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活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。
细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。
在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。
死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。
染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
常用的方法包括染色法和仪器分析法。
1 染色法染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。
台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。
所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
甲基蓝有类似的染色机理。
植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。
美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。
细胞生物学实验报告细胞死活鉴定1.实验目的：观察上次实验培养的小鼠脾细胞，掌握细胞死活鉴定的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、血细胞鉴定板、盖玻片、胶头滴管、试管（2）实验药品：蒸馏水、台盼蓝染液、生理盐水、伊红染液（3）实验材料：小鼠脾细胞3.实验原理：（1）活细胞特征：细胞边缘清晰，细胞透明度高，整体立体感强，核区域明显，细胞质内颗粒物质较少，无空泡。
培养数天后，可观察到正在分裂的细胞。
（2）肉眼观察鉴定细胞死活：正常生长的细胞培养液微微发黄，透明度高；如发现培养液微混，则说明细胞量太大需进行传代培养，或者培养液被污染；如果培养液仍呈现清亮的粉红色，则说明细胞未生长。
（3）细胞凋亡特征过程：首先，细胞膜绒毛消失；然后，细胞收缩，细胞核高度浓缩，边缘化；最后，细胞核片段化，形成凋亡小体。
细胞核片段化时，如果对此类细胞进行DNA电泳，则会发现电泳条带呈梯状分布。
（4）细胞死活鉴定方法①染色排除法：细胞死亡后，细胞膜的通透性变大，染料可以通过细胞膜进入细胞。
因此，死细胞可以被染料染色，而活细胞由于细胞膜的选择透过性而呈无色。
②荧光染色法：活细胞需要进行代谢。
将荧光染料与有机分子结合（如二丙酸酯荧光素），使之易穿膜。
在活细胞中这些物质可被分解为荧光染料和有机分子（二丙酸酯和荧光素），在显微镜下观察，细胞被染色。
此种方法中，活细胞被染色，死细胞则呈无色。
（5）血细胞计数板的用法：如果是对比较密的细胞进行计数（如红细胞），则使用中间的中格进行计数，再将所得数值乘以2500，即是每毫升中的细胞数量；如果是对比较稀疏的细胞进行计数（如白细胞），则使用四个角上的大格进行计数，再将所得数值乘以10000，即是每毫升中的细胞数量。
4.实验步骤：（1）台盼蓝染色法：①用生理盐水制成0.4%的台盼蓝溶液备用②取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，加一滴染液，混合。
2 mins 后迅速制成临时装片，镜检。
（2）伊红丫染色法①用生理盐水制成0.15%的伊红染液混合② 2 mins 后制片镜检5.实验结果：视野中活细胞呈无色；死细胞呈蓝色，有些可观察到细胞核；还有少量细胞只有边缘部分呈蓝色。
细胞培养中死活细胞测定及细胞活力测定实验日期：2013-03-12 来源：未知标签：细胞活力测定摘要: 细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。
染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。
这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。
细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。
染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。
这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。
【实验原理】(一)染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在：(1)死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
(2)死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。
常见的细胞染料有：中性红(细胞器的专有染料)、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯(FDA)等。
①中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。
利用细胞膜的通透性差异，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。
中性红无毒，常做活体染色的染料。
②台盼蓝染色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。
③美蓝染色法：美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
小鼠脾脏细胞培养与细胞生死状态的鉴别实验目的1. 学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。
3.学习细胞生死状态鉴别的方法，原理。
实验原理细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在以下差异：一、细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。
基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。
此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。
活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。
二、代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。
基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。
【实验目的】1、回顾细胞培养的有关知识；2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程；5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；7、学习实验过程的详细描述及实验记录。
【实验原理】细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。
小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定山东大学实验报告山东大学实验报告 2013年6月8日姓名陈少坤系年级 2011级生科2班同组者张劲松王洪善科目细胞实验题目小鼠脾细胞原代培养，死活细胞鉴定一、前言细胞培养的概念:多细胞生物的细胞可以被分离出来，然后在体外特殊培养环境中继续存活，并保持其生理、生化特性直接从生物体分离出来，在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞，称为原代培养细胞。
原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，这时就成为继代培养细胞。
细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括 pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。
细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。
细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。
它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。
二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。
超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。
细胞培养特点:大量实验材料单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基易于观察易于操作，改造活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。
细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。
台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞。
因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。
伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。
