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目录一、前言 (2)1.1 凝集素的概念及其简介 (2)1.2 凝集素的分类 (3)1.3 凝集素的国内外研究现状 (3)1.4 凝集素的应用前景 (4)1.5 本设计的主要研究内容包括： (6)二、扁豆凝集素的分离纯化 (6)2.1试验材料 (6)2.2 试验方法 (7)2.2.1 扁豆凝集素粗品的制备 (7)2.2.2 扁豆凝集素的纯化 (7)三、扁豆凝集素的性质研究 (7)3.1 试验材料 (7)3.2 试验方法 (8)3.2.1 扁豆凝集素的基本性质检测 (8)3.2.2 扁豆凝集素的热稳定性测定 (8)3.2.3 碱稳定性测定 (9)3.2.4 金属离子结合特性试验 (9)3.2.5 扁豆凝集素的糖抑特性试验 (9)3.2.6 扁豆凝集素的抑菌试验 (9)3.2.7 扁豆凝集素的凝血活性 (10)参考文献 (12)扁豆凝集素的分离纯化与性质描述一、前言1.1 凝集素的概念及其简介凝集素是自然界广泛存在的一大类能凝集细胞、多糖或糖复合物的非源于免疫反应的糖蛋白，进一步被定义为非免疫球蛋白本质的蛋白质或糖蛋白，它能够特异性识别并可逆结合复杂糖复合物中的糖链，而不改变所结合糖基的共价结构。
它们广泛存在于各种各样的生物体中，并在生命活动如病毒、细菌、支原体和寄生虫感染、细胞和可溶性组分之间的寻靶作用、受精作用、癌细胞转移、生长、分化中都起着重要作用。
Peumans和Damme在1995年将植物凝集素定义为至少具有一个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域的植物蛋白。
在植物凝集素的研究中，豆科植物凝集素是最早进行研究，并且研究的最充分。
豆科凝集素尽管在糖结合专一性有不同，但它们在生物化学特性、一级结构组成方面显示出相似性，并且依据一级结构顺序和x-衍射晶体图谱分析表明：其糖结合区段也非常相似。
由于一个植物种族的凝集素有如此广泛的同源性，有力的揭示了这些蛋白质的基因编码有共同的祖先。
豆科凝集素经常作为凝集素研究的模式蛋白质与其它种类相互对照。
植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。
自制的方法常用生理盐水提取法。
（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。
恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。
每8-12小时摇荡一次。
（也可一次（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30性加100ml生理盐水）；分钟。
在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。
注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。
（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。
青豌豆的．提取：取青豌豆100克，加含0.15M氯化钠的0.01M pH7.0磷酸缓冲液200ml浸泡过夜，经膨胀后用组织捣碎机捣碎，倒入布袋中压榨出水提液，在沉渣中再力0入磷酸缓冲液100ml搅拌，浸泡1时，压榨出水提液，合并水提液，量出总体积。
加0.01％叠氮钠防腐。
2．蛋白质沉淀：边搅边加入固体硫酸铵达80％饱和（每升溶液加硫酸铵561克）冷藏过夜。
吸取上清液，沉淀再用二层滤纸抽气过滤至干，即得粗制青豌豆素蛋白沉淀物硫酸铵糊。
置冰箱保存。
3．亲和层析分离(1)装柱：取直径为1.0 cm，长度为25 cm的层析柱，按（实验十五）操作，自顶部缓缓加入稀薄的Sephadex G25悬液，待凝胶上升至距顶柱约3-5 cm即可，用1M NaCl溶液平衡10分钟。
绿豆凝集素的分离提取及其部分性质研究凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。
凝集素在动、植物体内广泛存在。
凝集素具有糖基结合特异性，一种凝集素仅对某一种特定的糖基专一性结合，因此凝集素可以作为探针等研究工具，并且研究凝集素的特异性有助于以分子或原子层次了解生命现象或病理变化。
本文对绿豆凝集素进行了分离提取及纯化，并对其部分基础性质进行初步研究。
