationꎬInstituteofSoilScienceꎬChineseAcademyofSciencesꎬNanjing210008ꎬChina)Abstract:MyxobacteriaareGram ̄negativebacteriaubiquitousdetectedinsoilenvironment.Theyarehighlysocialmicrobeswithacomplexmulticellularpopulationbehaviorwhichareassociatedwithfeedingonabroadrangeofsoilbacteriaandfungitoachievenutri ̄tion.Theformationoffruitingbodyandmyxosporesfromvegetativecellsdifferentiationthatrespondstostarvationmaymakemyxobac ̄teriaexcellentadaptationinnaturalenvironment.Myxobacteriaareversatilepredatorsthatpreyonmicrobesasexcellentcandidatesforbiologicalcontrolagents(BCAs).Hereꎬwediscussedthemechanismsandecologicalfunctionsoftheubiquitousandaccomplishedgeneralistpredatorꎬandthebiocontrolpotentialofplantdiseaseusingmyxobacteriawasalsosummarized.Onthisbasisꎬthefuturechal ̄lengesfortheinvestigationofpredatorymyxobacteriaincontrollingplantpathogenswereprovidedꎬwhichmightprovideinsightsforthepracticalapplicationofmyxobacteriainagriculturalfield.Keywords:myxobacteriaꎻpredatorymicrobesꎻbiologicalcontrolagentsꎻbiocontrolofplantdisease植物病害是制约农作物优质高产的重要因素之一ꎬ据统计全球主要农作物的病害损失约占作物总产量的20%~40%ꎬ每年直接经济损失高达数十亿美元[1-2]ꎬ其中70%~80%的病害是病原真菌所致[3-4]ꎮ至2050年全球粮食产量需要增加70%以满足日益增长的人口需求ꎬ令人担忧的是自2000年以来ꎬ新的真菌类型或者真菌类植物病原菌(fungal ̄likeplantpathogen)呈现逐年增加的趋势[5]ꎬ粮食生产安全问题越来越受到关注ꎬ已成为最重要的国际问题之一[6]ꎮ902㊀第2期李周坤ꎬ等:黏细菌捕食生物学研究进展及其在农业领域的应用潜力目前ꎬ农业生产上的植物病害主要以化学防治为主ꎬ而过度依赖和滥用化学农药产生了有害生物抗药性㊁农药残留超标㊁环境污染等一系列问题ꎬ严重影响我国农业的绿色可持续发展[7]ꎮ为了避免过度依赖化学农药的农业病害防治现状ꎬ近年来利用微生物的抗菌㊁植物免疫调节以及根际或叶际微生物组调控作用ꎬ阻止病原菌入侵植物已成为有效策略[8-10]ꎮ生防微生物的抗菌方式具有多样性ꎬ目前ꎬ受到关注比较多的生防微生物主要来自于假单胞菌(Pseudomonas)㊁芽胞杆菌(Bacillus)㊁伯克氏菌(Burkholderia)㊁溶杆菌(Lysobacter)㊁木霉(Trichoderma)和腐霉(Pythium)等属[11-12]ꎬ其中以枯草芽胞杆菌㊁哈茨木霉和寡雄腐霉等为代表的生防菌已被开发成商业化微生物菌剂ꎬ应用于农业生产的病害控制ꎬ其主要作用机制包括拮抗作用㊁竞争作用㊁诱导植物系统抗性等ꎬ且孢子形成特性使其在菌剂长效保存和土壤生存方面具有一定的优势ꎮ生防微生物进入环境中受到环境因子的多变性[13]㊁植物与微生物互作过程中的免疫识别[14]以及植物根际调控[15]等因素的影响ꎬ生防微生物在开放环境中难以定殖且防治效果不稳定ꎬ导致生物菌剂的实际应用受到一定程度的限制ꎮ在自然生态系统中ꎬ存在着大量不同类型的生物体ꎬ这些生物个体之间为争夺养分和空间形成了复杂的生态网络结构ꎮ捕食是生物体之间广泛存在的一种相互作用模式ꎬ是构建生态系统群落结构和维持生物多样性的关键过程[16]ꎮ目前ꎬ捕食性微生物包括吸血球菌(Vampirococcus)㊁蛭弧菌(Bdellovibrio)㊁噬菌弧菌(Bacteriovorax)㊁Micavibrio㊁Daptobacter㊁拟杆菌(Bacteroidetes)和黏细菌(myxobacteria)等[17-18]ꎮ其中ꎬ蛭弧菌能够直接入侵细胞周质空间实现对革兰氏阴性细菌的捕食ꎬ被广泛应用于养殖产业中改善水质和治疗水生动物细菌性疾病等方面[19]ꎮ此外ꎬ研究人员发现Micavibrioaeruginosavorus可通过黏附到细菌的细胞壁上ꎬ掠夺它们的养分来维持自身的生存和繁殖ꎬ研究成果为治疗多种传染性疾病提供了依据ꎬ从而减缓了微生物耐药性问题[20]ꎮ利用微生物的捕食作用能实现对病原微生物的控制ꎬ为农业病害防治提供策略ꎮ黏细菌是一类具有多细胞群体行为特征的革兰氏阴性细菌ꎬ可以捕食包括细菌和真菌在内的多种微生物ꎬ存在于土壤㊁树皮㊁朽木㊁动物粪便㊁地衣和昆虫等不同类型的环境中[21]ꎮ黏细菌具有超大的基因组(大约10Mb)ꎬ能形成类似真菌的不同形态的子实体结构ꎬ被称为 高等原核生物 ꎮ该类群大多具有复杂的生活史和生长代谢调控过程以及较强的环境适应能力[22]ꎮ然而ꎬ黏细菌作为一类具有捕食特性的新型生防微生物ꎬ其在农业生产过程中植物病害控制方面的应用并未引起太多的关注ꎮ本文综述黏细菌对于微生物的捕食策略㊁抗菌机制㊁捕食的生态学功能等方面的研究进展ꎬ评估捕食性黏细菌在病害防治方面的应用潜力ꎮ同时ꎬ讨论目前黏细菌对于微生物的捕食研究方面所存在的问题及其应对策略ꎬ为黏细菌应用于农业生产过程的病害控制提供理论依据和策略ꎮ1㊀黏细菌是一类通才型(generalistpredator)的微生物捕食者捕食性微生物分布广泛ꎬ在5个门(Proteobacteria㊁Chloroflexi㊁Cytophagaceae㊁Actinobacteria和Nanoar ̄chaeota)中的15个科均发现了捕食性细菌ꎬ包括寄生于硬蜱属的立克次氏体(Rickettsia)等[23]ꎮ除细菌外ꎬ真菌中也存在具有捕食能力的类群ꎬ如Arthrobotrys等可以捕食线虫和一些微生物[24]ꎮ微生物的捕食作用可能是通才型的(generalistpredator)ꎬ如黏细菌ꎬ对不同类型的细菌和真菌均具有捕食作用[25-26]ꎻ也可能是专性的(obligatepredator)ꎬ如蛭弧菌ꎬ通过侵入革兰氏阴性细菌的周质空间进而实现对猎物细胞的分解[27]ꎮ然而ꎬ黏细菌和蛭弧菌都可以在固体界面上滑行运动实现捕食ꎬ但是所涉及的分子机制是相互独立的[28]ꎮ对于黏细菌的捕食研究开展的较早[29]ꎬ其捕食作用与已报道的几种捕食性微生物的作用方式不同ꎮ相对于以盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)为代表的细胞吞噬作用㊁蛭弧菌(Bdellovibriobac ̄teriovorus)为代表的胞质入侵作用㊁溶杆菌(Lysobacter)为代表的分泌扩散性抗菌物质以及腐生螺旋体属(Saprospira)为代表的通过黏性物质捕捉猎物(Ixotrophy)等方式[30]ꎬ黏细菌利用一种特殊的胞外猎杀机制入侵猎物菌落ꎮ黏细菌的捕食策略类型分为:1)直接攻击模式(frontalattack)ꎮ黏细菌细胞间相互合作形成直接攻击模式ꎬ如黏细菌Myxococcussp.BS对软腐果胶杆菌等病原细菌的捕食作用[26]ꎮ2)狼群围捕攻击模式(wolfpackattack)ꎮ黄色黏球菌(Myxococcusxanthus)DZ2对苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)AK21的捕食过程中ꎬ由于菌株AK21产生大量的胞外半乳葡聚糖抵御捕食ꎬ因此黏细菌DZ2采取一种先围捕后猎杀的方式实现对猎物的捕食[31]ꎮ3)孤立捕食模式(solitarypredation)ꎮ通常认为黏细菌通过类似群体狩猎南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第44卷的策略捕食猎物[30]ꎬ然而研究者也发现黏细菌单个细胞的孤立捕食也能实现对猎物细胞的猎杀[32-34]ꎮ基于自然环境中可获取资源的局限性ꎬ多样化的捕食策略有助于黏细菌类群在环境中的适应能力ꎮ2㊀捕食性黏细菌(predator)与猎物(prey)之间的多重博弈关系目前ꎬ关于黏细菌捕食作用的研究主要集中在细菌捕食方面ꎬ包括黏细菌产生的次级代谢物㊁裂解酶㊁外膜囊泡(OMVs)等[30ꎬ35-36]ꎬ其中次级代谢物的抗菌活性被认为在黏细菌捕食过程中发挥着重要的作用[37-38]ꎬ而外膜囊泡被认为是黏细菌攻击猎物的短距离 