山东大学实验报告山东大学实验报告二、实验目的回顾细胞培养的有关学习分离小鼠脾细胞的技术学习悬浮细胞的计数学习简单的细胞培养技术学习实验过程的详细描述及实验记录三、实验用品试剂:小鼠，70%酒精，蒸馏水， PBS, 细胞培养液，台盘蓝，伊红溶液仪器解剖盘，镊子，剪子，盖玻片，载玻片，显微镜，吸管，血细胞计数器四、实验步骤一、原代培养1.采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。
2.将小鼠浸泡在 70%酒精中几分钟。
（一）、死活细胞的鉴别生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微镜来观察。
染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。
由于未经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。
所用染料的分类：一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染料才能进入细胞膜。
第一类：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。
它们不容易穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。
如①台盼兰（Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加0.1ml 染液，2 分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。
②苯胺兰(Aniline’ black)：0.05%的苯胺黑以1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。
③伊红Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。
等。
第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯胺蓝等。
它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构专一性的结合。
①1%结晶紫染色生理1%结晶紫盐水与细胞悬液1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成蓝紫色，而死细胞不着色。
属于活细胞染料。
活细胞染料无毒，无物理、化学变化，基本上不影响细胞的生命活动。
②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。
丫啶橙是一种与DNA 和RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发下，DNA 可激发出530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出640nm 的荧光发射峰，它与双链DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链DNA 和RNA 则由静电吸引堆积在磷酸根上。
在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质RNA质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。
活细胞的鉴定在生物学与医学上具有很重要的意义。
细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况,需要经常测定细胞的存活率;在肿瘤细胞的研究中,为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力,也需要测定肿瘤细胞的存活率。
在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用,例如为了检测某一男子的生育能力,测定精子细胞的存活力就是比较常用的办法。
死活细胞的鉴定方法有很多种,常用的有染色法与仪器分析法。
染色法就是常用的细胞死活鉴定方法,简便,易于操作。
但就是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活,实验结果很容易受操作者的主观因素的影响,存在一定的误差,所以,在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理,但无论采用何种办法,都就是利用了死活细胞在生理机能与性质上的差异。
常用的方法包括染色法与仪器分析法。
1 染色法染色法分化学染色法与荧光染色法,根据染色机理的不同,染料或使死细胞着色,或使活细胞着色。
死活细胞在生理机能与性质上的差异主要包括:死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜就是一种选择性膜,对细胞起保护与屏障作用,只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后,细胞膜受损,通透性增加。
常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就就是利用了这一性质。
台盼蓝,又称锥蓝,就是一种阴离子型染料,不能透过完整的细胞膜。
所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色,而活细胞不被着色。
甲基蓝有类似的染色机理。
植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异:就是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。
美蓝就是一种无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色。
由于活细胞中新陈代谢的作用,使细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型,因此美蓝染色后活的酵母细胞无色;而死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们的无还原能力或还原能力极弱,使美蓝处于氧化态,从而被染成蓝色或淡蓝色。
荧光素双醋酸酯(FDA)就是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料,其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异:FDA本身不产生荧光,也无极性,能自由渗透出入完整的细胞膜。
活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。
细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。
在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。
死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。
染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以, 在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
常用的方法包括染色法和仪器分析法。
1染色法染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。
台盼蓝, 又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。
所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
甲基蓝有类似的染色机理。
植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。
美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
荧光素双醋酸酯（FDA是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体FDA本的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。
一、实验目的1. 掌握细胞培养的无菌操作技术。
2. 学习并掌握动物细胞原代培养和传代培养的实验方法。
3. 了解细胞生死状态鉴别的原理和方法。
4. 熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。
二、实验原理细胞培养是指在无菌条件下，将动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞生死状态的鉴别方法主要包括化学染色法和荧光染色法。
活细胞和死亡细胞在生理功能和性质上存在以下差异：1. 细胞膜通透性差异：活细胞的细胞膜具有选择性通透性，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，通透性增加。
2. 代谢差异：活细胞具有正常的代谢活动，而死亡细胞代谢活动停止。
基于以上差异，我们可以通过以下方法鉴别死活细胞：1. 台盼蓝染色法：活细胞不会被台盼蓝染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。
2. 伊红染色法：活细胞不着色，而死细胞会被染成红色。
3. 荧光染色法：活细胞不发光，而死细胞会发出荧光。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：动物细胞培养液、培养皿、移液枪、吸管、显微镜、台盼蓝染液、伊红染液、荧光染液等。
