siRNA干扰常见问题

sirna干扰原理
sirna干扰原理是一种利用小分子rna来抑制目标基因表达的方法。

sirna是一种由21-23个核苷酸组成的双链rna分子，它能
与目标基因的mRNA相互作用，导致mRNA降解或抑制转录，从而阻止目标基因的表达。

sirna干扰的过程可以分为三个主要步骤：选择合适的sirna序列、转染sirna到细胞中以及sirna与目标基因mRNA的相互
作用。

首先，为了选择合适的sirna序列，需要找到目标基因mRNA
上的特定区域，该区域的序列将与sirna形成互补配对。

这样，sirna可以与目标基因mRNA结合并形成稳定的双链结构。

其次，将设计好的sirna序列通过转染等方法引入细胞内。

一
般来说，sirna通常会与转染试剂结合形成复合物，以提高
sirna进入细胞的效率。

最后，一旦sirna进入细胞内，它会与目标基因mRNA发生互
补配对，形成sirna/mRNA复合物。

这个复合物会被RNA内
切酶识别并降解，或者阻止目标基因mRNA进行翻译和转录
过程，从而最终抑制目标基因的表达。

总的来说，sirna干扰原理是通过将特定的小分子rna序列引入细胞内，与目标基因mRNA相互作用，从而抑制目标基因的
表达。

这种方法在基因功能研究、治疗疾病以及生物技术等领域都有广泛的应用潜力。

ＯＥ－１９
Ｌ／Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ，Ｑｉｕ
Ｚｉｄａｎ，Ｐａｎ Ｄｉｎｇｌｏｎｇ，Ｚｈｕａｎｇ Ｌｉｚｈｅｎ，Ｃａｉ
Ｌｙｕｊｕａｎ，Ｓｕ
Ｙｉｎｇ，Ｚｏｕ Ｃｈａｎｇｙａｎ
ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｊｉａｎ ３５００１４，Ｃｈｉｎａ
至ＰＶＤＦ膜上．用３％ＢＳＡ封闭蛋白１ ｈ。一抗４℃
摇床孵育过夜，二抗室温摇床孵育１ ｈ。使用ＥＣＬ 化学发光试剂于暗室中曝光显影８
ｍｉｎ。
６．ＣＣＫ８法检测转染对细胞增殖影响：取指数生 １．细胞系和主要试剂：Ｅｃａｌ０９、ＯＥ．１９细胞购自 中国科学院上海细胞研究所。常规培养于３７℃、 ５％ＣＯ，浓度的恒湿培养箱中。ＲＴ．ＰＣＲ试剂盒购于
【摘要】
目的探讨ｓｉＲＮＡ干扰ＥＧＦＲ表达对食管鳞癌和腺癌放射敏感性的影响。方法
以
食管鳞癌、腺癌细胞系ＥＣａ．１０９、ＯＥ一１９作为研究对象。脂质体转染化学合成的不同ＥＧＦＲ—ｓｉＲＮＡ和 阴性一ｓｉＲＮＡ，通过ＲＴ—ＰＣＲ及蛋白印迹法检测转染前后ＥＧＦＲ表达情况，ＣＣＫ８法分析转染对细胞增 殖活性影响。设ＥＣａ．１０９、ＯＥ．１９细胞空白对照组（Ｏｌ、０２组）、单纯照射组（Ｒｌ、Ｒ２组）及ＥＧＦＲ． ｓｉＲＮＡ照射组（Ｅ．Ｒ１、Ｅ．Ｒ２组），单次照射０、２、４、６、８ Ｇｙ。克隆形成实验计算细胞存活分数及放射增 敏比（ＳＥＲ肿僖比），流式细胞仪检测ＥＧＦＲ．ｓｉＲＮＡ联合放射对细胞周期分布和细胞凋亡率影响，单次照 射６ Ｇｙ。结果ＥＧＦＲ—ｓｉＲＮＡ可明显下调两种细胞ＥＧＦＲ表达，且转染对细胞增殖抑制率＜５％ （４．９％、４．５％）。克隆形成实验结果显示Ｅ—Ｒ１、Ｅ—Ｒ２组细胞ｓＦ值低于０１、０２组，ＳＥＲ。）ｆ直比分别为 １．４０、１．０ｌ。流式细胞术结果显示Ｅ．Ｒ１组比Ｅ．Ｒ２组照后Ｇ，＋Ｍ期比例增加、ｓ期比例下降（Ｐ＝ ０．０１６、０．０２８），细胞凋亡率也增高（Ｐ＝０．００７）。结论与食管腺癌细胞相比，干扰ＥＧＦＲ表达显著提 高了食管鳞癌细胞的放射敏感性。