运输机 [39]ꎮ此外ꎬ黏细菌分泌的蛋白酶或肽酶㊁溶菌酶等裂解酶可能参与黏细菌的捕食作用[30ꎬ40]ꎬ但到目前为止并无直接的证据ꎮ在黏细菌捕食大肠杆菌的研究中ꎬ转录组学分析发现上千个基因响应捕食过程ꎬ同时推测猎物细胞壁和蛋白质是黏细菌攻击的首要目标[41]ꎮ与对细菌的捕食研究相比ꎬ黏细菌对真菌的捕食研究较少ꎬ仅涉及具有抗真菌活性的几丁质酶㊁β-1ꎬ3-葡聚糖酶等细胞壁裂解酶[42-44]以及抗真菌活性的次级代谢物[45]等ꎮ在细菌与真菌互作关系研究中ꎬ伯克霍尔德菌和沙雷氏菌分别进化出三型分泌系统(T3SS)和六型分泌系统(T6SS)ꎬ将毒性蛋白直接注入真菌细胞内实现对真菌的猎杀[46-47]ꎮ与之不同的是ꎬ黏细菌通过分泌一种新型外膜型β-1ꎬ6-葡聚糖酶分解真菌细胞壁中的β-1ꎬ6-葡聚糖组分ꎬ进而实现对植物病原真菌的捕食(图1)[48]ꎮ目前具有酶活性的外膜蛋白主要包括膜结合蛋白酶或酯酶等[49-50]ꎬ黏细菌来源的外膜型β-1ꎬ6-葡聚糖酶是目前已报道的唯一具有糖苷水解酶活性的外膜蛋白ꎬ具有广谱的抗真菌活性ꎬ是黏细菌捕食真菌的关键因子[48]ꎮ图1㊀黏细菌与猎物细胞之间的捕食与防御策略Fig 1㊀Theattack ̄defensemodelbetweenpredatorymyxobacteriaandprey捕食性黏细菌通过多种模式攻击猎物以获取营养并建立竞争优势ꎬ而猎物群体面对捕食者的攻击进化出相应的防御策略抵御微生物的捕食ꎬ从而实现种群的自我保护(图1)ꎮ猎物抵御黏细菌捕食的防御策略类型主要分为:1)产生抑菌物质ꎮ黏细菌可以分泌抗生素杀死猎物ꎬ而猎物也可以分泌抗菌物质抑制黏细菌的生长ꎮ在黄色黏球菌(M.xanthus)DK1622与天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M45的互作研究中ꎬ链霉菌M45通过气生菌丝和抗菌物质抵御黏细菌的捕食[18]ꎬ在黏细菌与芽胞杆菌的互作研究中也有类似的抑制作用报道[51]ꎮ此外ꎬ真菌也能够产生具有生物活性的次级代谢物ꎬ如青霉菌产生的抗生素能够抑制炭疽杆菌的生长[52]ꎬ具有抑制黏细菌生长的可能ꎮ2)形成外围屏障ꎮ枯草芽胞杆菌(Bacillus012112㊀第2期李周坤ꎬ等:黏细菌捕食生物学研究进展及其在农业领域的应用潜力subtilis)NCIB3610和大肠杆菌与黄色黏球菌(M.xanthus)DK1622的互作研究中ꎬ芽胞杆菌和大肠杆菌作为猎物类群通过产生胞外基质和生物膜抵御黏细菌的入侵[53-54]ꎻ根瘤菌利用分泌的胞外半乳葡聚糖保护细胞免受黏细菌的攻击[31]ꎮ3)修饰捕食因子结构ꎮ黏细菌捕食细菌的一个重要武器是抗生素myxovirescin(TA)ꎬ地衣芽胞杆菌通过分泌糖基转移酶(YjiC)对黏细菌分泌的抗生素TA进行葡萄糖糖基化修饰ꎬ减弱其对自身细胞的毒性ꎬ进而逃脱黏细菌的捕食[55](图1)ꎮ4)共进化ꎮ地衣芽胞杆菌在黏细菌的捕食压力下进化出对抗生素TA的修饰能力[55]ꎻ在黏细菌与大肠杆菌共进化研究中发现ꎬ大肠杆菌通过增加黏液量降低黏细菌的运动速度ꎬ同时通过突变自身的毒力蛋白-外膜蛋白酶(OmpT)以适应捕食的压力ꎬ而黏细菌则通过突变1个未知的eatB基因从而增强对细菌捕食的适应性[56]ꎮ5)改变细胞壁结构组成ꎮ黏细菌通过分泌抗菌蛋白β-1ꎬ6-葡聚糖酶实现对真菌的猎杀ꎬ然而粗糙脉孢菌等微生物细胞壁不含β-1ꎬ6-葡聚糖ꎬ进而避免了黏细菌的捕食[48ꎬ57]ꎮ6)其他类型ꎮ改变猎物细胞表面成分与细胞形态(如丝状细胞)和增加游动速度等也能够保护猎物逃避捕食[58]ꎮ3㊀黏细菌捕食行为在土壤菌群生态调控中的功能微生物群落中的捕食涉及原生生物㊁噬菌体以及具有捕食能力的细菌和真菌等[59]ꎮ黏细菌作为微生物食物网结构中的捕食者ꎬ在土壤微生物食物网中代谢活跃ꎬ在土壤生态系统碳循环中起着关键作用[60]ꎮ土壤中黏细菌占总细菌群落的比例为0.4%~4.5%ꎬ几乎包含了所有黏细菌科或属ꎬ因此ꎬ黏细菌被认为是土壤细菌群落的重要组成部分[61]ꎮ此外ꎬ黏细菌在农田土壤环境中与捕食性细菌存在显著的正相关性ꎬ推测其在农田土壤细菌群落调控方面具有重要的作用[62]ꎮ尽管黏细菌广泛分布ꎬ并且在微生物生态调控中发挥着重要的作用ꎬ但对具体的影响或控制机制的研究并不统一ꎮ研究者在开展土壤微生物与植物互作关系研究中发现ꎬ黏细菌Corallococcussp.EGB能够对植物根际分泌物中麦芽糖和麦芽糖醇具有较强的趋化作用ꎬ使黏细菌向根部定向迁移并定殖ꎮ由于黏细菌EGB对包括尖孢镰刀菌在内的多种植物病原真菌和细菌均表现良好的捕食作用[25ꎬ48]ꎬ在向根部迁移的过程中ꎬ黏细菌通过捕食作用调控土壤微生物群落结构ꎮ其中ꎬBacillus和Pseudomonas等潜在的病害生防菌以及植物促生菌(PGPR)等丰度上升ꎬ尖孢镰刀菌黄瓜专化型(F.oxysporumf.sp.cucumerinumꎬFOC)数量明显下降ꎬ从而抑制病害的发生[63]ꎮ研究结果为利用捕食性黏细菌调控土壤微生物菌落进而实现植物病害的控制提供了新思路ꎬ同时也暗示着捕食性微生物作为土壤食物网的重要组成部分[64]ꎬ在微生物生态系统动态过程调控中起着重要的作用ꎮ4㊀捕食性黏细菌在植物病害控制方面的应用潜力研究发现来源于不同种属的黏细菌菌株对不同类型的植物病原菌均表现良好的抗菌活性[38ꎬ65-66]ꎬ在植物病害生物防治方面表现出潜在的应用价值ꎮ盆栽试验中ꎬ黏细菌对病原细菌㊁真菌和卵菌等造成的植物病害具有良好的生防效果ꎬ表现出较好的土壤定殖能力ꎬ从而保护植物免受病原菌的危害[25ꎬ63ꎬ67-68]ꎮ此外ꎬ在水果采后病害控制方面ꎬ黏细菌Corallococcussp.EGB产生的多种挥发性抗真菌次级代谢物(VOC)ꎬ能够有效抑制青霉菌对橘子的侵染[69]ꎬ延长水果采后货架期(图2)ꎮ基于黏细菌潜在的生防效果ꎬ研究者进一步开展了田间试验ꎮ黏细菌SorangiumcellulosumKYC3262在辣椒炭疽病的防控试验中连续3年表现出稳定的生防效果ꎬ防控效率与化学杀菌剂相当[70]ꎮ黏细菌Corallococcussp.EGB在连续2年的黄瓜和香蕉枯萎病田间防控试验中也表现出良好的生防效果ꎬ并优于化学药剂处理ꎬ显著提高作物产量[63] (图2)ꎮ与目前已报道的生防微生物相比ꎬ黏细菌在植物病害控制方面具有显著的特点:1)能在固体表面滑行运动ꎮ黏细菌利用2种不同类型的运动系统(A运动:AdventurousmotilityꎻS运动:Socialmotility)实现在固体界面的滑行运动[71]ꎬ降低微生物对土壤水分的要求[72]ꎬ而土壤水分含量是生防微生物在土壤中运动的限制因素之一[13]ꎮ2)产生丰富的抗菌物质ꎮ从黏细菌中已经发现了大量具有抗菌活性的次级代谢产物和酶类[43ꎬ73-74]ꎬ是原核生物中仅次于放线菌的第二大次级代谢物来源菌ꎮ3)发育形成抗性黏孢子ꎮ黏细菌是革兰氏阴性细菌ꎬ但可以分化或诱导分化形成具有抗逆性的孢子[75]ꎬ有利于生防菌剂的研发和保存ꎮ4)环境适应性强ꎮ黏细菌广泛分布于土壤㊁水体㊁腐败的树木枯枝落叶㊁草食类动物的粪便等不同的环境ꎬ具有较强的环境适应力[76-77]ꎮ5)能通过多样化的策略捕食真菌和细菌[30ꎬ78]ꎮ黏细菌通才型的南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第44卷图2㊀黏细菌Corallococcussp.EGB在植物真菌病害控制方面的应用性评估Fig 2㊀ApplicationevaluationofofCorallococcussp.EGBinthebiocontrolofplantfungaldisease㊀㊀a.黏细菌利用挥发性抗菌物质(VOC)抑制气传性植物病原菌的生长[69](VOC:抑制灰霉病菌对橘子的侵染)ꎻb.黏细菌通过捕食和土壤微生物调控作用控制土传枯萎病害的发生[63](捕食与调控:抑制黄瓜枯萎病菌对黄瓜的侵染)ꎮa.Biocidaleffectsofvolatileorganiccompounds(VOC)producedbythemyxobacteriaagainstfungalphytopathogens[69]ꎻb.Predationandmicrobialcommunityregulationofmyxobacteriaareinvolvedinthecontrolofsoil ̄borneFusariumwilt[63].