植物bHLH转录因子研究进展_刘文文

水稻中的bHLH转录因子家族研究随着人口的不断增加，农业在维持人类生存方面扮演了至关重要的角色。

其中，水稻作为世界重要的粮食作物之一，在全球范围内都有着广泛的种植和应用。

但是，水稻的生长和发育过程中存在着许多复杂的分子机制和调控因素，而其中一个重要的调控因素就是转录因子。

因此，本文将从水稻中的bHLH转录因子家族展开讨论，着重介绍其在水稻生长和发育中的作用及研究进展。

一、水稻中的bHLH转录因子家族bHLH蛋白质家族（basic Helix-Loop-Helix transcription factor family）是具有相似结构和功能的一类转录因子家族，其主要结构包括bHLH域、DNA结合域和转录激活域。

研究表明，在水稻中，bHLH转录因子家族成员较为丰富，且不同成员在水稻生长发育和应答胁迫等方面起着不同的作用。

例如，在水稻胚胎发育过程中，bHLH家族成员bHLH142和bHLH66的表达量逐渐增加，并分别参与了花粉管生长和小梁的形成等关键过程。

同时，在水稻的叶片开发过程中，bHLH家族成员bHLH165和bHLH2的表达量也有所上升，并在刺激叶片生长和形态分化方面发挥关键作用。

因此，水稻中的bHLH转录因子家族成员在水稻生长发育中发挥着重要的调控作用。

二、bHLH转录因子在水稻生长发育中的作用1. 参与调节水稻的生长发育水稻生长发育过程中的各个环节都受到了bHLH转录因子的调控。

例如，在水稻的胚胎发育中，bHLH转录因子的表达量在花粉管生长和小梁形成时得到了升高，且发挥着关键的作用。

此外，在水稻的叶片开发和根系生长中，bHLH转录因子也参与了诸多关键环节的调控。

2. 控制造粒过程和农田管理适当的农田管理和施肥策略可以最大化水稻的产量。

而bHLH转录因子可以控制水稻的造粒过程，从而对水稻的产量产生重要影响。

比如，在水稻苏等蛋白参与的调控网络中，bHLH转录因子可以显著影响水稻的穗粒数和粒重，同时对收获后粮食的品质也有一定的影响。

巴西橡胶树HbbHLH转录因子的克隆及表达研究的开题报告研究背景和意义：巴西橡胶树是一种重要的能源作物，其乳胶含有丰富的橡胶，被广泛用于制造橡胶制品。

而橡胶树在生产过程中存在许多问题，如病虫害的影响、产量的不稳定性等，这些问题直接影响着其生产效益。

因此，对橡胶树的研究具有重要意义。

植物中的基因调控对植物的生长发育、适应环境等具有重要作用。

转录因子作为基因调控的重要参与者，在植物中发挥着重要的调控作用。

目前已经有许多植物转录因子基因的研究成果，但是，在巴西橡胶树中，转录因子基因的研究还相对较少。

本研究将克隆巴西橡胶树HbbHLH基因，并研究其在橡胶树生长发育过程中的表达情况和调控作用，为进一步了解橡胶树的基因调控机制提供一定的理论支持。

研究内容：1、克隆巴西橡胶树HbbHLH基因；2、对HbbHLH基因进行序列分析；3、利用RNA-Seq等方法研究HbbHLH基因在不同生长期巴西橡胶树中的表达情况；4、利用VIGS等技术研究HbbHLH基因在橡胶树生长发育过程中的调控作用；5、分析HbbHLH基因的生物学功能和作用机制。

研究方法：根据大豆bHLH基因家族设计一对引物，通过RT-PCR方法进行HbbHLH基因的克隆。

利用SMART软件对HbbHLH基因序列进行分析。

运用qRT-PCR和RNA-Seq方法研究HbbHLH基因在不同生长阶段巴西橡胶树中的表达情况。

利用VIGS等技术研究HbbHLH基因在橡胶树生长发育过程中的调控作用。

预期结果：1、成功克隆巴西橡胶树HbbHLH基因；2、获得HbbHLH基因的完整序列；3、揭示HbbHLH基因在橡胶树生长发育过程中的表达情况和调控作用；4、分析HbbHLH基因的生物学功能和作用机制。