RNA干扰技术的实验技巧与常见问题解答RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种重要的分子生物学研究技术，广泛应用于基因功能分析、疾病治疗等领域。

在RNA干扰实验中，研究人员可以通过引入特定的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或微小核糖核酸（microRNA，miRNA）来抑制或沉默目标基因的表达。

本文将介绍RNA干扰实验的一些关键技巧，并回答一些常见问题，旨在帮助读者更好地开展RNA干扰实验。

一、实验技巧1. 选择合适的靶基因和控制组在进行RNA干扰实验之前，首先需要确定要研究的靶基因。

该靶基因最好具有研究价值，并且对其功能了解较少。

同时，为了验证RNA干扰的特异性和效果，还需要设计合适的阴性对照组和阳性对照组。

阴性对照组可选择与靶基因序列无关的小干扰RNA或一个无关的基因作为靶点；阳性对照组则可选择确切知道RNA干扰会对其表达产生影响的基因。

2. 合理设计siRNA或miRNA序列在设计干扰序列时，可使用在线生物信息学工具或商业公司提供的设计工具，遵循以下原则：a）长度通常为19-23个核苷酸，一般选择21个核苷酸长度；b）确保序列中包含稳定的核苷酸序列，以提高干扰效果；c）避免序列与其他基因有任何类似区域，以确保干扰的特异性。

3. 选择适当的转染试剂与条件RNA干扰实验中常用的转染试剂包括化学法、电转法和病毒载体转染法。

在选择转染试剂时，需根据实验的需求和细胞类型进行选择。

另外，转染条件的优化也很关键，如浓度、时间和转染温度等，可对不同细胞类型进行优化。

4. 时间点和干扰效果的监测RNA干扰的效果通常在转染后24-72小时达到峰值，但不同细胞类型和靶基因可能有所不同。

因此，在进行RNA干扰实验时，需对不同时间点进行监测，以确定最佳时间点。

常用方法包括荧光显微镜观察siRNA或miRNA的共转染效率、Western blot或RT-qPCR检测蛋白质或基因的表达水平。

sirna干扰原理Sirna（small interfering RNA）是一种干扰RNA，它可以通过靶向特定的mRNA分子来抑制基因表达。

Sirna干扰技术在基因沉默和功能研究中具有重要的应用价值。

本文将介绍Sirna干扰的原理及其在生物学研究中的应用。

Sirna干扰的原理主要包括三个步骤，合成、靶向和介导。

首先，Sirna分子由双链RNA组成，可以通过化学合成的方法获得。

其次，Sirna通过其特定的序列可以与靶向的mRNA分子形成互补配对，从而导致mRNA的降解或翻译的抑制。

最后，Sirna需要介导蛋白来帮助其与靶向mRNA结合，并将其导入RNA诱导靶向基因沉默复合物（RISC）中，从而实现对基因表达的干扰。

在生物学研究中，Sirna干扰技术被广泛应用于基因功能研究、药物靶标筛选和疾病治疗等领域。

首先，通过设计特定的Sirna序列，研究人员可以选择性地抑制目标基因的表达，从而揭示其在细胞生物学过程中的功能。

其次，Sirna干扰技术可以用于筛选潜在的药物靶标，通过观察靶向基因的沉默对细胞表型的影响，来评估潜在药物的疗效和副作用。

此外，Sirna还可以作为一种治疗手段，用于治疗一些基因相关的疾病，如癌症和遗传性疾病。

总的来说，Sirna干扰技术具有高度的选择性和特异性，可以有效地抑制目标基因的表达，为基因功能研究和药物开发提供了有力的工具。

随着技术的不断发展，Sirna干扰技术在生物学研究和临床应用中的作用将会更加突出，为人类健康和疾病治疗带来新的希望。

在实际应用中，研究人员需要根据具体的研究目的和样本特点来设计合适的Sirna序列，并选择合适的转染方法将其导入到细胞内。

此外，还需要对靶向基因的沉默效果进行验证，以确保实验结果的可靠性。

在临床应用中，研究人员需要克服Sirna的稳定性和递送效率等方面的挑战，以实现其在治疗疾病中的应用。

综上所述，Sirna干扰技术作为一种强大的基因沉默工具，在生物学研究和临床应用中具有重要的意义。

siRNA干扰载体构建与引物设计的一些小建议siRNA干扰载体构建过程中，针对siRNA设计的引物是怎么设计的?
一般是合成一对引物，然后退火，再与线性化的载体做连接。