捕食特性㊁良好的环境适应性㊁土壤微生物群落调控能力ꎬ使其被视为是一类新型的生防微生物ꎬ可应用于农业生产过程中植物病害的生防控制ꎮ除了在植物病害生物防治方面ꎬ黏细菌在动物病害控制方面也表现一定的应用潜力ꎮ研究人员发现包含不同种属的113株黏细菌对多种动物致病菌均具有高效的捕食作用ꎬ包括肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)㊁奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)㊁白色念珠菌(Candidaalbicans)㊁肠球菌(Enterococcus)㊁葡萄球菌(Staphylococcus)等[79]ꎮ此外ꎬ黏细菌分泌的具有生物活性的次级代谢物在保护动物健康方面也具有应用潜力ꎬ如S.cellulosum来源的Ambruticin等可以有效抑制多种动物致病菌的生长ꎻ来源于Myxococcusstipitatus的Rhizopodin㊁S cellulosum的Epothilone被认为在抗肿瘤方面具有重要的作用[35ꎬ80]ꎮ黏细菌通过捕食作用和次级代谢物的抗菌作用使其在致病性微生物引起的动物病害控制方面也具有一定的应用潜力ꎮ然而ꎬ目前黏细菌在病害防控中的作用还未引起足够的关注和重视ꎮ5㊀捕食性黏细菌在植物病害控制方面所面临的问题目前ꎬ捕食性黏细菌通过多种模式对植物病原菌进行捕食或者抑制ꎬ在病害控制方面具有良好的应用潜力ꎬ然而黏细菌捕食生物学研究中还存在一些瓶颈直接制约黏细菌的实际应用ꎮ例如:1)黏细菌捕食行为的复杂性ꎮ目前对于黏细菌的捕食相关研究多数集中在行为特征的描述等方面ꎬ已确定的黏细菌捕食因子只有抗生素TA和外膜型β-1ꎬ6-葡聚糖水解酶等ꎬ而黏细菌在捕食过程中降解酶与代谢调控㊁互作关键因子㊁感知与猎物响应㊁细胞依赖㊁群体捕食效率等方面的机制未知ꎬ限制了研究者对黏细菌捕食行为的深入了解ꎮ2)黏细菌生长与营养需求的特殊性ꎮ黏细菌特殊的生长发育方式导致黏细菌的分离周期长ꎬ且可培养性黏细菌资源有限ꎬ我国只有山东大学㊁广东省微生物研究所㊁内蒙古大学㊁河北大学等在黏细菌菌种资源收集方面建立了良好的基础ꎮ同时ꎬ黏细菌生长聚集成团和丰富的胞外多糖等特性使野生型黏细菌的遗传操作难以建立ꎬ具有优良特性的野生型黏细菌的作用机制研究存在瓶颈ꎮ此外ꎬ黏细菌生长过程中的自溶特性也导致扩大培养黏细菌受限ꎬ直接限制了黏细菌的实际应用和菌剂的规模化制备ꎮ3)研究材料的单一性ꎮ目前对于黏细菌的基础研究主要是以黄色黏球菌(M.xanthus)DK1622为材料ꎬ然而黏细菌与植物㊁微生物共进化过程中ꎬ不同种属之间的特性差异较大ꎬ如黄色黏球菌DK1622分泌的次级代谢物具有良好的抗菌作用ꎬ而黏细菌EGB主要是通过分泌真菌细胞壁裂解酶实现对真菌的抗性作212312㊀第2期李周坤ꎬ等:黏细菌捕食生物学研究进展及其在农业领域的应用潜力用ꎬ研究材料的单一性直接导致黏细菌捕食研究的进展较为缓慢ꎮ6 研究展望目前ꎬ黏细菌的基础研究主要是以黏细菌为模式生物ꎬ开展发育生物学㊁种群识别㊁进化生物学以及生态学等研究ꎬ包括黏细菌子实体的形成㊁运动性ꎬ多糖的生物合成ꎬ多形态细胞表面受体蛋白TraA(poly ̄morphiccellsurfacereceptor)及其互作蛋白TraB(cohortprotein)依赖的外膜融合参与黏细菌细胞识别的作用以及生物多样性等[81-82]ꎮ此外ꎬ以黏细菌为种质资源库ꎬ分离筛选一系列具有生物活性的次级代谢物ꎬ黏细菌已成为重要的生物活性物质来源菌[83]ꎮ黏细菌早在1941年就被报道具有捕食细菌的能力ꎬ然而黏细菌是如何完成对细菌和真菌的捕食这一关键科学问题至今未知ꎮ因此ꎬ解析黏细菌的捕食机制是未来黏细菌研究的重要方向ꎮ黏细菌在自然环境中分布广泛ꎬ具有较高的丰度ꎬ然而已分离培养的黏细菌资源依然较少ꎮ广东省微生物研究所科研人员利用病原菌作为被捕食菌构建了直接面向生物防治用途的黏细菌筛选模型[38]ꎬ为未来黏细菌分离方法的优化提供了方向ꎮ同时ꎬ2010年启动的地球微生物组计划(EarthMicrobiomeProject)ꎬ也为获取不同黏细菌的基因组信息ꎬ构建基因资源库提供了可能ꎮ此外ꎬ野生型黏细菌的分子生物学研究体系对于黏细菌研究的深入开展至关重要ꎮ研究者前期发现黏细菌细胞分散性㊁胞外多糖(exopolysaccharideꎬEPS)㊁限制-修饰系统(restriction ̄modificationsystemꎬR ̄Msystem)以及分泌系统等在黏细菌转化过程中起着重要的作用[84]ꎮ突破黏细菌胞外多糖的物理屏障ꎬ强化黏细菌生长过程细胞分散性ꎬ建立高效的遗传转化体系对于深入了解黏细菌的抗菌机制具有重要的作用ꎮ因此ꎬ为了促进捕食性黏细菌在农业生产过程中的实际应用ꎬ需要深入了解黏细菌捕食的作用机制和生态学功能ꎬ通过基因组学和培养组学等方法获取具有良好抗菌活性的优良菌株ꎻ利用代谢组学㊁蛋白和转录组学等鉴定参与黏细菌捕食行为的关键因子ꎬ系统解析黏细菌的捕食和代谢调控机制ꎻ结合微生物学㊁生态学㊁植物保护等多学科交叉阐明捕食性黏细菌在自然环境中的生态学功能以及与植物㊁土壤微生物菌群之间的互作关系ꎻ同时ꎬ建立和优化黏细菌规模化培养工艺ꎬ为黏细菌的实际应用提供依据ꎮ参考文献References:[1]㊀SavarySꎬWillocquetLꎬPethybridgeSJꎬetal.Theglobalburdenofpathogensandpestsonmajorfoodcrops[J].NatureEcology&Evolutionꎬ2019ꎬ3(3):430-439.[2]SavarySꎬFickeAꎬAubertotJNꎬetal.Croplossesduetodiseasesandtheirimplicationsforglobalfoodproductionlossesandfoodsecurity[J].FoodSecurityꎬ2012ꎬ4(4):519-537.[3]康振生.我国植物真菌病害的研究现状及发展策略[J].植物保护ꎬ2010ꎬ36(3):9-12.KangZS.CurrentstatusanddevelopmentstrategyforresearchonplantfungaldiseasesinChina[J].PlantProtectionꎬ2010ꎬ36(3):9-12(inChinesewithEnglishabstract).[4]CasadevallA.Fungaldiseasesinthe21stcentury:thenearandfarhorizons[J].Pathogens&Immunityꎬ2018ꎬ3(2):183-196. [5]FisherMCꎬHenkDAꎬBriggsCJꎬetal.Emergingfungalthreatstoanimalꎬplantandecosystemhealth[J].Natureꎬ2012ꎬ484(7393):186-194.[6]KeinanAꎬClarkAG.Recentexplosivehumanpopulationgrowthhasresultedinanexcessofraregeneticvariants[J].Scienceꎬ2012ꎬ336(6082):740-743.[7]王桂荣ꎬ王源超ꎬ杨光富ꎬ等.农业病虫害绿色防控基础的前沿科学问题[J].中国科学基金ꎬ2020ꎬ34(4):374-380.WangGRꎬWangYCꎬYangGFꎬetal.Frontiersinscientificissuesofcontrollingagriculturalpestsanddiseasesbyenvironmental ̄friendlymethods[J].BulletinofNationalNaturalScienceFoundationofChinaꎬ2020ꎬ34(4):374-380(inChinesewithEnglishabstract). [8]ChenTꎬNomuraKꎬWangXLꎬetal.Aplantgeneticnetworkforpreventingdysbiosisinthephyllosphere[J].Natureꎬ2020ꎬ580(7805):653-657.[9]WeiZꎬGuYAꎬFrimanVPꎬetal.Initialsoilmicrobiomecompositionandfunctioningpredeterminefutureplanthealth[J].ScienceAdvancesꎬ2019ꎬ5(9):eaaw0759.[10]TringeSG.Alayereddefenseagainstplantpathogens[J].Scienceꎬ2019ꎬ366(6465):568-569.