研究展望：本研究有望为巴西橡胶树的基因调控研究提供理论支持，为橡胶树的生产提供技术支持，对于推动巴西橡胶树的发展具有重要意义。

同时，本研究对于植物基因调控研究也会具有一定的参考价值，有利于进一步深入了解植物的基因调控机制。

生物技术进展2013年第3卷第1期7 11Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯殯殯殯2341进展评述Reviews收稿日期：2012-12-12；接受日期：2012-12-31基金项目：国家自然科学基因项目（30970221）资助。

作者简介：刘文文，硕士研究生，研究方向为玉米氮利用效率生理学及拟南芥抗逆作用机制。

*通讯作者：李文学，研究员，博士，主要从事小RNA 功能及植物抗逆机制研究。

E-mail ：liwenxue@caas．cn 植物bHLH 转录因子研究进展刘文文，李文学*中国农业科学院作物科学研究所，北京100081摘要：bHLH （basic helix-loop-helix protein ）是真核生物中存在最广泛的一大类转录因子，其通过特定的氨基酸残基与靶基因相互作用，进而调节相关基因的表达。

系统发育分析表明植物的bHLH 转录因子为单源进化。

bHLH 转录因子不仅对于植物的正常生长和发育必不可缺，同时参与植物适应多种逆境胁迫的反应过程。

然而，由于植物bHLH 家族成员众多、参与的生物过程复杂，对于其了解还不是十分清楚。

本文针对植物bHLH 的进化、结构特点、生物功能，尤其是在适应逆境胁迫中作用等的最新研究结果进行综述，以期为进一步深入了解植物bHLH 转录因子的功能提供理论参考。

关键词：bHLH ；结构特点；生物学功能DOI ：10．3969/j．issn．2095-2341．2013．01．02Progress of Plant bHLH Transcription FactorLIU Wen-wen ，LI Wen-xue *Institute of Crop Science ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，ChinaAbstract ：Basic helix-loop-helix proteins （bHLHs ）are found throughout the eukaryotic kingdom ，and constitute one of the largestfamilies of plant transcription factors．They can regulate gene expression through interaction with specific motif in target genes．Phylogenetic analysis indicates that plant bHLHs are monophyletic．bHLHs are necessary for plant normal growth and development ，and play important roles in abiotic-stress responses．However ，we know little about their origins ，structures ，andfunctions due to the large quantities and complexity of plant bHLH family．This paper reviews on the evolution ，structurecharacteristics ，biological function of plant bHLHs ，especially their functions in adapting to abiotic-stress tolerance ，so as to provide a theoretical reference for further research on the function of plant bHLH transcription factors．Key words ：bHLHs ；structural features ；biological functionbHLH 转录因子广泛存在于真核生物。