由于引物比较长，所以合成
时一般都会有比较多的碱基突变，因此，做shRNA表达载体构建的主要难度，在于筛选出正确
的克隆，有时候可能要选很多个克隆测序才能筛到想要的。

具体的序列组成，一般是sense-
loop-antisense。

不同的公司会有不同的设计原则的。

经验：我们一般不去考虑构建载体来得到siRNA！载体表达siRNA方法主要存在以下缺
点： 1、外源导入shRNA的表达会干扰细胞本身miRNA的正常表达，而miRNA在基因的精确表
达调控方面有着至关重要的作用，目前已经证实很多疾病的产生通miRNA的表达异常存在确切
关系，已有很多文献报道和证实； 2、载体构建的周期长，操作较为复杂，试验重复性不好，
做过的人应该大多都知道； 3、载体用于体内试验的毒性非常大，容易激发机体强烈的免疫应
答反应，副作用大，已有多篇文献证实； 4、通量低，影响因素更多，体内试验的效果很差，
存在安全性的问题； 5、shRNA的表达在时间和表达量上都较难控制等。

这也是为什么现在
10多种进入临床试验的RNAi药物几乎都是用化学合成的siRNA来做的原因！。

siRNA转染常见问题及解决方案1. RNA与转染试剂比例不佳由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。

RNA浓度和转染试剂量的优化(24well)1 2 3 4RNA工作25nM 50nM 100nM 150nM浓度每孔RNA0.17μg(12.5pmol)0.33μg(25pmol)0.67μg(50pmol)1μg(75pmol)的量(pmol)每孔转0.25μl0.5μl1μl 1.5μl染试剂量2. 细胞密度不佳调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。

成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高。

由于siRNA沉默时效性的影响，转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测，转染后48-72小时才能进行蛋白检测。

如果转染时铺板密度较高，细胞一方面转染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，48小时甚至更长时间后，沉默检测最佳点时，过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。

3. RNA效率不高选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。

siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。

siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。

建议一定进行相关的预实验优化各条件。

4. RNA酶污染建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。

5. 转染后培养时间不够在mRNA水平可以到48小时以后验证结果，在蛋白水平可以到72小时后验证结果。

siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。

sirna干扰原理
sirna是small interfering RNA的缩写，是一种功能性RNA分子，通过降解或抑制特定基因的表达来干扰基因功能。

sirna
干扰的原理主要包括三个步骤：
1. 制备sirna：sirna是由21-23个核苷酸组成的小分子RNA，
可以由体内或体外合成。

通常使用合成的单链RNA，并使用
特定酶进行降解，获得双链sirna分子。

2. 靶向特异性基因：为了使sirna能够特异性地干扰目标基因，需要对目标基因进行序列特异性设计。

sirna的两个链，即导
引链和非导引链，会与靶基因的mRNA序列互补配对。

3. RNA干扰效应：当sirna与靶基因的mRNA配对后，可以
通过两种方式干扰目标基因的功能。

- 解旋和降解：sirna可以与RNA诱导的靶基因降解酶（RISC）结合，形成RNA酶复合体。

该复合体能够通过降解
靶基因的mRNA分子，从而阻止靶基因的翻译和表达。

- 抑制翻译：sirna也可以通过与靶基因的mRNA配对，阻止
其翻译为蛋白质。

sirna结合到mRNA上后，可以阻断转录过
程中的酶或蛋白质结合，从而抑制翻译的进行。

总结来说，sirna干扰的原理是通过合成特异性的小分子RNA，与靶基因的mRNA相互作用，从而降解或抑制目标基因的表
达。

这一技术在基因功能研究和治疗疾病中具有广泛应用的潜力。

siRNA干扰Rac1表达对人晶状体上皮细胞增殖和迁移能力的影响目的研究Rac1对人晶状体上皮细胞SRA01/04增殖和迁移能力的影响，探究Rac1在后囊下混浊及囊袋皱缩综合征发生、发展过程中的作用。

