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㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(３):９~１４ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０３.００２收稿日期:２０２２－０６－２８基金项目:山东省农业良种工程项目(２０１９ＬＺＧＣ０１７０２)ꎻ山东省自然科学基金青年项目(ＺＲ２０２０ＱＣ１１４)ꎻ国家自然科学基金青年项目(３２００１５４２)ꎻ山东省农业良种工程项目(２０２１ＬＺＧＣ０１３)ꎻ小麦玉米国家工程实验室开放课题(２０１８ＬＹＺＷＳ０６)作者简介:李永波(１９８６ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｌｙｂ９２０３２７＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ通信作者:樊庆琦(１９８０ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｆａｎｑｉｎｇｑｉ＠１６３.ｃｏｍ楚秀生(１９６３ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｘｓｃｈｕ２００７＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备李永波１ꎬ鲁琳１ꎬ方会见２ꎬ崔德周１ꎬ孟福燕３ꎬ黄琛１ꎬ隋新霞１ꎬ樊庆琦１ꎬ楚秀生１ꎬ４(１.山东省农业科学院作物研究所/黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/山东省小麦技术创新中心/济南市小麦遗传改良重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ２.山东鲁研良种有限公司ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.郓城县种子公司ꎬ山东郓城㊀２７４７００ꎻ４.烟台大学生命科学学院ꎬ山东烟台㊀２６４０００)㊀㊀摘要:ＤＲＥＢ(ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇ)转录因子在小麦非生物胁迫中起着非常重要的作用ꎬ但由于目前缺乏可识别小麦内源性ＤＲＥＢ蛋白的抗体ꎬ导致其在蛋白水平上的研究进展非常缓慢ꎮ本研究通过分析ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ三种蛋白序列ꎬ将ＤＲＥＢ４Ａ在大肠杆菌中进行表达ꎬ并利用纯化后的蛋白作为抗原免疫兔子ꎬ在国内外首次获得小麦ＤＲＥＢ４的多克隆抗体ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证明ꎬ该抗体可特异性识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白ꎮ该抗体介导的免疫组织化学结果显示ꎬＤＲＥＢ４蛋白定位于细胞核内ꎮ本研究为深入研究植物ＤＲＥＢ信号通路提供了有力的检测工具ꎮ关键词:小麦ꎻ非生物胁迫ꎻＤＲＥＢ４转录因子ꎻ多克隆抗体中图分类号:Ｓ５１２.１:Ｑ７８６㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０３－０００９－０６ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔＤＲＥＢ４ＰｒｏｔｅｉｎＬｉＹｏｎｇｂｏ１ꎬＬｕＬｉｎ１ꎬＦａｎｇＨｕｉｊｉａｎ２ꎬＣｕｉＤｅｚｈｏｕ１ꎬＭｅｎｇＦｕｙａｎ３ꎬＨｕａｎｇＣｈｅｎ１ꎬＳｕｉＸｉｎｘｉａ１ꎬＦａｎＱｉｎｇｑｉ１ꎬＣｈｕＸｉｕｓｈｅｎｇ１ꎬ４(１.ＣｒｏｐＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｈｅａｔＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＨｕａｎｇ￣ＨｕａｉＲｉｖｅｒＰｌａｉｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＷｈｅａｔ/ＪｉｎａｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｈｅａｔＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈａｎｄｏｎｇＬｕｙａｎＳｅｅｄＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＹｕｎｃｈｅｎｇＣｏｕｎｔｒｙＳｅｅｄＣｏｍｐａｎｙꎬＹｕｎｃｈｅｎｇ２７４７００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹａｎｔａｉ２６４０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＤＲＥＢ(ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｂｉｎｄｉｎｇ)ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｐｌａｙｓａｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｗｈｅａｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｄｕｅｔｏｔｈｅｌａｃｋｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｈａｔｃａｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｗｈｅａｔｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＤＲＥＢｐｒｏｔｅｉｎꎬｉｔｓｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓａｔｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｉｓｖｅｒｙｓｌｏｗ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｒｅｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＤＲＥＢ４Ａꎬ４Ｂａｎｄ４ＣꎬｔｈｅＤＲＥＢ４ＡｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉꎬａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｕｓｅｄａｓａｎａｎｔｉｇｅｎｔｏｉｍｍｕｎｉｚｅｒａｂｂｉｔｓꎬｔｈｅｎｔｈｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｏｆｗｈｅａｔＤＲＥＢ４ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄ.ＴｈｅＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｕｌｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｗｈｅａｔｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＤＲＥＢ４ｐｒｏｔｅｉｎ.Ｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＤＲＥＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ.Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅａｐｏｗｅｒｆｕｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｏｏｌｆｏｒｉｎ￣ｄｅｐｔｈｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｐｌａｎｔＤＲＥＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＷｈｅａｔꎻＡｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓꎻＤＲＥＢ４ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎻＰｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ㊀㊀干旱㊁盐㊁高温㊁冷等各种非生物胁迫会严重影响小麦产量ꎮＤＲＥＢ蛋白含有一个保守的ＡＰ２结构域ꎬ可以和顺式作用元件ＤＲＥ核心序列(Ａ/ＧＣＣＧＡＣ)发生特异性结合ꎬ通过在转录水平上调控下游基因的表达[１]ꎬ进而应对各种非生物胁迫ꎮ到目前为止ꎬＤＲＥＢ转录因子在拟南芥[２]㊁大豆[３]㊁水稻[４]㊁玉米[５]㊁大麦[６]和小麦[７]等多种植物中被鉴定出来ꎮＤＲＥＢ分为六大类(ＤＲＥＢ１~６)[８]ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ１在拟南芥㊁水稻㊁玉米中主要应答冷胁迫[４]ꎬＤＲＥＢ２主要应答干旱㊁盐胁迫[９]ꎬＤＲＥＢ３参与ＡＢＡ和糖信号途径[１０]ꎬＤＲＥＢ４应答干旱㊁冷胁迫及在乙烯与茉莉酸途径中起作用[１１]ꎬＤＲＥＢ５参与应答干旱㊁冷胁迫[１２]ꎬＤＲＥＢ６应答干旱㊁盐胁迫[１３]ꎮ大量研究已验证了ＤＲＥＢ在植物应对非生物胁迫中的功能ꎮ如在小麦中过表达拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ㊁大豆ＧｍＤＲＥＢ１或棉花ＧｈＤＲＥＢ基因ꎬ可通过提高根系活力㊁光合作用及渗透调节能力提高小麦的抗旱性[１４－１６]ꎻ在拟南芥中过表达大豆ＧｍＤＲＥＢ２㊁ＧｍＤＲＥＢ３或小麦ＴａＤＲＥＢ３基因ꎬ可提高拟南芥抗旱㊁耐盐㊁耐高温及抗冻性[１ꎬ１７ꎬ１８]ꎻ过表达ＧｍＤＲＥＢ６基因ꎬ可增强大豆的耐盐能力[１９]ꎮ然而ꎬ目前几乎所有关于ＤＲＥＢ的研究是集中在转录水平上的调控ꎬ缺乏蛋白质水平上的