[11]LegeinMꎬSmetsWꎬVandenheuvelDꎬetal.Modesofactionofmicrobialbiocontrolinthephyllosphere[J].FrontiersinMicrobiologyꎬ2020ꎬ11:1619.[12]RahmanSFSAꎬSinghEꎬPieterseCMJꎬetal.Emergingmicrobialbiocontrolstrategiesforplantpathogens[J].PlantScienceꎬ2018ꎬ267:102-111.[13]BabalolaOO.Beneficialbacteriaofagriculturalimportance[J].BiotechnologyLettersꎬ2010ꎬ32(11):1559-1570.412南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第44卷[14]Trd LꎬBoutrotFꎬClaverieJꎬetal.Perceptionofpathogenicorbeneficialbacteriaandtheirevasionofhostimmunity:patternrecognitionreceptorsinthefrontline[J].FrontiersinPlantScienceꎬ2015ꎬ6:219.[15]ZhalninaKꎬLouieKBꎬHaoZꎬetal.Dynamicrootexudatechemistryandmicrobialsubstratepreferencesdrivepatternsinrhizospheremicrobialcommunityassembly[J].NatureMicrobiologyꎬ2018ꎬ3(4):470-480.[16]ErkenMꎬLutzCꎬMcDougaldD.Theriseofpathogens:predationasafactordrivingtheevolutionofhumanpathogensintheenvironment[J].MicrobialEcologyꎬ2013ꎬ65(4):860-868.[17]GuerreroRꎬPedros ̄AlioCꎬEsteveIꎬetal.Predatoryprokaryotes:predationandprimaryconsumptionevolvedinbacteria[J].ProcNatlAcadSciUSAꎬ1986ꎬ83(7):2138-2142.[18]PérezJꎬMoraleda ̄MuñozAꎬMarcos ̄TorresFJꎬetal.Bacterialpredation:75yearsandcounting![J].EnvironmentalMicrobiologyꎬ2016ꎬ18(3):766-779.[19]陈康勇ꎬ钟为铭ꎬ高志鹏.蛭弧菌在水产养殖中应用研究进展[J].水产科学ꎬ2018ꎬ37(2):283-288.ChenKYꎬZhongWMꎬGaoZP.ResearchprogressonutilizationofBdellovibrioinaquaculture[J].FisheriesScienceꎬ2018ꎬ37(2):283-288(inChinesewithEnglishabstract).[20]WangZꎬKadouriDEꎬWuM.Genomicinsightsintoanobligateepibioticbacterialpredator:MicavibrioaeruginosavorusARL ̄13[J].BMCGenomicsꎬ2011ꎬ12:453.[21]李曙光.黏细菌的环境分布㊁季节演替及其相互作用[D].济南:山东大学ꎬ2014.LiSG.Distributionꎬseasonalsuccessionandintraspeciesinteractionsofmyxobacteria[D].Jinan:ShandongUniversityꎬ2014(inChinesewithEnglishabstract).[22]王春玲ꎬ冯广达ꎬ姚青ꎬ等.黏细菌基因组学研究进展[J].微生物学通报ꎬ2019ꎬ46(9):2394-2403.WangCLꎬFengGDꎬYaoQꎬetal.Researchprogressingenomicsofmyxobacteria[J].MicrobiologyChinaꎬ2019ꎬ46(9):2394-2403(inChinesewithEnglishabstract).[23]JurkevitchE.Predatorybehaviorsinbacteria:diversityandtransitions[J].MicrobeMagazineꎬ2007ꎬ2(2):67-73.[24]BarronGL.Predatoryfungiꎬwooddecayꎬandthecarboncycle[J].Biodiversityꎬ2003ꎬ4(1):3-9.[25]LiZKꎬYeXFꎬChenPLꎬetal.AntifungalpotentialofCorallococcussp.strainEGBagainstplantpathogenicfungi[J].BiologicalControlꎬ2017ꎬ110:10-17.[26]LiZKꎬWangTꎬLuoXꎬetal.BiocontrolpotentialofMyxococcussp.strainBSagainstbacterialsoftrotofCallalilycausedbyPectobacteriumcarotovorum[J].BiologicalControlꎬ2018ꎬ126:36-44.[27]DavidovYꎬHuchonDꎬKovalSFꎬetal.Anewalpha ̄proteobacterialcladeofBdellovibrio ̄likepredators:implicationsforthemitochondrialendo ̄symbiotictheory[J].EnvironmentalMicrobiologyꎬ2006ꎬ8(12):2179-2188.[28]ZhangYꎬGuzzoMꎬDucretAꎬetal.AdynamicresponseregulatorproteinmodulatesG ̄protein ̄dependentpolarityinthebacteriumMyxococcusxanthus[J].PLoSGeneticsꎬ2012ꎬ8(8):e1002872.[29]BeebeJM.Studiesonthemyxobacteria:ⅠꎬdistributioninIowasoilsanddescriptionofanewspeciesꎻⅡꎬMyxobacteriaasbacterialparasitesꎻⅢꎬthemorphologyandcytologyofMyxococcusxanthus[D].Iowa:IowaStateUniversityꎬ1941.[30]BerlemanJEꎬKirbyJR.Decipheringthehuntingstrategyofabacterialwolfpack[J].FEMSMicrobiologyReviewsꎬ2009ꎬ33(5):942-957. [31]PérezJꎬJiménez ̄ZurdoJIꎬMartínez ̄AbarcaFꎬetal.RhizobialgalactoglucandeterminesthepredatorypatternofMyxococcusxanthusandprotectsSinorhizobiummelilotifrompredation[J].EnvironmentalMicrobiologyꎬ2014ꎬ16(7):2341-2350.[32]ZhangWCꎬWangYꎬLuHNꎬetal.DynamicsofsolitarypredationbyMyxococcusxanthusonEscherichiacoliobservedatthesingle ̄celllevel[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiologyꎬ2019ꎬ86(3):e02286-19.[33]McBrideMJꎬZusmanDR.BehavioralanalysisofsinglecellsofMyxococcusxanthusinresponsetopreycellsofEscherichiacoli[J].FEMSMicrobiologyLettersꎬ1996ꎬ137(2/3):227-231.[34]ShiloM.Lysisofblue ̄greenalgaebymyxobacter[J].JournalofBacteriologyꎬ1970ꎬ104(1):453-461.