方法将SRA01/04细胞分为Mock组和siRac1组，构建Rac1相关siRNA并瞬时转染于siRac1组细胞中，Western blot检测Rac1蛋白表达的变化，CCK检测细胞生长周期的变化，流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡变化，Transwell检测Rac1对细胞迁移能力的影响。

结果两组72 h时吸光度值均高于24 h（P < 0.05），siRac1组48、72 h时吸光度值均低于Mock组（P < 0.05）；与Mock组比较，siRac1组mRNA和蛋白相对表达量明显降低，G1期细胞所占百分率明显增高，S期细胞所占百分率明显降低，穿越基质膜的细胞数明显减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

F-actin染色结果显示，siRac1组细胞的伪足形成能力较Mock组减弱。

结论Rac1可能通过调节晶状体上皮细胞的增殖能力和迁移能力，影响后囊下混浊及囊袋皱缩综合征的发生、发展。

[Abstract] Objective To study the effect of Rac1 on the proliferation and migration of human lens epithelial cells SRA01/04，and to explore the role of Rac1 in the development and progression of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome. Methods SRA01/04 cells were divided into mock group and siRac1 group. Rac1-related siRNA was constructed and transiently transfected in siRac1 group cells. Western blot was used to detect the changes of Rac1 protein expression，CCK was used to detect the changes of cell growth cycle，flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis，Transwell was used to detect the effect of Rac1 on cell migration ability. Results The absorbance values of the two groups at 72 hours were higher than those at 24 hours （P < 0.05），the absorbance values of siRac1 group at 48，72 hours were lower than those of mock group （P < 0.05）. Compared with mock group，the relative expression of mRNA and protein in siRac1 group decreased significantly，the percentage of G1 phase cells increased significantly，while the percentage of S phase cells decreased significantly，the number of cells passing through the membrane reduced significantly，the differences were statistically significant （P < 0.05）. F-actin staining showed that the forming ability of pseudopodium in siRac1 group was significantly weaker than that of mock group. Conclusion Rac1 may affect the occurrence and development of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome through adjusting the proliferation and migration of lens epithelial cells.[Key words] Posterior capsular opacities；Capsular contraction syndrome；Rac1；Lens；Epithelial cells后囊下混濁（posterior capsular opacities，PCO）和囊袋皱缩综合征（capsular contraction syndrome，CCS）是白内障超声乳化术后常见并发症，其发生与发展均与白内障术后残留晶状体上皮细胞的增殖与迁移有关[1-2]。

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1.需要短期抑制还是长效抑制?
1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省 时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作 用的时间到2周。
2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较 好，效应持续时间长。
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2. 采用SIRNA进行实验的途径
(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最 方便，成本高，适用于长期使用特定siRNA
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4.哺乳动物系统的RNAI实验
通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基 因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞 的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验 可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转 染获得超过1周的基因表达抑制时间。 通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的 基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择 shRNA表达载体较为合适。
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5.RNAI效应表现
RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和 蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学 方面表现。
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第二部分 哺乳动物系统的RNAI实验设计
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主要内容
1. 需要短期抑制还是长效抑制? 2. 采用siRNA进行实验的途径 3. 构建shRNA表达载体进行实验 4. siRNA设计需要注意的问题 5. 脱靶效应 6. 转染是RNAi实验的瓶颈
RNAI和 SIRNA转染
精品文档1内容来自第一部分 RNAi实验基本概念 第二部分 RNAi实验具体设计 第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答
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第一部分 RNAI实验基本概念

siRNA转染实验是一种常用的基因沉默技术，其基本原理是通过将小干扰RNA（siRNA）引入细胞，从而在翻译水平上抑制特定基因的表达。

以下是siRNA转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、实验原理siRNA是一种21-23个核苷酸长的双链RNA，它与靶基因的mRNA 序列互补，通过碱基配对原则与mRNA结合，抑制基因表达。

siRNA 转染实验是通过将siRNA转入细胞内，利用细胞内自然存在的RNA 干扰机制，在转录后水平抑制基因表达。

这种技术具有高效性、特异性和可逆性等特点，被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病治疗等领域。