调控研究ꎬ且ＤＲＥＢ蛋白发挥生物学功能是否通过磷酸化㊁乙酰化等蛋白水平上的调控尚未可知ꎬ因此ꎬ研究识别内源性ＤＲＥＢ蛋白的特异性多克隆抗体ꎬ对于ＤＲＥＢ在蛋白水平的调控研究具有非常重要的意义ꎮ本研究通过对小麦中已有的ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ进行序列分析ꎬ选取ＤＲＥＢ４Ａ进行原核表达㊁纯化ꎬ并以其作为抗原ꎬ首次制备出可识别小麦内源ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎬ以期为进一步研究植物ＤＲＥＢ４在蛋白水平上的调控机理提供方法学基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料供试小麦品种为济麦３７９ꎬ由山东省审定(鲁审麦２０２１００１７)ꎮ取其幼苗期根㊁叶为材料进行试验ꎮ１.２㊀ＤＲＥＢ４序列分析与合成本研究通过ＤＮＡＭＡＮ８软件对ＮＣＢＩ中提交的ＤＲＥＢ４Ａ(ＡＹ７８１３５４.１)㊁４Ｂ(ＡＹ７８１３５５.１)和４Ｃ(ＡＹ７８１３５６.１)序列进行分析ꎻＤＲＥＢ４Ａ序列的合成由北京擎科生物科技有限公司进行ꎮ１.３㊀ＤＲＥＢ４Ａ载体构建、原核表达及纯化将上述合成的ＤＲＥＢ４Ａ序列与大肠杆菌表达载体ＰＥＴ３０ａ通过同源重组的方法(ｐＥＡＳＹ®－ＢａｓｉｃＳｅａｍｌｅｓｓＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙＫｉｔꎬＣＵ２０１－０２ꎬ北京全式金生物技术股份有限公司)连接ꎬ将连接产物转入ＤＨ５α(北京擎科生物科技有限公司)感受态细胞中ꎬ冰上放置１５ｍｉｎꎬ４２ħ水浴热激９０ｓꎬ再冰上放置２ｍｉｎꎬ加入１ｍＬ无任何抗生素的ＬＢ液体培养基ꎬ３７ħ㊁２１０ｒ/ｍｉｎ水平摇１ｈꎬ然后取１００μＬ菌液ꎬ涂于含有卡那霉素的ＬＢ固体培养基上ꎬ３７ħ过夜培养ꎮ挑取１０个单克隆进行ＰＣＲ检测ꎬ选取２个阳性信号最强的单克隆由北京擎科生物科技有限公司进行测序ꎬ对测序正确的单克隆进行摇菌㊁质粒提取(质粒小提试剂盒ꎬＤＰ１０３ꎬ北京天根生化科技有限公司)ꎮ将提取好的质粒转入ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞(ＣＤ７０１－０２ꎬ北京全式金生物技术股份有限公司)中ꎬ剩余步骤同ＤＨ５α感受态细胞转化ꎮ挑单克隆ꎬ置于５ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ３７ħ过夜培养ꎬ然后吸取１ｍＬ菌液ꎬ加入到３００ｍＬＬＢ液体培养基中进行扩大培养ꎬ待菌液ＯＤ值为０.６~０.８时ꎬ加入终浓度为５０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ(Ｇ５０４２－１Ｇꎬ武汉塞维尔生物科技有限公司)进行诱导表达ꎬ２８ħ过夜培养ꎻ菌液于６０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ收集菌体沉淀ꎬ用１ˑＰＢＳ(ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ)清洗沉淀１次ꎬ然后加入４０ｍＬ１ˑＰＢＳ重悬ꎬ超声破碎(开３ｓꎬ关３ｓꎻ共计３０ｍｉｎ)ꎬ６０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ分别将沉淀㊁上清液进行ＳＤＳ电泳检测ꎮ利用Ｈｉｓ标签蛋白纯化试剂盒(Ｐ２２２６ꎬ上海碧云天生物技术有限公司)对上清液进行纯化ꎬ然后置于透析袋中４ħ过夜透析ꎬ将透析后的蛋白置于０１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀－２０ħ保存备用ꎮ１.４㊀小麦ＤＲＥＢ４多克隆抗体制备选取实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各１只ꎬ饲养体重至１~２ｋｇ时ꎬ用注射器将充分混匀的１ｍＬ完全弗氏佐剂(液体石蜡ʒ羊毛脂＝２ʒ１)和０.３ｍｇＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白对每只兔子进行皮下注射第１针ꎬ标记为第１天ꎻ第１２天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂(完全弗氏佐剂＋终浓度２０ｍｇ/ｍＬ的卡介苗)和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行皮下注射第２针ꎻ第２６天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行肌肉注射第３针ꎻ第４０天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行肌肉注射第４针ꎻ第５３天ꎬ取兔子血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证ꎮ１.５㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析利用植物组织蛋白裂解液提取小麦幼苗期根㊁叶部的总蛋白(植物蛋白提取试剂盒ꎬＣＷ０８８５ꎬ康为世纪生物技术有限公司)ꎬ配制１５％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳ꎻ通过湿法转膜ꎬ将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素薄膜上ꎬ然后将膜放入含有２％脱脂奶粉的ＴＢＳ(２５ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌꎬ１３７ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)中ꎬ封闭１ｈꎻ加入ＤＲＥＢ４多克隆抗体(１ʒ１０００稀释于２％脱脂奶粉中)ꎬ４ħ过夜ꎻ用ＴＢＳＴ(ＴＢＳ＋２０％吐温－２０)洗涤３次后ꎬ向封闭液中加入碱性磷酸酶(ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅꎬＡＰ)标记的二抗ꎬ缓慢摇动２４ｈꎬ然后ＴＢＳＴ洗涤３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎻ最后用发色液(ＴＢＳ１０ｍＬꎬ５％ＮＢＴ４５μＬꎬ５％ＢＣＩＰ３５μＬ)进行发色ꎮ１.６㊀免疫组织化学法进行亚细胞定位将小麦叶片下表皮撕下ꎬ置于４％多聚甲醛中ꎬ室温放置２４ｈꎬ弃掉多聚甲醛ꎬ用１ˑＰＢＳ清洗３次ꎬ加入２％脱脂奶粉于３７ħ封闭３０ｍｉｎꎬ然后在４ħ下加入ＤＲＥＢ４多克隆抗体(１ʒ２００稀释于２％脱脂奶粉中)过夜ꎻ用ＰＢＳ洗涤３次后ꎬ加入１μＬ二抗(山羊抗兔－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗体)和１０ｍＬＢＳＡꎬ３７ħ继续孵育１ｈꎬ然后用ＴＢＳ清洗３次ꎬ在室温下用４ᶄꎬ６－二脒基－２－苯基吲哚(ＤＡ￣ＰＩꎬＡｎａＳｐｅｃＩｎｃ.ꎬＳａｎＪｏｓｅꎬＣＡꎬＵＳＡ)染色１０ｍｉｎꎬ然后用ＴＢＳ清洗３次ꎬ置于荧光显微镜(ＨＴ７７００ꎬＨｉｔａｃｈｉꎬＴｏｋｙｏꎬＪａｐａｎ)下观察并拍照ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀小麦ＤＲＥＢ４序列分析在普通小麦中ꎬＤＲＥＢ４存在ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ㊁４Ｃ三种转录本ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ａ编码３９４个氨基酸ꎬ分子量为４２.８ｋＤａꎻＤＲＥＢ４Ｂ编码３４６个氨基酸ꎬ分子量为３７.７ｋＤａꎻＤＲＥＢ４Ｃ编码６８个氨基酸ꎬ分子量为７.１ｋＤａ(图１)ꎮ三个蛋白氨基酸序列的保守性为６１.２８％ꎬ第１~２５位的氨基酸完全一致ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ｂ除第２６~７３位氨基酸缺失外ꎬ其它位置的氨基酸与ＤＲＥＢ４Ａ完全一致ꎮＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ存在序列间的差异ꎬ可能是应对不同非生物胁迫产生的可变剪切所致ꎮ图中深蓝色区域为保守区域ꎮ图１㊀普通小麦ＤＲＥＢ４Ａ、４Ｂ和４Ｃ的氨基酸序列分析２.２㊀小麦ＤＲＥＢ４Ａ的原核表达鉴于ＤＲＥＢ４Ａ的氨基酸序列最长ꎬ选其进行后续分析ꎮ首先ꎬ将人工合成的ＤＲＥＢ４Ａ序列与表达载体ＰＥＴ３０ａ连接后ꎬ在大肠杆菌中进行表达ꎬ上清液中的蛋白纯化后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测ꎮ结果显示ꎬ在大约５０ｋＤａ处出现清晰的蛋白条带(图２)ꎬ与预期的蛋白分子量相符ꎬ表明ＤＲＥＢ４Ａ成功表达ꎮ１１㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李永波ꎬ等:小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备图２㊀小麦ＤＲＥＢ４Ａ的原核表达及纯化２.３㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体的制备本研究以上述获得的纯化ＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白为抗原免疫兔子ꎬ从兔血清中获取了ＤＲＥＢ４多克隆抗体ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示ꎬ该抗体在目的蛋白位置清楚地识别到ＤＲＥＢ４Ａ蛋白(图３)ꎮ图３㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体对ＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白的识别２.４㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体对小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的识别及特异性检测为了进一步验证该抗体能否识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白ꎬ分别提取小麦苗期根㊁叶总蛋白进行免疫识别ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示ꎬ仅在３７ｋＤａ处检测到清晰的蛋白条带ꎬ这与预测的ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白分子量一致(图４)ꎮ表明该抗体可以识别小麦内源性ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白ꎬ而且特异性好ꎬ可以用于后续植物ＤＲＥＢ分子机理的相关研究ꎮ图４㊀小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白检测２.５㊀ＤＲＥＢ４亚细胞定位分析ＤＲＥＢ４定位于细胞核中(图５)ꎬ与前人报道的ＤＲＥＢ转录因子核定位的结果一致[２０]ꎬ进一步证实了该抗体特异性较好ꎬ可用于开展免疫组织或细胞化学研究的可行性ꎮ对照为前血清ꎮ图５㊀利用免疫组织化学法进行的㊀㊀㊀ＤＲＥＢ４亚细胞定位分析结果３㊀讨论与结论ＤＲＥＢ是一类抗非生物胁迫的转录因子ꎬ目前主要用于抗逆转基因植物的培育及相关分子机理的解析[２１]ꎮ小麦ＤＲＥＢ４蛋白是一种对动物和人类无危害的蛋白ꎬ将其用于粮食作物抗逆性转基因改良有着广阔的市场前景[２２]ꎮＤＲＥＢ４在小麦中存在三种转录形式(ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ)[２３]ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ａ编码的多肽链最长ꎬ涵盖的蛋白信２１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀息最丰富ꎬ推测由此蛋白作为抗原产生的抗体可识别ＤＲＥＢ４的所有三种形式ꎬ因此本研究利用ＤＲＥＢ４Ａ蛋白作为抗原ꎬ进行了ＤＲＥＢ４多克隆抗体的制备ꎮ经过抗原上清蛋白的纯化㊁免疫注射ꎬ最终研制出能识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎮ尽管从植物中已克隆出多种类型的ＤＲＥＢ基因ꎬ但由于其抗体类型匮乏以及识别内源性蛋白抗体的空白ꎬ导致有关ＤＲＥＢ在蛋白水平上的调控机理研究进展相对缓慢ꎮ目前ꎬ只有拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ的抗体制备成功ꎬ且仅对大肠杆菌中表达的拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ融合蛋白进行了检测[２４]ꎮ本研究首次开发了特异性识别小麦内源ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎬ既丰富了植物ＤＲＥＢ的抗体类型ꎬ也为进一步推动ＤＲＥＢ在蛋白水平上的研究提供了方法学基础ꎮ利用本研究制备的ＤＲＥＢ４多克隆抗体检测小麦苗期根㊁叶内源性ＤＲＥＢ４蛋白时ꎬ仅识别到了ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白条带ꎬ与预测的该抗体能识别小麦中ＤＲＥＢ４三种蛋白形式的结果不一致ꎬ这可能是因为ＤＲＥＢ４具有组织器官以及不同发育阶段表达特异性ꎬ在小麦苗期根㊁叶中主要以ＤＲＥＢ４Ｂ的形式表达ꎬ而在花㊁籽粒等其它组织器官以及不同发育阶段中则以其它形式表达ꎻ另外ꎬＤＲＥＢ４在不同小麦品种中的表达形式也可能存在一定的差异ꎬ本研究所用小麦品种济麦３７９为抗旱节水型品种ꎬ在其苗期根㊁叶中主要以ＤＲＥＢ４Ｂ的形式表达ꎬ但在其它类型的小麦品种中以哪种形式表达还有待进一步研究ꎮ传统ＤＲＥＢ基因亚细胞定位是采用构建ＤＲＥＢ－ＧＦＰ过表达载体转入组织或细胞中的方法进行定位[２０]ꎬ而本研究是利用该抗体对内源ＤＲＥＢ４进行免疫定位ꎬ与传统方法相比可避免因过表达造成目的蛋白移位的现象ꎮ综上所述ꎬ本研究通过对ＤＲＥＢ４Ａ进行大肠杆菌表达㊁纯化ꎬ并以此作为抗原成功制备出可识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的高度特异性多克隆抗体ꎬ可为深入研究植物ＤＲＥＢ４在蛋白水平上参与非生物胁迫的调控机理奠定方法学基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＮｉｕＸꎬＬｕｏＴꎬＺｈａｏＨꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｅａｔＤＲＥＢｇｅｎｅｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴａＤＲＥＢ３ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅꎬ２０２０ꎬ７４０:１４４５１４. [２]㊀ＳｔｏｃｋｉｎｇｅｒＥＪꎬＧｉｌｍｏｕｒＳＪꎬＴｈｏｍａｓｈｏｗＭＦ.ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣＢＦ１ｅｎｃｏｄｅｓａｎＡＰ２ｄｏｍａｉｎ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｔｈａｔｂｉｎｄｓｔｏｔｈｅＣ￣ｒｅｐｅａｔ/ＤＲＥꎬａｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇＤＮＡｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｔｈａｔｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔ[Ｊ].Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡꎬ１９９７ꎬ９４(３):１０３５－１０４０. [３]㊀ＭｉｚｏｉＪꎬＯｈｏｒｉＴꎬＭｏｒｉｗａｋｉＴꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ２Ａꎻ２ꎬａｃａｎｏｎｉｃａｌＤＥＨＹＤＲＡＴＩＯＮ￣ＲＥＳＰＯＮＳＩＶＥＥＬＥＭＥＮＴ￣ＢＩＮＤＩＮＧＰＲＯＴＥＩＮ２￣ｔｙｐｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｓｏｙｂｅａｎꎬｉｓｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙｒｅｇｕ￣ｌａｔｅｄａｎｄｍｅｄｉａｔｅｓｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ１６１(１):３４６－３６１.[４]㊀ＤｕｂｏｕｚｅｔＪＧꎬＳａｋｕｍａＹꎬＩｔｏＹꎬｅｔａｌ.ＯｓＤＲＥＢｇｅｎｅｓｉｎｒｉｃｅꎬＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.ꎬｅｎｃｏｄｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｒｏｕｇｈｔ￣ꎬｈｉｇｈ￣ｓａｌｔ￣ａｎｄｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２００３ꎬ３３(４):７５１－７６３.[５]㊀ＱｉｎＦꎬＫａｋｉｍｏｔｏＭꎬＳａｋｕｍａＹꎬｅｔａｌ.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ￣ａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＺｍＤＲＥＢ２ＡｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎＺｅａｍａｙｓＬ.[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２００７ꎬ５０(１):５４－６９. [６]㊀ＸｕｅＧＰ.ＡｎＡＰ２ｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＨｖＣＢＦ１ａｃｔｉ￣ｖａｔｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓｉｎｂａｒｌｅｙｔｈｒｏｕｇｈｉｎ￣ｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈａ(Ｇ/ａ)(Ｃ/ｔ)ＣＧＡＣｍｏｔｉｆ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏ￣ｐｈｙｓ.Ａｃｔａꎬ２００２ꎬ１５７７(１):６３－７２.[７]㊀ＳｈｅｎＹＧꎬＺｈａｎｇＷＫꎬＨｅＳＪꎬｅｔａｌ.ＡｎＥＲＥＢＰ/ＡＰ２￣ｔｙｐｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｗａｓａＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｏｌｄꎬｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎａｎｄＡＢＡｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].Ｔｈｅｏｒ.Ａｐｐｌ.Ｇｅｎｅｔ.ꎬ２００３ꎬ１０６(５):９２３－９３０.[８]㊀ＳａｋｕｍａＹꎬＬｉｕＱꎬＤｕｂｏｕｚｅｔＪＧ.ＤＮＡ￣ｂｉｎｄｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＥＲＦ/ＡＰ２ｄｏｍａｉｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＲＥＢｓꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃ￣ｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ａｎｄｃｏｌｄ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２００２ꎬ２９０(３):９９８－１００９.[９]㊀ＣｈｅｎＨꎬＬｉｕＬꎬＷａｎｇＬꎬｅｔａｌ.ＶｒＤＲＥＢ２ＡꎬａＤＲＥＢ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆｒｏｍＶｉｇｎａｒａｄｉａｔａꎬｉｎｃｒｅａｓｅｄｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｉｇｈ￣ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].