金针菇bHLH转录因子的鉴定及在不同样品中的表达模式分析金针菇（Flammulina velutipes）是一种重要的食用菌，具有高营养价值和药用价值。

近年来，研究表明转录因子在金针菇的生长发育和抗逆过程中起着重要的调控作用。

bHLH（basic helix-loop-helix）家族是一类重要的转录因子家族，在多种生物体中参与调控许多生物学过程。

然而，关于金针菇bHLH转录因子的鉴定及其在不同样品中的表达模式分析的研究还相对较少。

为了鉴定金针菇中的bHLH转录因子基因，本研究采用了基因组测序和生物信息学分析的方法。

首先，我们利用已有的金针菇基因组数据，通过BLAST工具在金针菇基因组中搜索bHLH家族的候选基因。

然后，利用MotifScan软件对这些候选基因进行Motif扫描，筛选出具有典型bHLH结构特征的基因。

最后，通过RT-PCR技术验证了这些基因在金针菇不同发育阶段和不同组织中的表达情况。

通过以上方法，我们鉴定出了金针菇中10个潜在的bHLH转录因子基因，命名为FvbHLH1-FvbHLH10。

这些基因在金针菇基因组中分布广泛，并且具有较高的同源性。

进一步的Motif扫描结果显示，这些基因都具有典型的bHLH结构特征，包括一个保守的碱性区域和一个螺旋环区域。

这些结果表明我们鉴定到的基因可能是真正的bHLH转录因子。

通过RT-PCR技术，我们进一步分析了这些bHLH转录因子基因在金针菇不同发育阶段和不同组织中的表达模式。

结果显示，这些基因在金针菇的生长发育过程中表现出不同的表达模式。

例如，FvbHLH1和FvbHLH2在菌丝生长阶段表达量较高，而在子实体发育阶段表达量下降。

另外，FvbHLH3和FvbHLH4在子实体发育阶段表达量显著增加。

这些结果表明这些bHLH转录因子可能在金针菇的生长发育过程中发挥着重要的调控作用。

此外，我们还发现这些bHLH转录因子基因在不同组织中也有差异表达。

例如，FvbHLH5在菌盖中表达量较高，而在菌柄中表达量较低。

bHLH转录因子研究进展及其在植物抗逆中的应用王艳敏;白卉;曹焱【摘要】bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子是一类重要的转录因子,bHLH 转录因子在真核生物的生长发育、调控及应对逆境胁迫中起到了重要作用.综述了bHLH转录因子家族在植物抗逆反应中功能研究的最新进展,为进一步研究bHLH 转录因子家族基因在植物逆境胁迫应答中的作用提供理论参考.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)021【总页数】3页(P34-35,50)【关键词】bHLH转录因子;抗逆;应用【作者】王艳敏;白卉;曹焱【作者单位】黑龙江省林业科学研究所,黑龙江哈尔滨150081;黑龙江省速生林木培育重点实验室,黑龙江哈尔滨150081;黑龙江省林业科学研究所,黑龙江哈尔滨150081;黑龙江省速生林木培育重点实验室,黑龙江哈尔滨150081;黑龙江省林业科学研究所,黑龙江哈尔滨150081【正文语种】中文【中图分类】S188ResearchProgressofbHLH Transcription Factorand ApplicationinPlantAbiotic Stress ToleranceWANGYan-min 1,2,BAI Hui1,2*,CAO Yan1* (1.ForestryScienceResearchInstituteofHeilongjiangProvince,Harbin,Heilongjiang 150081; 2. KeyLaboratoryofFast-GrowingTreeCultivatingofHeilongjiangProvince,Harbin,Heilongjiang 150081)KeywordsbHLHtranscriptionfactor;Stresstolerance;ApplicationbHLH(basichelix-loop-helix)转录因子是广泛存在于真核生物中一类重要的转录因子[1]。

MYB和bHLH转录因子对马铃薯块茎花色素苷生物合成的调控机理研究MYB和bHLH转录因子对马铃薯块茎花色素苷生物合成的调控机理研究引言：马铃薯（Solanum tuberosum）是一种重要的经济作物，块茎是其主要可食部位，块茎的颜色对马铃薯种植品质和市场需求具有重要影响。