绿豆凝集素的凝集活性检测采用凝血法检测，对新鲜兔血红细胞进行处理，戊二醛浓度0.15%(V/V)，固定时间为20min；胰蛋白酶浓度25U/mL，25℃处理15min；提高了兔血红细胞凝集灵敏度且延长了兔血红细胞保存时间。
绿豆凝集素的提取采用磷酸盐缓冲溶液(PBS)，最佳浸提溶液条件：0.2mol/L、pH7.2PBS。
将绿豆干粒粉碎100目，以料液比0.09（浸提液为1），NaCl浓度0.3mol/L，浸提时间4.16h，20℃下浸提，所得粗提液中绿豆凝集素比活力137.4U/mg。
对绿豆凝集素粗提液进行硫酸铵双重盐析，收集50%~60%饱和度沉淀，凝集素比活力达到805.9U/mg。
采用PEG600-硫酸铵双水相体系，PEG600质量分数15%，硫酸铵质量分数25%，绿豆凝集素样品浓度8mg/mL，萃取后绿豆凝集素凝血活性达到1307.8U/mg。
经过葡聚糖凝胶过滤后凝集活性为1961.9U/mg。
绿豆凝集素具有较强的抗热处理能力，对酸有一定的耐受性，在低pH下依然能保持凝集活性，但是碱性条件下耐受性较差，在pH为8.11的条件下很快失活，在pH6.5~7.5之间具有最大凝集活性。
绿豆凝集素SDS-PAGE电泳显示两条带，凝集素分子量约156.33KDa。
紫外吸收光谱显示具有特征吸收峰为234nm和275nm。
绿豆凝集素的纯化及性质研究的开题报告一、选题背景绿豆凝集素（Phytohemagglutinin，PHA）是一种从天然植物中提取的蛋白质凝集素，在免疫反应和癌症治疗中具有很大的潜力。
绿豆凝集素通过选择性结合细胞表面的糖基化蛋白，使得细胞发生凝集，从而对人体免疫系统相关的细胞和病理性细胞进行研究和治疗。
现有文献中对绿豆凝集素的纯化及其生物学特性研究较少，因此本研究将从绿豆中提取绿豆凝集素并对其进行纯化和性质的研究，为其在临床医学中的应用提供理论基础。
二、研究目的1. 通过对绿豆进行提取和分离，纯化绿豆凝集素，分析绿豆凝集素的生物学性质和纯度。
2. 研究绿豆凝集素在不同条件下的凝集作用及其对血管内皮细胞的作用，探讨其在生物医学领域中的应用前景。
三、研究内容1. 绿豆凝集素的提取和分离：采用醋酸提取法、盐析、凝胶层析等方法对绿豆凝集素进行提取和纯化。
2. 绿豆凝集素的生物学性质分析：采用SDS-PAGE、UV-Vis光谱、免疫印迹、比色法等方法对纯化后的绿豆凝集素进行分析，评估其纯度和生物学活性。
3. 绿豆凝集素的凝集作用和对血管内皮细胞影响的研究：采用细胞实验、体外实验等方法研究绿豆凝集素的作用机制和应用前景。
四、研究意义1. 为绿豆凝集素在临床医学中的应用提供理论基础。
2. 深入探讨绿豆凝集素的生物学性质及其与肿瘤、自身免疫性疾病等疾病的关系，为其开发新药提供依据。
3. 对于理解绿豆的生物学特性，尤其是其对细胞的凝集作用机制，具有一定的学术价值。
五、研究方法与技术路线1. 绿豆凝集素的提取和分离（1）醋酸提取法：将绿豆粉末用生理盐水混合，过滤得到绿豆提取液，再用醋酸沉淀法进行提取与分离。
（2）盐析：将绿豆提取液采用逆流法与硫酸铵逐渐递增加盐，使绿豆凝集素逐渐析出。
（3）凝胶层析：将分离得到的绿豆凝集素溶液与聚丙烯酰胺凝胶混合，在特定的pH值下进行层析。
2. 绿豆凝集素的生物学性质分析（1）SDS-PAGE：对分离纯化后的绿豆凝集素进行SDS-PAGE电泳检测，确定其分子量和纯度。
桑叶凝集素的提取工艺优化研究孙 东,刘鹏举,郑晓翠,唐 咏*(沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110161)[收稿日期] 2008-04-19[通讯作者] *唐咏,Te:l (024)88410911,E-m ai:l tang110161@163.co m[作者简介] 孙东,Te:l (024)88410911,E-m ai:l dongdongdong -121@163.co m凝集素是一类非酶非免疫来源的蛋白或糖蛋白,能够与细胞表面的糖残基进行可逆的特异性结合[1]。
凝集素不仅具有凝集血细胞、精细胞的作用,还参与生物体内的一些重要生理和病理过程,因此,凝集素在细胞分离鉴定、细胞及亚细胞表面结构研究、转基因植物抗虫研究等方面具有重要应用,是研究生物体内细胞癌变、受精、分化及分子识别等生命过程的有利工具[2-4]。
桑树M orus alba L .小乔木或灌木,我国各地均有栽培[5]。