二、所需试剂和耗材1.试剂：o siRNA：针对特定基因的siRNA分子。

o转染试剂：如Lipofectamine、JetPrime等，用于将siRNA转入细胞。

o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。

o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。

o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。

2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。

o离心管：用于离心和分离细胞。

o移液器及枪头：用于精确加样。

o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。

o无菌水：用于稀释和配制溶液。

三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。

2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。

3.水浴锅：用于加热溶液。

4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。

5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。

6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。

7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。

8.显微镜：观察细胞的生长状态和siRNA转染后的细胞变化。

9.细胞计数板或细胞计数仪：用于细胞计数，确定细胞的密度和生长状态。

10.酶标仪或多功能读板仪：用于检测细胞因子的浓度。

四、实验准备工作1.确认细胞系和siRNA：实验前要明确所使用的细胞系以及针对的目标基因。

引言概述：siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA片段，具有靶向特异性和高效沉默靶基因的能力。

本文将详细介绍siRNA的使用说明，主要包括siRNA的设计、转染方法、转染效率的评估、靶基因沉默效果的验证以及操作注意事项。

通过本文的阐述，用户能够更好地了解和掌握siRNA的使用方法，从而实现对目标基因表达的特异沉默。

正文内容：一、siRNA的设计1.确定靶基因：首先需要明确自己要沉默的目标基因，可以通过文献调研、数据库查询等方式确定目标基因。

2.设计siRNA序列：根据目标基因的序列信息，可以使用在线工具或者软件进行siRNA序列的设计。

siRNA的设计需要满足一定的规则，如目标序列的选择、GC含量、二次结构等方面的考虑。

二、siRNA的转染方法1.载体选择：siRNA可以通过多种载体转染到细胞内，如质粒转染、病毒载体转染等。

根据实验需要和细胞特性，选择适合的转染载体。

2.转染试剂：根据实验需要，选择适合的转染试剂，如化学转染试剂、电穿孔法等。

3.转染条件优化：对于每个细胞系和siRNA，转染条件需要进行优化，包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等。

三、siRNA转染效率的评估1.转染效率的检测：可以通过荧光探针标记siRNA，利用荧光显微镜观察转染效率。

2.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，来评估siRNA的沉默效果。

3.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来评估siRNA的沉默效果。

四、靶基因沉默效果的验证1.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，可以验证siRNA的沉默效果。

2.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来验证siRNA的沉默效果。

3.功能实验：通过观察细胞的表型变化、增殖能力的变化等方面，来验证siRNA的沉默效果。

五、操作注意事项1.siRNA的保存：应在20°C下保存，避免反复冻融。

2.转染前的细胞处理：细胞的状态和密度对转染效率有影响，应注意细胞的处理方法和细胞密度的选择。

ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．．Ｉｔｓ ｌｕｎｇ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ ｌａｒｙｎｘ
结论
１、免疫组化ＳＰ法证实ＥＩＦ４Ｇ１的表达与鼻咽癌的发生发展有关系。
２、荧光定量ＰＣＲ法检测ＥＩＦ４Ｇ１在永生化鼻咽上皮细胞ＮＰ６９和鼻咽癌细胞５．８Ｆ、 ６．１０Ｂ、Ｃ６６６．１、ＣＮＥｌ、ＣＮＥ２、ＨＮＥｌ、ＨＯＮＥｌ、ＳＵＮＥｌ中的表达有差异， ５—８Ｆ表达最高。
３、利用慢病毒载体和ＲＮＡｉ技术建立了ＥＩＦ４Ｇ１表达稳定下调的５．８Ｆ细胞株，干 扰后细胞体内、外生物学功能明显改变。
／ｐｓｈＲＮＡ－ＥＩＦ４Ｇ１‘细胞克隆形成减少，５－８Ｆ和阴性对照组差异无统计学意义 （Ｐ－－０．７３２）。综合表明ＥＩＦ４Ｇ１表达干扰后，５．８Ｆ细胞体外生长被显著抑制。
Ⅱｌ
中文摘要 ３）ＴｒａｎｓｗｅＵ小室检测结果显示，与５．８Ｆ和５－８Ｆ／ｐｓｈＲＮＡ细胞相比，５－８Ｆ
／ｐｓｈＲＮＡ．ＥＩＦ４Ｇ１。细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少，差异具有显著性
ａ
ｍｕｌｔｉ—ｓｔｅｐ，ｍｕｌｔｉ—ｓｔａｇｅ，ｍｕｌｔｉ—ｆａｃｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｉｎ
ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ ｋｅｙ ｏｎｃｏｇｃｎｅｓ ａｎｄ
ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ
ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｍ．Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｕｓｅｄ ｅＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ａｍｏｎｇ ＮＰＣ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｐｏｏｌｅｄ ＮＰＣ ｃｅｌｌｓ（５—８Ｆ、６—１０Ｂ
与临床病理分化没有统计学意义（，＝２．５０８，Ｐ＝０．２８５）。