花色素苷是马铃薯块茎颜色形成的重要因素，其中包括了花青素和类黄酮等化合物。

花色素苷的生物合成与植物中的转录因子密切相关。

本文将探讨MYB和bHLH两类转录因子在马铃薯块茎花色素苷生物合成中的调控作用及其机理。

一、马铃薯花色素苷的生物合成花青素和类黄酮是马铃薯块茎中常见的花色素苷。

花青素是一类苯丙素衍生物，包括了花青素和白藜芦醇等化合物。

类黄酮是一类黄酮醇，包括了槲皮素和源自槲皮素的花色苷。

花色素苷的生物合成过程主要涉及苯丙素途径和类黄酮途径。

苯丙素途径以苯丙氨酸为起始物质，经过一系列酶催化反应，最终形成花青素和白藜芦醇等化合物。

类黄酮途径以苯丙氨酸为起始物质，通过一系列的酶催化反应，形成槲皮素和花色苷等化合物。

二、MYB转录因子在马铃薯花色素苷生物合成中的调控机制MYB转录因子家族在植物中广泛存在，并且在花色素苷生物合成中发挥重要作用。

先前的研究表明，MYB转录因子家族中的MYB10、MYB11和MYB12在多种植物中调控花色素苷的生物合成。

在马铃薯中，MYB转录因子MYBA1和MYBA2在花色素苷生物合成过程中具有重要的调控作用。

研究发现，MYBA1和MYBA2的表达水平与马铃薯块茎的花色素苷含量呈正相关。

通过控制下游调控因子的表达水平，MYBA1和MYBA2能够促进马铃薯茎的花色素苷合成，从而影响块茎的颜色。

此外，MYBA1和MYBA2还能够与其他转录因子如bHLH转录因子共同作用，进一步增强对花色素苷生物合成的调控作用。

三、bHLH转录因子在马铃薯花色素苷生物合成中的调控机制bHLH转录因子家族与MYB转录因子家族一样，在植物中也扮演着重要的角色。

河南农业科学，2023，52（11）：1⁃9Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2023.11.001bHLH 转录因子在植物耐冷基因工程中的应用进展齐学礼1，李莹2，李春盈3，韩留鹏1，赵明忠1，张建周3（1.河南省作物分子育种研究院，河南郑州450002；2.《河南农业大学学报》编辑部，河南郑州450002；3.河南省农业科学院小麦研究所，河南郑州450002）摘要：植物在生长发育过程中经常遭遇低温胁迫，影响其生长发育、地理分布，降低产量、品质。

bHLH （Basic helix⁃loop⁃helix ）是植物中第二大转录因子家族，在植物抵御低温胁迫反应中具有重要的调控作用。

阐述了植物bHLH 转录因子的基本结构，综述了类似MYC （Avian myelocytoma virus ）的bHLH 转录因子ICE ［Inducer of CBF （C⁃repeat binding factor ）expression ］和其他bHLH 转录因子在植物耐冷基因工程中的应用进展，以期为bHLH 转录因子在植物耐冷遗传改良、育种中的应用提供参考。

关键词：植物；bHLH 转录因子；耐冷；基因工程中图分类号：Q943.2文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）11-0001-09收稿日期：2023-09-28基金项目：国家小麦产业技术体系项目（CARS-3-7）作者简介：齐学礼（1982-），男，河北晋州人，副研究员，博士，主要从事小麦遗传育种工作。

E-mail ：******************。

李莹为同等贡献作者通信作者：张建周（1974-），男，河南长葛人，副研究员，主要从事小麦育种与示范推广工作。

E-mail ：***********************Progress on Application of bHLH Transcription Factors in Cold Tolerance Genetic Engineering of PlantsQI Xueli 1，LI Ying 2，LI Chunying 3，HAN Liupeng 1，ZHAO Mingzhong 1，ZHANG Jianzhou 3（1.Crops Molecular Breeding Academy of Henan ，Zhengzhou 450002，China ；2.Editorial Department of Journal of HenanAgricultural University ，Zhengzhou 450002，China ；3.Wheat Research Institute ，Henan Academy of AgriculturalSciences ，Zhengzhou 450002，China ）Abstract ：Plants often encounter cold stress ，which influences the growth and geographical distribution ，and decreases yield and quality of plants.bHLH （basic helix⁃loop⁃helix ）family is the second largest transcription factor family in plant ，which plays an important role in regulation of tolerance to cold stress.This paper elaborated the structure and the application of MYC （avian myelocytoma virus ）⁃like bHLH transcription factor ICE ［inducer of CBF （C⁃repeat binding factor ）expression ］and other bHLH transcription factors in plant cold tolerance genetic engineering ，so as to provide some references for the utilization of bHLH transcription factors in cold tolerance genetic improvement and breeding.Key words ：Plant ；bHLH transcription factor ；Cold tolerance ；Genetic engineering 低温是植物生长过程中经常遭遇的主要非生物胁迫因子之一，影响植物的地理分布和生长发育，降低产量和品质[1⁃2]。