现代药理研究表明,桑叶具有疏散风热,清肝名目等功效[5],但有关桑叶凝集素的研究未见报道,本研究首次从桑叶中提取得到凝集素(M orus alba lecti n ,MAL),采用正交试验法对其提取工艺进行初步研究,为进一步研究桑叶凝集素奠定基础。
1 材料UV -2100型紫外-可见分光光度计(尼龙柯,上海仪器有限公司);J A5003A 电子天平(上海精天电子仪器有限公司);P H S -25数显pH 计(上海精密科学仪器有限公司);2003-10数显恒温磁力搅拌器(国华电器有限公司);D -37520高速冷冻离心机(德国制造);Pro li n e 单道可调移液器(上海科华实验系统有限公司),96孔V 型血凝板(姜堰市荣飞器械厂)。
桑叶药材购于沈阳中街同仁堂药店,经本院植物学教研室邵美妮讲师鉴定,其他试剂均为国产分析纯。
2 方法2.1 凝血效价检测凝血效价检测参照孙册等人的方法[1],取96孔V 血凝板,每个孔加入20 L 缓冲液,然后在第1行各孔分别加入样品液20 L ,每列依次倍比稀释,每种样品做2个重复,对照为不加样品的生理盐水,最后分别加入2%血细胞悬液[6]20 L,静置1~2h ,观察结果。
![一种豆类植物凝集素的提取方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/71bab32089eb172dec63b77d.png)
专利名称：一种豆类植物凝集素的提取方法专利类型：发明专利
发明人：王敏康
申请号：CN200910094233.1
申请日：20090318
公开号：CN101508730A
公开日：
20090819
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种豆类植物凝集素的提取方法，属植物有用成分提取技术领域。
为水提法，在40～60℃温度下提取，按以下步骤：豆类种子粉碎到40～100目→加入浸泡液在40～60℃温度下提取60～180分钟并打捞豆皮→粗分去除豆渣→离心分离得含植物凝集素的上清液→对上清液进一步进行分离纯化→浓缩或干燥得植物凝集素。
可于提取的全过程或部分过程中施加超声波或微波，或交替施加超声波和微波进行辅助提取。
本发明完全抛弃了传统的低温浸泡低温处理方法，实践证明是一种简单高效和短时间的提取植物凝集素的方法。
通过有关检测，所得植物凝集素能满足常规的实验及药用需要。
本发明克服了现有技术产品有较多化学试剂成分遗留和提取时间长的缺点。
申请人：王敏康
地址：650092 云南省昆明市一二一大街298号云南师范大学生命科学院
国籍：CN
代理机构：昆明科阳知识产权代理事务所
代理人：李行健
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植物凝集素（PHA）的提取及血凝效果研究安徽技术师范学院,2002,16(1):23--25 journalofAnhuiTechnicalTeachersCollege植物凝集素(PHA)的提取及血凝效果研究于敏王志德董志芳(安徽大学生命科学院,安徽合肥230039)摘要:凝集素是一类具有糖专一性,可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白,本文通过提取8种豆科植物种子中的凝集素.分别与人的四种血型红细胞悬液发生凝集反应(A 型,B型,O型,AB型),通过血凝反应的强弱程度来验证不同凝集素的血型专一性,并进一步测定其相对含量.关键词:植物凝集素;血凝;提取中图分类号:0.946.1文献标识码:A文章编号:1007—3302(2002)01—0023—03凝集素是一种非免疫源性的蛋白质或糖蛋白,在动物,植物及微生物(如细菌,病毒)中广泛存在,几乎见于各种生活的有机体,并不限于特殊的器官和组织.豆科植物的凝集素在成熟种子中占蛋白质总含量的10%左右.它由2个或4个单体组成,每个单体的分子量为25～30KD,有一个结合糖位点_lJ.凝集素不仅具有凝集诸如血细胞,淋巴细胞,精子细胞等作用,而且参与了生物体内的一些重要生理和药理过程,因此是研究生物体内细胞癌变,受精,分化及分子识别等生命过程极其有用的工具,同时作为一种试剂,凝集素不仅在l临床医学检验上有着重要地位,雨且是抗肿瘤药物(如干扰素,白细胞介素一2等)生产所需的促有丝分裂原L3-71,国外近来还报道某些凝集素对爱滋病毒也有抑制作用?.凝集素可能具有的多种生理生化作用.吸引了生物学科研工作者对其进行探讨.某些凝集素与ABO血型物质直接相关.