[35]KaurRꎬKumariAꎬKaurRꎬetal.Myxobacteria:producersofenormousbioactivesecondarymetabolites[J].InternationalJournalofResearchinPharmaceuticalSciencesꎬ2018ꎬ9(1):309-313.[36]EvansAGLꎬDaveyHMꎬCooksonAꎬetal.PredatoryactivityofMyxococcusxanthusouter ̄membranevesiclesandpropertiesoftheirhydrolasecargo[J].Microbiologyꎬ2012ꎬ158(11):2742-2752.[37]XiaoYꎬWeiXMꎬEbrightRꎬetal.Antibioticproductionbymyxobacteriaplaysaroleinpredation[J].JournalofBacteriologyꎬ2011ꎬ193(18):4626-4633.[38]代京莎ꎬ李安章ꎬ朱红惠.黏细菌在植物病害生物防治中的作用[J].生物技术进展ꎬ2016ꎬ6(4):229-234.DaiJSꎬLiAZꎬZhuHH.Thefunctionofmyxobacteriainbiologicalcontrolofplantdisease[J].CurrentBiotechnologyꎬ2016ꎬ6(4):229-234(inChinesewithEnglishabstract).[39]KeaneRꎬBerlemanJ.ThepredatorylifecycleofMyxococcusxanthus[J].Microbiologyꎬ2016ꎬ162(1):1-11.[40]EnsignJꎬWolfeR.Characterizationofasmallproteolyticenzymewhichlysesbacterialcellwalls[J].Journalofbacteriologyꎬ1966ꎬ91(2):524-534.[41]LivingstonePGꎬMillardADꎬSwainMTꎬetal.TranscriptionalchangeswhenMyxococcusxanthuspreysonEscherichiacolisuggestmyxobacterialpredatorsareconstitutivelytoxicbutregulatetheirfeeding[J].MicrobialGenomicsꎬ2018ꎬ4(2):e000152.512㊀第2期李周坤ꎬ等:黏细菌捕食生物学研究进展及其在农业领域的应用潜力[42]HockingDꎬCookFD.Myxobacteriaexertpartialcontrolofdamping ̄offandrootdiseaseincontainer ̄growntreeseedlings[J].CanadianJournalofMicrobiologyꎬ1972ꎬ18(10):1557-1560.[43]LiZKꎬXiaCYꎬWangYXꎬetal.Identificationofanendo ̄chitinasefromCorallococcussp.EGBandevaluationofitsantifungalproperties[J].InternationalJournalofBiologicalMacromoleculesꎬ2019ꎬ132:1235-1243.[44]ZhouJꎬChenJHꎬLiZKꎬetal.Enzymaticpropertiesofamulti ̄specificβ ̄(1ꎬ3) ̄glucanasefromCorallococcussp.EGBanditspotentialantifungalapplications[J].ProteinExpressionandPurificationꎬ2019ꎬ164:105481.[45]KunzeBꎬSteinmetzHꎬHöfleGꎬetal.Cruentarenꎬanewantifungalsalicylate ̄typemacrolidefromByssovoraxcruenta(Myxobacteria)withinhibitoryeffectonmitochondrialATPaseactivity[J].TheJournalofAntibioticsꎬ2006ꎬ59(10):664-668.[46]SwainDMꎬYadavSKꎬTyagiIꎬetal.Aprophagetail ̄likeproteinisdeployedbyBurkholderiabacteriatofeedonfungi[J].NatureCommunicationsꎬ2017ꎬ8(1):1-9.[47]TrunkKꎬPeltierJꎬLiuYCꎬetal.ThetypeⅥsecretionsystemdeploysantifungaleffectorsagainstmicrobialcompetitors[J].NatureMicrobiologyꎬ2018ꎬ3(8):920-931.[48]LiZKꎬYeXFꎬLiuMXꎬetal.Anoveloutermembraneβ ̄1ꎬ6 ̄glucanaseisdeployedinthepredationoffungibymyxobacteria[J].TheISMEJournalꎬ2019ꎬ13(9):2223-2235.[49]RuttenLꎬMannieJPBAꎬSteadCMꎬetal.Active ̄sitearchitectureandcatalyticmechanismofthelipidAdeacylaseLpxRofSalmonellatyphimurium[J].ProcNatlAcadSciUSAꎬ2009ꎬ106(6):1960-196.[50]FairmanJWꎬNoinajNꎬBuchananSK.Thestructuralbiologyofβ ̄barrelmembraneproteins:asummaryofrecentreports[J].CurrentOpinioninStructuralBiologyꎬ2011ꎬ21(4):523-531.[51]MüllerSꎬStrackSNꎬHoeflerBCꎬetal.BacillaeneandsporulationprotectBacillussubtilisfrompredationbyMyxococcusxanthus[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiologyꎬ2014ꎬ80(18):5603-5610.[52]BillsGFꎬGloerJB.Biologicallyactivesecondarymetabolitesfromthefungi[J].MicrobiologySpectrumꎬ2016ꎬ4(6):1-32.[53]MüllerSꎬStrackSNꎬRyanSEꎬetal.PredationbyMyxococcusxanthusinducesBacillussubtilistoformspore ̄filledmegastructures[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiologyꎬ2015ꎬ81(1):203-210.[54]DepasWHꎬSyedAKꎬSifuentesMꎬetal.BiofilmformationprotectsEscherichiacoliagainstkillingbyCaenorhabditiselegansandMyxococcusxanthus[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiologyꎬ2014ꎬ80(22):7079-7087.[55]WangCꎬLiuXꎬZhangPꎬetal.BacilluslicheniformisescapesfromMyxococcusxanthuspredationbydeactivatingmyxovirescinAthroughenzymaticglucosylation[J].EnvironmentalMicrobiologyꎬ2019ꎬ21(12):4755-4772.[56]NairRRꎬVasseMꎬWielgossSꎬetal.Bacterialpredator ̄preycoevolutionacceleratesgenomeevolutionandselectsonvirulence ̄associatedpreydefences[J].NatureCommunicationsꎬ2019ꎬ10(1):1-10.