第31卷第4期2009年8月大连医科大学学报Journal of D alian M edical Universit yVo.l31No.4Aug.2009应用siRNA表达框架进行原代细胞RNA干扰的操作方法*孙杰1,张鹏2,姜妙娜1,郭连英1(1.大连医科大学病理生理学教研室,辽宁大连116044;2.大连医科大学中山学院计算机教学中心,辽宁大连116023)摘要:介绍应用s i R NA表达框架对原代培养的细胞进行RNA干扰。

RNA干扰是由双链RNA介导的特异同源靶基因转录后沉默的过程,它已经广泛应用到基因功能研究、基因表达调控机制和抗病毒感染等热门领域,在哺乳动物的原代细胞中进行RNA干扰的研究为功能基因研究提供了重要意义。

si R NA表达框架与脂质体的转染率直接影响RNA干扰的效果,本文介绍了如何设计和构建si R NA表达框架,筛选最佳的靶位点。

关键词:RNA干扰;si R NA表达框架;原代细胞中图分类号:Q31文献标志码:B文章编号:1671-7295(2009)04-0351-04M et hods of i n itiation RNA interference w it h siRNA expressioncassett es in prim ary ce llsS UN Jie1,Z HANG Peng2,JIANG M i a o-na1,GUO Lian-y ing1(1.D epart m ent of Patho phy siology,Dalian M e d ical University,Dalian116044,Ch i n a;2.Co mputer L earn-i n g Center of Zhongs han Co llege,Dalian M ed ical University,D alian116023,China)Abstrac t:To introduce t he process of i n iti ati ng RNA interference m ediated by si R NA expression cassettes i n pr i m ary ce l.l RNA i nte rference(RNA i)is a high l y spec ific for m o f posttranscripti ona l gene sil enci ng m ed i a ted by double-stranded RNA.RNA i has rapidly becom e one of t he m ost pow erful functi onal g eno m ics tools recen tly and has t he potenti a l to be used therapeutica lly.T he degree of s uccess i n silenc i ng a spec ific ta rget RNA i n pri m ary cultured m amm alian ce lls is o ften de-pendent on si R NA or plas m i d transfecti on effi c iency.T his article descri bes ho w to desi gn and synthesize si R NA express i on cassettes and,add iti onall y,fi nd the opti m a l targ et site for RNA i-m ediated g ene sil enci ng.K ey word s:RNA i nterfe rence;si RNA expressi on cassettes;pri m ary ce llRNA干扰是由双链RNA介导的特异同源靶基因转录后沉默的过程。

吉玛公司提供的siRNA是双链的还是单链的？吉玛公司的siRNA是双链的,而且也是按照双链来定价的。

吉玛公司RNA寡核苷酸使用什么纯化方法？吉玛公司运用国际上通用的HPLC纯化，如果特殊需要可以进行PAGE纯化。

合成RNA寡核苷酸的最大长度是多少？目前RNA寡核苷酸的最大长度是40碱基。

我们需要提供什么信息用于siRNA的合成？你们可以帮助免费设计吗？您需要准确地提供siRNA的19个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供相应地基因的GeneID 或者Accession Number，由我们公司技术人员为您免费设计。

如何选择siRNA的悬垂组成？悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。

最近研究表明悬垂的组成在mRNA靶识别和酶解中不是很重要。

悬垂可能在形成RISC的过程中起结构的作用。

很多研究人员选择dTdT是因为研究表明脱氧核糖核苷能保护siRNA免受酶解。

合成序列最重要的是确定靶mRNA的19个碱基的核心结构。

针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效？一般siRNA都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。