少数凝集素具有血型专一性,即凝集素在凝集红细胞的反应中,其血凝反应与供血动物的种类和血型有密切关系.对这类自然界存在极少的血型专一性凝集素的性质,结构和功能的研究,不仅具有重要理论意义,雨且对l临床及法医学上血型鉴定收稿日期:2001—12—26具有较大应用价值.如油麻藤种子中的凝集素(MsL)即是一种人A型血专一性的凝集素_4】. PIA(利马豆凝集素)对A型血专一,L(欧洲百脉根凝集素)对.型血专一.Watkin和Morgan确立了凝集素的血型专一性和它们的糖结合血专一性的关系【.1材料和方法1.1材料1.11豆科(Leguminosae)植物之八种种子(I{暂于超市):赤豆.豇豆,花菜豆,多花菜豆,白云豆,黑菜豆,白菜,黄豆.1.1.2新鲜人血(A,B,AB,O四种血型)采于合肥市血防站)11.3试剂:0.85%NaCI溶液(生理盐水)11.4仪器:高速组织捣碎机DS一1(上海标本模型厂);冷冻离心机(上海医用分析仪器厂);光学显微镜XSP一16A(中国江南仪器厂);生物显微镜BHS(日本OLYMPUS公司);7230分光光度计(上海分析仪器厂).1.2方法12.1PHA的提取分别取8种豆子各15g,用生理盐水洗净后加100ml生理盐水吸涨24hr 后,将吸涨的豆子放入组织捣碎机中捣碎5rain, 置4℃冰箱中过夜抽提.将抽提物用四层纱布过滤,滤液5000r/min冷冻离心20min,上清液置24安徽技术师范学院2002每烧杯中4℃保存备用.1.22血凝反应测试(1)2%红细胞悬液的制备:取四种血型的新鲜人血各1Oml,加抗凝剂(柠檬酸钠)1g.用085%的生理盐反复洗涤5次,每次20oOr/rain离心5min,去上清,按红细胞压积用生理盐水配成2%的红细胞悬液.(2)平板反应:用滴管吸取豆类PHA提取液和红细胞悬液各一滴滴于载玻片上,充分混匀,静置1O min,在低倍镜下观察血凝现象,并以085%的生理盐水作对照试验.12.3PHA相对含量测定(1)体积相同试管洗净烘干称重后加入PHA提取液5ml,并以0 85%的生理盐水作对照试验.(2)各管分别同时加入2%的红细胞悬液1ml,摇匀,静置,15min之内观察血凝情况.(3)在某种豆子血凝团最先完全沉淀的同时,取出各管的上液.使其在同一刻度.此时再取2ml于7230分光光度计在620nm时测定光密度值(O13).(4)取出各管的悬浮液后,试管内仅存细胞沉淀团,此时烘干称重.1.2.4凝集程度的判别与记录液体澄清透明血细胞全部凝集于管底或平板底,轻摇可见大的凝块.为高度凝集(卅);液体稍混浊,液体中有明显的凝集物.凝集块较小,为中度凝集(+);液体混浊,仔细观察可看到液体中有很小的凝集块,为轻度凝集(+);液体与对照组相似,血细胞分布较均匀,为不凝集(一).2结果与讨论2.1结果2.1.1血凝反应测试豆类PHA提取液和红细胞悬液各一滴滴于载玻片上,观察结果如表1.表l提取液与四种血型血细胞摄集反应情况注:"一"不凝集+轻度凝集"抖"中度凝集"卅斗高度凝集由表1可以看出除豇豆和红豆的提取液外.其余六种豆子的提取液均可以使四种血型都发生凝集反应,且均未表现出血型专一性.只是发生反应的程度有所不同,其中自云豆效果最强,其中的PHA含量最高.2.12PHA相对含量的测定表2PPIA与血细胞稀释液作用后上清液OD值殛血红细胞凝集沉淀鞫干I 由表2可以看出,在同一条件下,加白云豆提取豫的试管吸收值最小,而红细胞沉淀最多,再次证明,白云豆中PHA含量是最高的.由于四种血型红细胞表面糖链的差异,各种豆子PHA一级结构的细微差异致使四种血型与八种豆子PHA的血凝反应有较太差异.但单从某种血型对八种豆子PHA的血凝反应来看,其结果与表1基本符合.四种血型的红细胞沉淀干重与O.D值呈负相关性,即某种提取液与红细胞悬液反应后的O.16卷第1期于敏等植物凝集索(PHA)的提取及血凝效果研究25 D值大,刚红细胞沉淀干重刚小;反之,().D值小,则沉淀重大.基本上达到了预期效果,但由于各种PHA液中均含杂质,且杂质的量不同,各种PHA液透光能力有一定差异,对()D值测量有一定影响,致使有一些豆类的反差不强.22讨论凝集素能和含有其结合位点互补的糖基的任何细胞结台.由于所有细胞和许多亚细胞结构都能与之结合,细胞凝集是细胞表面的糖分子结合,在细胞表面形面许多相互产叉的"桥"的结果影响凝集反应的因素除了PHA自身性质和细胞表面结构外,外界条件如PH值,离子强度及温度等有较大的影响,本实验用0.85%NaCI配制细胞悬液和提取PHA,从而确保PHA的血凝活性.