[57]MaddiAꎬDettmanAꎬFuCꎬetal.WSC ̄1andHAM ̄7areMAK ̄1MAPkinasepathwaysensorsrequiredforcellwallintegrityandhyphalfusioninNeurosporacrassa[J].PLoSOneꎬ2012ꎬ7(8):e42374.[58]JoussetA.Ecologicalandevolutiveimplicationsofbacterialdefencesagainstpredators[J].EnvironmentalMicrobiologyꎬ2012ꎬ14(8):1830-1843. [59]ThakurMPꎬGeisenS.Trophicregulationsofthesoilmicrobiome[J].TrendsinMicrobiologyꎬ2019ꎬ27(9):771-780.[60]LuedersTꎬKindlerRꎬMiltnerAꎬetal.Identificationofbacterialmicropredatorsdistinctivelyactiveinasoilmicrobialfoodweb[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiologyꎬ2006ꎬ72(8):5342-5348.[61]ZhouXWꎬLiSGꎬLiWꎬetal.Myxobacterialcommunityisapredominantandhighlydiversebacterialgroupinsoilniches[J].EnvironmentalMicrobiologyReportsꎬ2014ꎬ6(1):45-56.[62]WangWHꎬLuoXꎬYeXFꎬetal.PredatoryMyxococcalesarewidelydistributedinandcloselycorrelatedwiththebacterialcommunitystructureofagriculturalland[J].AppliedSoilEcologyꎬ2020ꎬ146:103365.[63]YeXFꎬLiZKꎬLuoXꎬetal.ApredatorymyxobacteriumcontrolscucumberFusariumwiltbyregulatingthesoilmicrobialcommunity[J].Microbiomeꎬ2020ꎬ8(1):49.[64]Mendes ̄SoaresHꎬVelicerGJ.Decomposingpredation:testingforparametersthatcorrelatewithpredatoryperformancebyasocialbacterium[J].MicrobialEcologyꎬ2013ꎬ65(2):415-423.[65]任兴波ꎬ张子良ꎬ赵璞钰ꎬ等.马铃薯晚疫病菌拮抗黏细菌YR ̄35的分离鉴定及其代谢产物稳定性[J].中国生物防治学报ꎬ2016ꎬ32(3):379-387.RenXBꎬZhangZLꎬZhaoPYꎬetal.IsolationandidentificationofthestrainYR ̄35resistanttophytophthorainfestansanditsmetabolites[J].ChineseJournalofBiologicalControlꎬ2016ꎬ32(3):379-387(inChinesewithEnglishabstract).[66]李百元ꎬ谢小林ꎬ张鲜娇ꎬ等.不同被捕食细菌对新疆盐碱地黏细菌分离的影响[J].微生物学报ꎬ2013ꎬ53(4):379-389.LiBYꎬXieXLꎬZhangXJꎬetal.Influenceofdifferentpreystrainsonisolationofmyxobacteriainsaline ̄alkalinesoilsofXinjiang[J].ActaMicrobiologicaSinicaꎬ2013ꎬ53(4):379-389(inChinesewithEnglishabstract).[67]KimSTꎬYunSC.BiocontrolwithMyxococcussp.KYC1126againstanthracnoseinhotpepper[J].ThePlantPathologyJournalꎬ2011ꎬ27(2):156-163.[68]DahmMꎬBrzezińskaAJꎬWrótniak ̄DrzewieckaWꎬetal.Myxobacteriaasapotentialbiocontrolagenteffectiveagainstpathogenicfungiofeconomicallyimportantforesttrees[J].Dendrobiologyꎬ2015ꎬ74:13-24.[69]YeXFꎬChenYꎬMaSYꎬetal.BiocidaleffectsofvolatileorganiccompoundsproducedbythemyxobacteriumCorrallococcussp.EGBagainst612南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第44卷fungalphytopathogens[J].FoodMicrobiologyꎬ2020ꎬ91:103502.[70]YunSC.Selectionanda3 ̄yearfieldtrialofSorangiumcellulosumKYC3262againstanthracnoseinhotpepper[J].ThePlantPathologyJournalꎬ2014ꎬ30(3):279-287.[71]NanBꎬZusmanDR.Uncoveringthemysteryofglidingmotilityinthemyxobacteria[J].AnnualReviewofGeneticsꎬ2011ꎬ45:21-39. [72]SpormannAM.Glidingmotilityinbacteria:insightsfromstudiesofMyxococcusxanthus[J].MicrobiologyandMolecularBiologyReviewsꎬ1999ꎬ63(3):621-641.[73]刘新利ꎬ李越中.黏细菌次级代谢产物及其在农业上的应用价值[J].中国农业科技导报ꎬ2007ꎬ9(3):44-51.LiuXLꎬLiYZ.Myxobacterialsecondarymetabolitesandtheirpotentialapplicationsinagriculture[J].JournalofAgriculturalScienceandTechnologyꎬ2007ꎬ9(3):44-51(inChinesewithEnglishabstract).[74]KaurRꎬSinghSꎬKaurRꎬetal.Myxococcusxanthus:asourceofantimicrobialsandnaturalbio ̄controlagent[J].ThePharmaInnovationJour ̄nalꎬ2017ꎬ6(11):260-262.[75]DworkinM.Recentadvancesinthesocialanddevelopmentalbiologyofthemyxobacteria[J].MicrobiologyReviewꎬ1996ꎬ60(1):70-102. [76]DawidW.Biologyandglobaldistributionofmyxobacteriainsoils[J].FEMSMicrobiologyReviewsꎬ2000ꎬ24(4):403-427.[77]李曙光ꎬ周秀文ꎬ吴志红ꎬ等.黏细菌的种群生态及其生存策略[J].微生物学通报ꎬ2013ꎬ40(1):172-179.LiSGꎬZhouXWꎬWuZHꎬetal.Populationecologyandsurvivalstrategyofmyxobacteria[J].MicrobiologyChinaꎬ2013ꎬ40(1):172-179(inChinesewithEnglishabstract).[78]Muñoz ̄DoradoJꎬMarcos ̄TorresFꎬGarcia ̄BravoEꎬetal.Myxobacteria:movingꎬkillingꎬfeedingꎬandsurvivingtogether[J].FrontiersinMicrobiologyꎬ2016:781.