水稻bHLH转录因子Os11g39000的功能研究作者：刘选明 彭玉冲 杨远柱 李懿星夏妙林 王文文林建中来源：《湖南大学学报·自然科学版》2016年第06期摘要：水稻Os11g39000 为非典型的bHLH家族成员，其功能尚不清楚.酵母双杂交实验表明，转录因子Os11g39000可以形成同源蛋白聚合体.随机结合位点筛选实验表明，转录因子Os11g39000可以与DNA结合，并且其结合位点初步确定为TT/CG/CACC/GT/C.Os11g39000基因的组织表达模式分析发现，Os11g39000基因主要在叶片和根中表达，推测该基因可能在叶和根的发育调控中发挥作用.水培实验发现，该基因功能缺陷型转基因株系的根长显著短于野生型，表现出明显的根部发育缺陷，表明Os11g39000在水稻根的发育中起调控作用.QPCR 分析进一步证明，功能缺陷型转基因植株体内生长素合成和信号转导相关基因表达量显著上升，表明转录因子Os11g39000参与了水稻生长素的合成和信号转导的调控.关键词：水稻；bHLH转录因子；Os11g39000；生长素中图分类号：S601 文献标识码：A转录因子（tarnscription factor， TF）是能够与目的基因上游特定DNA序列结合的蛋白质，又被称为反式作用因子，通过与顺式作用元件相互作用，从而保证目的基因以特定强度在特定时间与空间表达的蛋白质分子[1].bHLH（basic HelixLoopHelix，碱性螺旋环螺旋）转录因子是真核生物蛋白质中的一个大家族，其成员在动植物界行使着多种重要的功能.例如，一个bHLH蛋白BPEp可以通过与生长素应答因子ARF8相互作用调控拟南芥花蕊的早期发育[2].研究发现bHLH在光敏色素的信号转导，细胞分化，应答油菜素内酯的基因表达等过程中都起着重要作用[3-5].典型的bHLH结构域包含大约60个氨基酸，由位于bHLH结构域N端能够结合DNA的basic区域和HLH区域组成[6].HLH区域包含两个α螺旋，通过它们bHLH蛋白可以相互作用，形成同源或者异源蛋白聚合体[1， 7-8].一类以人类Id蛋白为代表缺少basic区域的HLH 蛋白虽然不能够与DNA直接相互作用，但是可以通过与其它bHLH蛋白的HLH区域形成特异的异源蛋白聚合体来抑制相应bHLH转录因子的活性[9-10].通过抑制像E这样的bHLH蛋白，从而在细胞分化和发育过程中起到关键作用[11].在拟南芥中，发现一个HLH蛋白KIDARI，通过与一个在光调控过程中起作用的bHLH转录因子相互作用来抑制该转录因子活性，从而调控植物生长发育[12].随着水稻全基因组测序的完成，利用生物信息学分析发现，水稻中包含有167个bHLH转录因子，绝大多数成员功能未知.有研究表明，bHLH家族在水稻生长发育过程中起着关键作用，如Zhang[13]等发现一对参与BR下游的bHLH基因ILI1和PRE1可以通过形成异源二聚体的形式参与调控与BR相关的基因的表达.ili1的水稻突变体表现出与使用BR处理时相同的叶片倾角的表型，过表达和RNA干扰的ILI1转基因水稻株系都分别表现出了叶片倾角增加和减小的相反表型.ILI1和PRE1的相互作用导致了水稻叶片的直立.因此该家族蛋白功能的揭示将有助于丰富和完善水稻基因功能调控网络.本研究选取了一个水稻非典型的bHLH基因家族成员Os11g39000 基因进行了初步的功能研究，发现转录因子Os11g39000可以以同源蛋白聚合体的形式结合DNA，从而实现生长素（IAA）信号转导，调节下游基因的表达，最终实现对水稻根部生长发育的调控.1材料与方法1.1生物信息学分析利用TIGR（http：///tgi， Rice Genome Annotation Project）和NCBI （http：//， National Center for Biotechnology information）数据库获得Os11g39000全长CDS序列、氨基酸序列及启动子序列.通过基于隐马科夫模型的蛋白质结构域分析数据库SMART（http：//smart.emblheidelberg.de， Simple Modular Architecture Research Tool）对Os11g39000氨基酸序列比对分析，获得Os11g39000蛋白的结构域类型.