随着科技的发展,预计将来有更多种类的植物凝集素被发现和提纯.更多的能识别新的特异性糖基的植物凝集素的发现将会使植物凝集素的应用更为广泛.从而为生物学,医学基础研究和临床诊断治疗提供新的手段和新的技术.[参考文献][]王遇群豆类植物凝集索及其对根瘤菌的识别作用[J]植物学通报.2000.17(2):127—132[2]孙册主编凝集索[M]北京.科学出版杜.1984[3]扬远和植物凝集紊的主要生物学作用及应用[J].生物学杂志,1994,(2):I一3[4]曾仲奎油麻腺种子凝集索的纯化及性质研究[J]生物化学杂志.1996,12(3),336—340[5]丁亮豆科植物凝集索对血细胞的凝集反应研究[J].中国细胞生物学第七届学术大会论文选集,1999lI.[6]Isab[eKinneyTcrriradeMirardas∞tos,et.ActivationofT&Bceilsbyacrudeextractofartoc~rpusin.- tegrifoliaismediatedbyaleetindistinctfromjaea[inJImm—noMetlho,1991.140197[7]江红.孙册.轼体动物凝集紊[J】生命的化学,1996,16(5):2B一31[8]FavcroJna1EurJlrranttno[,1993.23:179一l85 AbstrationofPhytohemagglutininandStudyofitsHemagglutininEffectYUMin,WANGZhi-de,DCINGZhi.一fang(SchoolofLiireScience,AnhuiUIrniversity,He{ei230039)Abstract:Phytohemagglufinin(PHA)isakindofproteinorglycoproteinItisabletoagglutini nthe erythrocytesofhumanbloodgroupAbstractPHAfromeightkindsofbeansandhavethemrea ctwiththeerythrocytesoffourhumanbloodgroup(A,.B,AB.O).Thispaperistoillustratebloodgroups pecialPHA anddetermineitscontentaceordingtohemegglutinativeleve1KeyWords:Phytohemagglutinin(PHA);Hemagglutination;Abstration。
大豆凝集素的分离纯化及血凝效果研究湛润生;纪丽颖;邢宝龙;张旭丽【期刊名称】《山西大同大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(034)002【摘要】为研究不同品种大豆中凝集素相对含量高低及血凝效果,用0.9％NaCl溶液抽提不同品种大豆中的凝集素,通过观察凝集素提取液与2％红细胞悬液的凝集反应程度,来初步判断凝集素的含量高低;再通过测定凝集素提取液与2％红细胞悬液作用后上清液吸光值,以及凝集红细胞沉淀的干重,进一步确定不同品种大豆中凝集素的相对含量.结果表明,利用血凝法可快速测定大豆中的凝集素含量,'晋科5号'、'长豆34号'凝集素含量最高,'晋豆25号'、'晋遗57号'凝集素含量次之,'晋遗59号'含量最低.【总页数】4页(P51-53,56)【作者】湛润生;纪丽颖;邢宝龙;张旭丽【作者单位】山西大同大学生命科学学院,山西大同037009;山西大同大学设施农业技术研发中心,山西大同037009;山西大同大学生命科学学院,山西大同037009;山西大同大学设施农业技术研发中心,山西大同037009;山西省农业科学院高寒区作物研究所,山西大同037008;山西省农业科学院高寒区作物研究所,山西大同037008【正文语种】中文【中图分类】S852.4+5【相关文献】1.植物凝集素(PHA)的提取及血凝效果研究 [J], 于敏;王志德;董志芳2.黑豆凝集素的提取及血凝效果研究 [J], 唐超;王清吉3.大豆凝集素的分离纯化和血凝活性研究 [J], 王幸;马秋枝;刘强4.芸豆植物凝集素的提取及血凝效果研究 [J], 郭春生;于蕾妍;葛蔚;张丽;唐超;王清吉5.蒜头果凝集素的提取及血凝效果研究 [J], 袁燕;袁再美;岑晓江;程霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