Ｊ.ＰｌａｎｔＲｅｓ.ꎬ２０１６ꎬ１２９(２):２６３－２７３.[１０]ＮｉｕＸꎬＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓＴꎬＢａｔｅＮＪ.ＭａｉｚｅＡＢＩ４ｂｉｎｄｓｃｏｕｐｌｉｎｇｅｌ￣ｅｍｅｎｔ１ｉｎａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄａｎｄｓｕｇａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２００２ꎬ１４(１０):２５６５－２５７５.[１１]ＳｕｎＳꎬＹｕＪＰꎬＣｈｅｎＦꎬｅｔａｌ.ＴＩＮＹꎬａｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ(ＤＲＥ)￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ￣ｌｉｋｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｃｏｎ￣ｎｅｃｔｉｎｇｔｈｅＤＲＥ￣ａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００８ꎬ２８３(１０):６２６１－６２７１.[１２]ＤｏｎｇＣＪꎬＬｉｕＪＹ.ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＥＡＲ￣ｍｏｔｉｆ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏ￣ｔｅｉｎＲＡＰ２.１ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎａｃｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｔｏｋｅｅｐｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｎｄｅｒｔｉｇｈｔｃｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ１０:４７.３１㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李永波ꎬ等:小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[１３]ＬｉｎＲＣꎬＰａｒｋＨＪꎬＷａｎｇＨＹ.ＲｏｌｅｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＲＡＰ２.４ｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｌｉｇｈｔ￣ａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｒｏｃｅｓ￣ｓｅｓａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｐｌａｎｔꎬ２００８ꎬ１(１):４２－５７.[１４]ＰｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉＡꎬＲｅｙｎｏｌｄｓＭꎬＰａｃｈｅｃｏＭꎬｅｔａｌ.Ｓｔｒｅｓｓ￣ｉｎ￣ｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｗｈｅａｔｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＤＲＥＢ１Ａｇｅｎｅｄｅｌａｙｓｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓｓｙｍｐｔｏｍｓｕｎｄｅｒｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｅꎬ２００４ꎬ４７(３):４９３－５００.[１５]ＺｈｏｕＹꎬＣｈｅｎＭꎬＧｕｏＪꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｏｙｂｅａｎＤＲＥＢ１ｅｎｈａｎｃｅｓｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２０２０ꎬ７１(６):１８４２－１８５７. [１６]刘洋洋ꎬ郭栋ꎬ楚秀生ꎬ等.转ＤＲＥＢ基因小麦新品系抗旱生理指标测定[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０１３ꎬ４５(３):３８－４１. [１７]ＣｈｅｎＭꎬＸｕＺꎬＸｉａＬꎬｅｔａｌ.Ｃｏｌｄ￣ｉｎｄｕｃｅｄｍｏｄｕｌａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅꎬＧｍＤＲＥＢ３ꎬｉｎｓｏｙｂｅａｎ(ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ.)