[79]LivingstonePGꎬMorphewRMꎬWhitworthDE.Myxobacteriaareabletopreybroadlyuponclinically ̄relevantpathogensꎬexhibitingapreyrangewhichcannotbeexplainedbyphylogeny[J].FrontiersinMicrobiologyꎬ2017ꎬ8:1593.[80]刘新利ꎬ李越中.黏细菌资源与埃博霉素研发[J].生物产业技术ꎬ2011(2):26-32.LiuXLꎬLiYZ.Myxobacteriaresourcesanddevelopmentofepothilone[J].Biotechnology&Businessꎬ2011(2):26-32(inChinese). [81]CaoPꎬWallD.Directvisualizationofamolecularhandshakethatgovernskinrecognitionandtissueformationinmyxobacteria[J].NatureCommunicationsꎬ2019ꎬ10(1):3073.[82]YuYTNꎬYuanXꎬVelicerGJ.AdaptiveevolutionofansRNAthatcontrolsMyxococcusdevelopment[J].Scienceꎬ2010ꎬ328(5981):993. [83]ReichenbachH.Myxobacteriaꎬproducersofnovelbioactivesubstances[J].JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnologyꎬ2001ꎬ27(3):149-156.[84]WangJꎬHuWꎬLuxRꎬetal.NaturaltransformationofMyxococcusxanthus[J].JournalofBacteriologyꎬ2011ꎬ193(9):2122-2132.责任编辑:刘怡辰。
水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立的开题报告题目:水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立引言:水稻是世界上重要的粮食作物之一,但其种质资源狭窄、受病虫害及环境胁迫影响较大等问题制约了其产量的提高。
因此,利用遗传转化技术增加水稻产量、改良其性状已是一个热门研究方向。
然而,在遗传转化中,转化外源基因可能会产生意想不到的效应,如会引起植株离异和胚性致死等问题,加上转化后植株无法生存等问题的存在,使得遗传转化技术的缺陷较为突出。
因此,建立一种高效的安全筛选体系对于水稻遗传转化技术的应用具有重要意义。
研究目的:本研究旨在建立一种针对水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系,并通过该体系筛选出活性高、与外源基因无关的转化植株,为水稻遗传转化技术的应用提供科学依据。
研究方法:(1)构建遗传转化载体将目标基因(如抗旱、抗食糖)与可活化、可选择标记(如荧光标记物GFP)和甘露糖酶基因(用于安全筛选转化植株)构建成遗传转化载体。
(2)水稻遗传转化采用农杆菌介导法将遗传转化载体导入优良的水稻品种中,获得转化植株。
(3)甘露糖筛选将转化植株移植于含有不同浓度甘露糖的基础培养基中,筛选出对甘露糖无抵御能力的离异株。
(4)遗传分析通过PCR、酶切等方法对获得的转化植株进行遗传分析,并鉴定目标基因是否成功转移到水稻中。
预期结果:建立一种针对水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系,筛选出活性高并与外源基因无关的转化植株,并对其进行遗传分析,为水稻遗传转化技术的应用提供可靠的安全筛选体系与科学依据。
研究意义:建立水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系,通过筛选出与外源基因无关,对甘露糖无抵御能力的转化植株,可以在一定程度上减轻外源基因对水稻的负面影响,提高转换率,为水稻等重要作物的遗传改良提供有力的支持。
中国瓜菜2024,37(2):1-7收稿日期:2023-10-16;修回日期:2023-11-22基金项目:湖北省重点研发计划项目(2022BBA0061,2023BBB013,2023BBB044);湖北省援疆援藏项目(2022BGD008);湖北省农业科技创新中心项目(2021-620-000-001-007);湖北省自然科学基金青年项目(2022CFC055);湖北省支持种业高质量发展资金项目(HBZY2023B004-4)作者简介:张怡文,女,硕士,主要从事辣椒生物技术研究。
E-mail :********************通信作者:姚明华,男,研究员,主要从事辣椒遗传育种方面的研究工作。
E-mail :******************徐凯,男,助理研究员,主要从事辣椒分子育种与生物技术研究工作。
E-mail :***************辣椒为茄科辣椒属园艺植物,是全球规模最大的香料作物和调味品,也是我国栽培面积最大的蔬菜之一,常年栽培面积达3200万hm 2,年产值逾2500亿元,栽培面积和总产量居世界首位,且有继续增加的趋势[1]。
杂交品种被广泛应用于辣椒生产,可显著提高辣椒的产量、抗性和品质。
然而,目前辣椒杂交种的生产仍以人工去雄为主,授粉过程技术性强且劳动密集,成本巨大,种子纯度难以保证。
因此,利用雄性不育系可有效解决人工去雄的难题,简化制种工序,降低生产成本,进而应用于辣椒杂交种的商业化高效生产[2]。
1辣椒雄性不育的类型与特点辣椒雄性不育主要包括两种类型,细胞质雄性不育(cytoplasm male sterility ,CMS )和细胞核雄性不育(genic male sterile ,GMS )[3-4]。
GMS 只由细胞核基因控制,不受细胞质影响,且育性遗传符合孟德尔遗传定律;而CMS 是一种母系遗传性状,雄性辣椒雄性不育的分子研究进展张怡文1,2,徐兰婷1,2,王飞2,3,刘奕清1,2,姚明华1,2,3,徐凯2(1.长江大学香辛作物研究院·长江大学园艺林学学院湖北荆州434025;2.蔬菜种质创新与遗传改良湖北省重点实验室·湖北省农业科学院经济作物研究所武汉430064;3.湖北洪山实验室武汉430070)摘要:辣椒(Capsicum annuum L.)是世界上重要的蔬菜作物之一,杂种优势明显。
・综述与专论・2014年第9期生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN筛选标记基因对于转基因作物的研究和生产至关重要。
自20世纪80年代第一株转基因植物产生至今,筛选标记基因(如抗生素抗性和除草剂抗性标记基因)所起到的作用有目共睹。
如果没有这些抗性标记基因,产生转基因作物基本是不可能的[1]。
随着植物转基因技术的迅速发展,大约50个标记基收稿日期:2014-03-03作者简介:刘戬丰,女,硕士,研究方向:作物遗传转化;E -mail: jianfeng.liu@ 通讯作者:李相敢,男,博士,研究方向:作物遗传转化与分子生物学;E -mail :xianggan.li@甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用刘戬丰 王艳丽 李相敢(先正达生物科技(中国)有限公司 北京 102206)摘 要: 甘露糖在己糖激酶的作用下形成6-磷酸甘露糖,进一步在磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase,PMI)的催化下转化成植物可利用的6-磷酸果糖,从而使转化细胞在甘露糖作为主要碳源的培养基上正常生长,而非转化细胞生长受到抑制。
这一筛选体系被认为是一种正向筛选(Positive selection),已被成功地应用于重要的粮食作物和经济作物中。
甘露糖筛选的植株可以通过多种方法检测,其中氯酚红检测法和试纸条检测法简单方便,适用于初步筛选。
甘露糖筛选体系安全高效,已被应用于玉米商业化产品中。
综述了甘露糖(mannose)筛选体系的原理、筛选特点、植株的鉴定、筛选方法的优缺点以及在商业化中的应用,列举了利用甘露糖筛选的玉米单性状转化系用于抗鳞翅目和抗鞘翅目昆虫及抗高温淀粉酶的范例及其在育种叠加中的应用。
这种育种叠加使得甘露糖筛选的性状与其他性状重叠而得到更广谱的具有抗除草剂抗虫性状的商业化产品。