然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。

你们提供的siRNA是怎样装运的？如果在常温下放置了一个星期，还有效吗？吉玛公司为您提供的siRNA是冻干粉包装的，在常温下运输。

这些冻干的样品在室温下能稳定保存2－4个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。

但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷冻箱中。

在体外实验中，需要多少量的siRNA？我们建议您用于实验的siRNA的浓度为100nM。

1nmol siRNA的量对于一个24孔板或是96孔板的实验已经足够了。

用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗？增加siRNA的浓度一般不能改进沉默效率。

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吉玛公司RNA寡核苷酸使用什么纯化方法？吉玛公司运用国际上通用的HPLC纯化，如果特殊需要可以进行PAGE纯化。

合成RNA寡核苷酸的最大长度是多少？目前RNA寡核苷酸的最大长度是40碱基。

我们需要提供什么信息用于siRNA的合成？你们可以帮助免费设计吗？您需要准确地提供siRNA的19个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供相应地基因的GeneID 或者Accession Number，由我们公司技术人员为您免费设计。

如何选择siRNA的悬垂组成？悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。

最近研究表明悬垂的组成在mRNA靶识别和酶解中不是很重要。

悬垂可能在形成RISC的过程中起结构的作用。

很多研究人员选择dTdT是因为研究表明脱氧核糖核苷能保护siRNA免受酶解。

合成序列最重要的是确定靶mRNA的19个碱基的核心结构。

针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效？一般siRNA都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。

然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。

你们提供的siRNA是怎样装运的？如果在常温下放置了一个星期，还有效吗？吉玛公司为您提供的siRNA是冻干粉包装的，在常温下运输。

这些冻干的样品在室温下能稳定保存2－4个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。

但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷冻箱中。

在体外实验中，需要多少量的siRNA？我们建议您用于实验的siRNA的浓度为100nM。

1nmol siRNA的量对于一个24孔板或是96孔板的实验已经足够了。

用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗？增加siRNA的浓度一般不能改进沉默效率。

RNA干扰常见问题解答SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。

选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。

其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。

针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。

一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。

选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。

脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。

二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。

例如：siRNA与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。

一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。

如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。

三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各种试剂。

可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，50nM，80nM，100nM。

转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。

之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。

如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。

RNA干扰技术的使用中常见问题RNA干扰技术（RNA interference，简称RNAi）是一种基因沉默技术，通过通过特定的RNA分子中的双链部分与靶向基因中对应序列的RNA相互配对，从而抑制该基因的表达。

这一技术在生物学研究和生物医学中有着广泛应用，但在实际应用过程中也面临一些常见问题。

本文将针对RNA干扰技术使用中常见问题进行探讨，以帮助读者更好地理解和应用此技术。

1. 效果不佳在RNA干扰实验中，效果不佳可能是由于多种因素引起的。

首先，RNAi试剂的质量可能会影响干扰效果。

使用质量较低的siRNA试剂或者过期的试剂可能导致低干扰效果。

解决这个问题的方法是选择高质量的RNAi试剂或者及时更新试剂。

其次，对于某些靶向基因，选择合适的siRNA序列也是至关重要的。

设计合适的siRNA序列需要考虑到碱基组成、G/C含量、碱基排列和序列保守性等因素。

可以使用一些在线工具或者专业软件来辅助选择合适的siRNA序列。

2. 靶向效率差RNA干扰试验中，可能会出现干扰效率较低的情况，即所选择的siRNA无法有效地降低靶向基因的表达。

这可能是由于选取的siRNA序列存在缺陷或者其效果受到其他因素的影响。

一种可能的原因是siRNA序列中存在“off-target”效应，即siRNA除了靶向基因外还会干扰其他非靶向基因的表达。

这会导致RNA干扰效应的扩散，从而降低对靶向基因的干扰效率。

在设计siRNA序列时，可以使用一些在线工具来预测和评估其“off-target”效应，以减少这种情况的发生。

此外，RNA干扰试验中，细胞状态和分发方法也可能对靶向效率造成影响。

细胞的状态和传递方法的选择应该根据具体的细胞类型和实验目的进行优化。

确保细胞在最佳状态下进行实验，可以提高靶向效率。

3. 长期效果不稳定在使用RNA干扰技术时，一些实验者可能会发现，所观察到的干扰效果在长期中变得不稳定。

这可能是由于siRNA的代谢和分解，细胞的自我修复机制或靶向基因的表达调控机制的影响。