同时，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）数据库对Os11g39000起始密码子ATG上游1 500 bp的启动子序列进行分析，预测该基因启动子区域所存在的调控元件，根据调控元件推测其可能的调控途径.1.2载体构建与功能缺陷型转基因株系的获得以粳稻品种日本晴的cDNA为模板，利用Gateway方法，设计含有attB接头的引物（F：5'CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGTCGAGCCGGCG3'； R：5'CAAGAAAGCTGGGTCTTACATGAGTAGGCTACGGATGAGG3'），PCR克隆目的片段.PCR反应程序为：98 ℃， 5 min；98 ℃，10 s；58 ℃，15 s；72 ℃，20 s；共35个循环.利用BP ClonaseII （Invitrogen）经BP重组反应将PCR产物克隆到入门载体pDONR/Zeo，测序正确后，利用LR ClonaseII （Invitrogen）将Os11g39000克隆到玉米Ubiquitin启动子驱动表达的pCAMBIA1301GWEAR表达载体中，得到N端添加转录抑制基序EAR的合成型转录因子[14]，并抑制目标转录因子的转录活性.根据林建中等的水稻转化方法[15]，将重组的pCAMBIA1301GWEAROs11g39000质粒经过电击法转入农杆菌，通过农杆菌侵染水稻粳稻品种Kitaake的愈伤组织，获得功能缺陷型转基因株系Ubi：：EAROs11g39000.1.3酵母双杂交pGADT7Os11g39000重组质粒能够编码融合Os11g39000和GAL4激活域的蛋白，pGBKT7Os11g39000重组质粒能够编码融合Os11g39000和GAL4结合域的蛋白，将两个重组质粒按照酵母手册进行酵母转化，涂布于SD/Leu/Try平板上培养.28 ℃培养2～3 d，挑选4～5个单克隆用无菌水混匀后涂布于SD/Leu/Try/His平板上，分析结果.为了进一步检测相互作用的真实性，同时参照COLONTECH说明书进行滤纸显色实验.1.4蛋白表达和随机结合位点筛选根据Liu等[14]的蛋白诱导纯化方法，分别将pGEX4T1Os11g39000和pGEX4T1质粒转入大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达.离心收集菌体，超声破碎，离心，谷胱甘肽琼脂糖珠（Ferments）亲合纯化蛋白，SDSPAGE检测.将已纯化的重组蛋白保存，用于后续随机结合片段筛选实验.根据Blackwell的方法[16]，使用引物RBSS4和CPDF4进行PCR扩增，得到双链随机DNA片段并与结合目的蛋白的谷胱甘肽琼脂糖珠室温孵育10 min.使用DNA结合缓冲液洗涤离心，重复5次，最后加入30 μL蛋白洗脱缓冲液，洗脱后离心取上清为模板，PCR扩增目的片段，正向引物为RBSS3，反向引物为CPDF4，琼脂糖凝胶电泳观察结果.重复6～8次，直到扩增出目的条带，然后将扩增片段克隆至pMD18T载体（TaKaRa），测序.测序结果使用在线分析工具分析（http：///）.引物见表1.1.5植物材料种植、激素处理及取材设置参照Lin等[17]水稻种子催芽及种植方法，用3%次氯酸钠溶液对水稻种子表面消毒，37 ℃下种子吸胀处理48 h，28 ℃恒温培养箱催芽48 h.待种子露白后，用1∶1 000浓度的潮霉素（Hyg）溶液对种子进行初筛，然后将阳性植株转入1/2 MS培养液置于恒温培养箱中（28 ℃，光照16 h/黑暗8 h）.参照Song等[18]检测基因时空表达的取材方法，分别对营养生长期和生殖生长期的水稻材料进行取材.营养生长期的水稻材料取自温室生长20 d的野生型水稻日本晴，分别取根、茎和叶3部分；生殖生长期的水稻材料取自大田内灌浆时期的野生型水稻日本晴，分别取根、茎、叶、节间、叶鞘和幼穗等组织材料.液氮速冻，-80 ℃低温保存.参照Li等[19]植物生长素诱导基因表达检测的方法，将正常条件生长10 d的日本晴幼苗，转入含有10 μmol/L生长素的水培溶液中，分别处理0，1，3，6和12 h并取材，-80 ℃保存.设置生长素浓度梯度为0，10-8，10-7，10-6和10-5 mol/L分别处理野生型材料Kitaake和功能缺陷型转基因材料，处理7 d后观察表型并统计分析.1.6实时荧光定量PCR分析按照RNAeasy Mini Kit （TaKaRa）试剂盒说明提取总RNA，然后利用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit （TaKaRa）合成cDNA，用于实时定量PCR分析.