关键词: 磷酸甘露糖异构酶 筛选标记 安全性分析 转基因植物检测 甘露糖Mannose Selection System and Its Commercial Application inTransgenic CornLiu Jianfeng Wang Yanli Li Xianggan(Syngenta Biotechnology China Co.,Ltd ,Beijing 102206)Abstract : Mannose can be converted into mannose 6-phosphate in cells and further converted into fructose 6-phosphate in transgenic cells if phosphomannose isomerase(PMI)gene(man A)is introduced as a selection marker. The transformed cells can grow normally on the media with mannose as main carbon source while the non -transformed cells are inhibited to grow. As a positive selection, Mannose / PMI system has been applied to important food crops and important economic crops. The plants selected by mannose can be analyzed through a variety of methods, including simple CPR test and convenient strip test. Mannose selection system is a safe and efficient platform suitable for commercial applications. In this review, advances in mannose selection system with its mode of action, selection characteristics, methods of transgenic plants analysis, advantages and disadvantages in transformation, as well as its applications in transgenic corn production and breeding stacks were summarized. Successful examples to use Mannose / PMI selection system in corn to generate multiple single trait events for insect resistances and high temperature resistant amylase, which have been breeding -stacked with other corn traits selected by different selection systems to provide broad spectrum of herbicide resistance and insect resistance for higher commercial value were presented.Key words : Phosphomannose isomerase Selection marker Safety analysis Transgenic plant assay Pmi (manA )因被作为筛选标记引入到植物中[2]。
近年来,人们对转基因安全的疑虑更进一步加深了对除草剂抗性和抗生素抗性基因作为标记基因的争论。
其中包括怀疑是否抗生素基因被其他物种摄取而产生抗生素抗性,这种抗生素抗性可能会使抗生素失效;其次怀 疑抗除草剂基因可能会扩散到生物技术通报 Biotechnology Bulletin2014年第9期14杂草中去,会使该类除草剂失效。
为减少对转基因的争议和提高人们对转基因安全性的信心, 甘露糖筛选标记和筛选体系则成了很好的范例。
这个筛选体系已被广泛应用于植物转化中,是一种高效、安全、环境友好型的筛选体系。
1 甘露糖筛选体系介绍1.1 甘露糖筛选体系的原理在甘露糖筛选体系中,植物转化细胞和非转化细胞均可吸收培养基中的甘露糖,并在植物内源[3]己糖激酶作用下自发[4]生成6-磷酸甘露糖。
唯有转化细胞进一步在6-磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase,PMI)的作用下转化成6-磷酸果糖。
如图1所示,甘露糖代谢成6-磷酸果糖,6-磷酸果糖进入糖酵解途径。
编码6-磷酸甘露糖异构酶的基因是manA ,该基因首次从大肠杆菌中克隆[5]。
进一步研究发现,磷酸甘露糖异构酶也存在于酵母、猪和人体中[3]。
虽然人们推测在植物界可能存在PMI 的活性,如一些豆科植物能够在以甘露糖作为唯一碳源的培养基上生存,但是到目前为止,还没有直接从植物中克隆到类似于manA 的基因。
转化细胞含有外源基因manA 编码的磷酸甘露糖异构酶,可以把6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖,从而能够正常生长;未转化细胞不含有磷酸甘露糖异构酶,不能把6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖,导致6-磷酸甘露糖大量积累并且消耗大量ATP 和磷酸根离子,抑制了糖酵解途径,从而生长受到抑制[6]。
在该筛选体系中转化细胞可以利用筛选剂甘露糖作为碳源而非转化细胞不能利用甘露糖作为碳源,这种利用碳源缺乏来抑制非转化细胞生长的筛选方法为“正向筛选”[7]。
在一些极端情况下,甘露糖的存在可以导致愈伤组织的死亡。
例如,在玉米转化中,由幼胚诱导的愈伤组织在第1轮大约2周的甘露糖筛选中,偶尔会见到变白、质地软化、已经死亡的愈伤组织。
1.2 甘露糖筛选体系的特点在甘露糖筛选体系中,除了需要加入筛选剂甘露糖外,还需要补充一定比例的可直接利用的碳源以提高筛选效果。
Wright 等[8]在2001年玉米转化试验过程中发现,在筛选和再生阶段,当培养基中仅仅含有甘露糖一种碳源时,转化的细胞或植株难以生长和分化成苗,需要配以一定含量的蔗糖。
但是,也有少数研究发现无需加入可直接利用的碳源,如Bahariah 等[9]在烟草和油棕[10]转化中,并未加入其他碳源。
他们在油棕的研究中发现,筛选培养基甘露糖浓度为30 g/L 且不加蔗糖时,得到的转化效率最高。
根据物种和品种等条件的不同,筛选培养基中甘露糖浓度及其与补充碳源的配比有所不同。
对于拟南芥,甘露糖的工作浓度仅为0.4 g/L [11],而水稻甚至高达30 g/L [12]。
甘露糖和补充碳源的比例范围也很大,Todd 等[11]在拟南芥的转化中使用的比例为0.4∶10(g/L),而在Bahariah 等转化烟草和油棕时,完全没有加入其他可直接利用的碳源。
甘露糖和外加碳源的比例会直接影响到筛选效率和阳性率,如Wright 等在小麦转化试验中,添加蔗糖可以大大提高筛选效率。
甘露糖与蔗糖的比例取决于不同的基因型,浓度范围在5-20 g/L [8]。
Feeney 等[13]在大麻转化试验中也发现,试验所用的两个品种的最适筛选压明显不同。
根据物种和基因型的不同,补充碳源的种类也有差异。
Joersbo 等[14]在甜菜转化试验中比较了添加不同种类的补充碳源对于降低甘露糖抑制作用的效果明显不同,其中葡萄糖的效果最好,优于麦芽糖和果糖,蔗糖的效果居中。
甘露糖筛选体系可以利用多种类型外植体和多种转化方法。
例如,玉米甘露糖筛选体系通常采用玉米幼胚、愈伤组织或原生质体作为外植体。
转化方法包括农杆菌法[15]、基因枪法[8]和原生质体法[16]。
图2简单描述了农杆菌介导的甘露糖筛选体系转化玉米幼胚的流程。
图1甘露糖代谢原理2014年第9期15刘戬丰等:甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用1.3 转化植株的检测方法由于manA 基因在大多数植物中都不存在,所以该基因可以通过常规方法,如PCR、RT -PCR、Southern 杂交、ELISA、氯酚红检测法(CPR)等方法进行检测。
此外,可以利用PMI 在筛选体系中的特点进行检测,如分光光度检测法和试纸条检测法。
本研究概括介绍如下两种简捷的非分子生物学方法。
1.3.1 氯酚红(chlorophenol red,CPR)检测法 当pH6.0向pH5.0变化时,pH 指示剂氯酚红从红色经橙色变成黄色[17]。