2. 实验仪器：超净工作台、离心机、细胞培养箱、显微镜等。
四、实验步骤1. 取动物细胞培养液，加入适量的台盼蓝染液，混匀后静置5分钟。
2. 用吸管吸取染色的细胞悬液，滴加在载玻片上，盖上盖玻片。
3. 将载玻片置于显微镜下观察，活细胞不着色，而死细胞被染成蓝色。
4. 取动物细胞培养液，加入适量的伊红染液，混匀后静置5分钟。
5. 用吸管吸取染色的细胞悬液，滴加在载玻片上，盖上盖玻片。
6. 将载玻片置于显微镜下观察，活细胞不着色，而死细胞被染成红色。
7. 取动物细胞培养液，加入适量的荧光染液，混匀后静置5分钟。
8. 用吸管吸取染色的细胞悬液，滴加在载玻片上，盖上盖玻片。
9. 将载玻片置于荧光显微镜下观察，活细胞不发光，而死细胞发出荧光。
山东大学实验报告2018年5月21日________________________________________ _________________________姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午科目：细胞生物学实验题目：动物细胞培养及死活细胞鉴别学号：201600140055一、目的要求1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2.了解并掌握进行动物细胞原代培养的实验方法。
3.了解动物细胞培养的原理及注意事项。
4.学习细胞生死状态鉴别的方法。
5.了解细胞生死状态鉴别的原理。
6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。
7.掌握细胞计数方法，计算细胞存活率二、实验原理1、细胞培养细胞培养技术指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术，也叫细胞克隆技术。
细胞培养技术可以由一个细胞经过一段时间的培养得到大批的简单的单细胞或极少分化的多细胞，通过细胞培养可以得到大量的细胞或细胞代谢产物。
细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
细胞培养具有其他生物技术无可比拟的优点：培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构，细胞生长及发育等过程的观察。
在生物学的各个领域已被广泛应用。
但细胞培养也存在一定的局限性：细胞的培养是在脱离了机体的外界环境之中，与体内环境存在一定的差别，因此细胞培养过程中观察到的现象有时难以正确反映机体内的状况。
2、细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存在以下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。
基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶（PI）或溴化乙啶（EB）等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。
此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。
活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。
②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。
基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。
另外，可用美蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。
美蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。
3、细胞坏死与细胞凋亡细胞坏死长期以来被认为是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。
坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂。
细胞裂解要释放出内含物，并常引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。
细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
4、血球计数板血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有两个竖沟槽分成三个平台。
中间的平台中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。
计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
三、实验用品1、实验材料：活体小白鼠；2、实验仪器：超净工作台、二氧化碳培养箱、普通光学显微镜、倒置显微镜、水浴锅、离心机；3、实验器具：解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、注射器、普通针头、L型针头、移液枪、洗瓶、载玻片、盖玻片；4、实验试剂：75%酒精、细胞培养液、PBS液。
四、实验步骤1、小鼠脾细胞培养1）取材取小白鼠一只，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。
取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。
取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。
转入无菌玻璃培养皿，待用。
2）分离脾细胞①用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。
②用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1—2分钟。
③吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf发管，并使量至1ml，以3000r/分离1—2分钟。
3）培养脾细胞①超净工作台中取塑料培养皿一个，用移液枪（1000μl）加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。
②取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用移液枪（200μl）吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。
2、死活细胞鉴别及细胞计数1）试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。
2）染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。
注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。
在普通光镜10倍物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。
3）根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：活细胞率细胞总数死细胞数细胞总数五、实验结果1、小鼠脾细胞培养结果①细胞大小较为均匀，但存在一定差距；②细胞形状接近圆形，但边缘不光滑；③细胞透明程度较差，有的细胞中隐约可看到深色颗粒物；④细胞边缘较为模糊，边界不清晰。
总结：根据这些现象可知，培养两周后的小鼠脾细胞存活状态不佳，培养皿中存在大量死细胞。
图1 小鼠脾细胞培养两周后状态2、死活细胞鉴别及细胞计数1）所培养小鼠脾细胞死活细胞计数结果：表1 死活细胞计数结果2）所培养小鼠脾细胞照片图2 中方格1（左上） 图3 中方格2（右上）图4 中方格3（左下） 图5 中方格4（右下）图6 中方格5（中央）3）活细胞率活细胞率细胞总数 死细胞数细胞总数 六、 注意事项1. 细胞培养对无菌操作的要求较高，操作过程中一定要注意保持环境的洁净，手再放入超净工作台中前一定要消毒液浸泡，添加液体时要在酒精灯旁进行，扎枪头时不可以用手碰枪头，器具在使用前需要按照类别分别灭菌。
2. 杀死小鼠后，要将小鼠的血从颈部伤口处放尽方可进入下一步。
3. 用“L”形针头刮取脾细胞时，应注意不要用力过大，防止脾脏碎裂，出现大量组织碎块，影响实验。
4. 细胞计数时细胞悬液要滴加在血球计数板中央平台边缘的斜坡上，滴加少许后让液体由毛细作用自然渗入血球计数板与盖玻片之间，且不能有气泡，也不能从两边溢出，不然需要重新滴片。
5.计数时若观察到细胞过密，不便计数，可以用生理盐水进行适当稀释；若观察到细胞过稀，可以直接计数大方格中的细胞数目。
6.若计数时发现细胞分布不均，不同方格内细胞数目差距较大，应重新滴片。
7.压线细胞秉持“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。
8.对于被染上了蓝色，但颜色不深的细胞也应当按照死细胞进行计数。
七、思考与讨论1.生存状态良好的培养细胞大小基本均匀一致，形状呈圆形，细胞边缘有清晰的细胞膜界线，胞质透明度高，胞质内无空泡。
本组实验中培养两周后的细胞大小有差异，形状为近圆形，边缘不清晰，细胞颜色较深，隐约可见深色颗粒状物质，说明细胞活力低，存活状态差，并伴有一定数量的死细胞。
2.观察到培养两周后的小鼠脾细胞生存状态较差，之后死活细胞计数时得到所培养小鼠脾细胞的活细胞率仅为24.3%，原因应当是培养时间过长且培养过程中没有更换培养基，导致大量细胞代谢废物累计，营养物质缺乏，导致后期细胞死亡率升高，活细胞率下降。