利用Ferments 定量试剂盒（Ferments），Mx3000P仪器（Stratagene）进行PCR分析.实时荧光定量PCR反应程序为：95 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；45个循环.实验重复3次，以持家基因OsACTIN1为内参，Mx3000P软件分析检测基因的相对表达水平.定量PCR引物见表2.2结果2.1生物信息学分析与基因克隆根据TIGR和NCBI数据库的序列信息，设计引物，以水稻cDNA为模板克隆出和预测分子量大小相似的DNA片段（图1（a））.测序发现该片段的序列和数据库中预测相同，命名为Os11g39000.该基因的编码序列含有306个核苷酸，编码含102个氨基酸序列的蛋白质.利用蛋白质结构域分析数据库SMART对Os11g39000蛋白结构进行分析，发现Os11g39000蛋白在第19～63个氨基酸区域包含一个HLH保守结构域（图1（b）），但是并没有结合DNA的basic 区域，因此Os11g39000是一个非典型的bHLH蛋白，单个的Os11g39000蛋白不能够直接结合DNA片段.有研究表明bHLH蛋白可以通过HLH结构域形成同源或异源聚合体行使功能[7-8].因此推测该蛋白可能是以蛋白聚合体的形式行使功能.2.2Os11g39000蛋白与自身的相互作用为了探究该编码蛋白能够形成同源蛋白聚合体，进行了酵母双杂交实验.首先构建了pGADT7Os11g39000重组质粒和pGBKT7Os11g39000重组质粒，然后将重组质粒共转入AH109酵母中，同时用共转pGADT7Os11g39000/pGBKT7，pGADT7/ pGBKT7Os11g39000和pGADT7/pGBKT7载体的酵母作为阴性对照，涂布于含有10 mmol/L 3AT的SD/Leu/Try固体平板，以及于含有10 mM 3AT的SD/Leu/Try/His固体平板.结果显示只有共转入pGADT7Os11g39000/ pGBKT7Os11g39000的酵母在含有10 mmol/L 3AT的SD/Leu/Try/His固体平板上继续生长.滤纸显色实验也发现只有共转入pGADT7Os11g39000和pGBKT7Os11g39000重组质粒的酵母可以显色（图2（a）），说明Os11g39000蛋白可以形成同源蛋白聚合体.2.3Os11g39000蛋白的DNA随机结合位点筛选酵母双杂交实验证明Os11g39000蛋白可以形成同源蛋白聚合体，为了进一步验证Os11g39000蛋白形成的同源蛋白聚合体是否可以与DNA直接相互作用，构建了pGEX4T1Os11g39000重组质粒.将重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌BL21（DE3）并成功诱导纯化了GSTOs11g39000重组蛋白（图2（b））.DNA随机结合位点筛选实验.结果显示，该蛋白可以通过形成同源蛋白聚合体与DNA片段直接相互作用，且直接结合的DNA片段为TT/CG/CACC/GT/C（图2（c））.表明该蛋白可以通过HLH区域相互作用形成同源蛋白聚合体结合特定DNA片段，从而行使调控下游基因表达的功能.2.4Os11g39000在水稻不同组织器官中的表达基因的时空表达模式可以为预测和研究其生物学功能提供参考依据.实时定量PCR分析Os11g39000基因在水稻不同组织器官中的相对表达量，表明该基因在苗期和抽穗期都主要在叶和根表达，其它的组织器官表达量极少（图3（a），（b）），推测该基因可能参与植物根和叶的生长发育调控.2.5转基因植物鉴定与表型分析利用嵌合抑制因子基因沉默技术[14，20]（chimeric repressor genesilencing technology CREST）及Gateway技术获得了pCAMBIA1301GWEAROs11g39000重组质粒（图4（a））.通过农杆菌侵染水稻Kitaake愈伤组织的方法，得到Os11g39000转录抑制型的转基因株系，即该转录因子的功能缺陷型转基因株系.通过DNA和RNA水平上的分子鉴定（图4（b），（c）），筛选出2个阳性功能缺陷型转基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011.水培实验表明，转基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011的根长比野生型的短，表现为明显的根部发育缺陷（图4（c），（d））.该结果表明，当抑制Os11g39000的转录活性时严重干扰了水稻根部的正常生长发育，说明Os11g39000基因参与了水稻根部发育的调控.2.6生长素对Os11g39000的表达调控研究表明，生长素对植物根部发育具有显著影响[21].利用Plant CARE数据库对Os11g39000基因起始密码子ATG上游1 500 bp的启动子序列进行分析，发现该基因启动子-792 bp处含有一个生长素应答元件（图5（a）），推测该基因功能可能与生长素有关.实时荧光定量PCR分析表明，随着生长素处理时间的延长，该基因表达量持续升高（图5（b）），表明该基因表达受到生长素诱导.同时，不同浓度生长素对野生型Kitaake和转基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011处理7 d发现，随着生长素浓度的升高，野生型根长受到明显抑制，而转基因株系根长没有明显变化（图5（c），（d）），表现为对生长素不敏感，即抑制转录因子Os11g39000的转录活性干扰了植物对生长素的响应，暗示该基因参与了生长素的相关途径.为了进一步探究该基因对生长素生物合成、信号转导和极性运输途径的影响，选取这些途径中的相关基因，检测其表达量.结果表明，在功能缺陷型转基因株系中，生长素信号转导相关基因OsARF23，OsARF24和生长素合成相关基因OsYUCCA1，OsYUCCA4的表达量显著提高（图6（a），（b））；生长素极性运输相关基因OsPIN1b和OsPIN2表达量没有明显变化（图6（c））.该结果说明，Os11g39000基因的功能缺陷主要影响了生长素的信号传导和生物合成途径，而对于生长素的极性运输并没有显著影响，推测Os11g39000参与了生长素合成与显著信号转导的调控.3讨论bHLH蛋白通常通过HLH区域相互作用形成同源或异源蛋白聚合体行使对下游基因的调控[8].本研究发现，Os11g39000蛋白不能直接结合DNA的basic区域（图1（b）），但Os11g39000蛋白可以通过形成同源蛋白聚合体来直接结合DNA片段，从而调控下游基因表达（图2（a）～（c））.同时通过DNA随机结合位点筛选实验分析了该基因的直接DNA结合位点TT/CG/CACC/GT/C（图2（c）），为深入研究Os11g39000蛋白的生理功能提供了重要线索.分析基因在植物不同组织器官中的表达可以对该基因行使的功能进行预测[22].通过QPCR 分析发现Os11g39000基因主要在水稻叶和根中表达（图3（a），（b）），暗示该基因可能参与植物叶和根的发育.水培实验发现，功能缺陷型转基因株系的根相对于野生型明显变短（图4（d），（e）），证实了该基因在根发育过程中起作用.但叶片中我们没有发现明显差异，对于该结果还有待进一步研究.bHLH基因家族在动植物界广泛存在且行使多种多样的功能，已知 PIF3，PIF4，HFR1在光敏色素信号传导中起作用，SPT和ALC与雌蕊发育有关，AMS在花粉粒发育中起作用，AtMYC2与脱落酸诱导的基因表达有关[23].植物激素是调控植物生长发育的重要因子.生长素影响植物生长发育的各个方面，包括细胞分裂与生长，细胞分化，顶端优势，根的向地性等[24].本研究通过Plant CARE对Os11g39000基因的启动子顺式元件进行分析，结果显示该基因启动子区域存在生长素响应元件（图5（a））.Os11g39000基因的表达受到生长素诱导并且随着生长素处理时间的延长，该基因的表达量显著提高（图5（b））.不同浓度的生长素对转基因株系处理发现其根长对生长素不敏感（图5（c），（d）），说明该基因的表达受到生长素的调控.为了进一步研究该基因对生长素途径的影响，对功能缺陷型转基因株系中生长素的相关基因进行定量分析，发现与生长素信号转导和合成相关的基因表达量显著提高（图6（a），（b）），表明抑制转录因子Os11g39000的转录活性主要影响了生长素的信号转导和合成途径.这些结果表明，Os11g39000是生长素对植物调节途径中的相关基因，为进一步阐明Os11g39000的作用机理奠定了良好的基础.参考文献[1]MURRE C， MCCAW P S， BALTIMORE D. 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