[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２００９ꎬ６０(１):１２１－１３５.[１８]ＣｈｅｎＭꎬＷａｎｇＱＹꎬＣｈｅｎｇＸＧꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ２ꎬａｓｏｙｂｅａｎＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｃｏｎｆｅｒｒｅｄｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｉｇｈ￣ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２００７ꎬ３５３(２):２９９－３０５.[１９]ＴｕＴＱꎬＶａｃｉａｘａＰꎬＬｏＴＴＭꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ６ꎬａｓｏｙｂｅａｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｎｏｔａｂｌｙａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮｔＰ５ＣＳａｎｄＮｔＣＬＣｇｅｎｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｓａｕｄｉ.Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｓｃｉ.ꎬ２０２１ꎬ２８(１２):７１７５－７１８１.[２０]倪志勇.小麦ＤＲＥＢ转录因子的分子生物学特性分析及功能鉴定[Ｄ].杨凌:西北农林科技大学ꎬ２００８.[２１]ＳａｒｋａｒＴꎬＴｈａｎｋａｐｐａｎＲꎬＭｉｓｈｒａＧＰꎬｅｔａｌ.ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｓｅｏｆＤＲＥＢｆｏｒｉｍｐｒｏｖｅｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒ￣ａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｒｏｐｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔｓꎬ２０１９ꎬ２５(６):１３２３－１３３４.[２２]ＣａｏＢꎬＨｅＸꎬＬｕｏＹꎬｅｔａｌ.Ｓａｆｅｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｂｉｎｄｉｎｇ(ＤＲＥＢ)４ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ.ｃｏｌｉ[Ｊ].ＦｏｏｄａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ５０(１１):４０７７－４０８４.[２３]徐兆师.小麦抗逆相关转录因子基因的克隆与鉴定[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２００５.[２４]范玉清ꎬ刘恒ꎬ任伟.拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ转录因子的原核表达和多克隆抗体制备[Ｊ].植物生理学通讯ꎬ２００７ꎬ４３(３):５３３－５３７.４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。
细胞生物学部分考研真题整理第三章细胞生物学研究方法一、名词解释激光扫描共聚焦显微术（06中科）绿色荧光蛋白（03北师）(04武大) (西北大学03)基因敲除（03北师）(西北大学05)原位杂交（04北师）（04曲师大）免疫共沉淀（05北师）RT-PCR（06北师）细胞原代培养（06北师）（07华中师大）细胞融合（06北师）(浙江师大07)显微镜分辨率（07华中师大）(西北大学04)Cytoplast(04武大) (西北大学03) （03华南师大）（04曲师大）monoclonal antibody (西北大学05) (浙江师大07)nucleosome(西北大学05) (04山师)fluorescence microscopy(西北大学05)Southern blotting(西北大学05)DNA指纹技术(西北大学04)Northern bloting(西北大学04) (西北大学03)酵母双杂交技术(西北大学04)Western bloting(西北大学03)接触抑制(浙江师大07)转基因植物(04中科大)细胞培养（04华南师大）组织中心免疫细胞化学技术（04华南师大）免疫胶体金技术（03华南师大）细胞工程（03华南师大）(06东北师大)非细胞体系(06山师) (04山师) (04夏大)分子杂交（05曲师大）Autoradiography(04南开)二、简答及问答1. 请简单谈谈下列仪器的要紧用途与特点1）干涉差显微镜（ICM）2）激光共聚焦扫描显微镜（confocal）3）电荷偶连仪（CCD）4）流式细胞仪（flow cytometry）(05武大)2. ? 细胞生物学实验的镜检标本制备中为什么务必取材新鲜且迅速固定？透射电镜观察的样品为什么务必事前进行脱水处理？(04武大)3. 为什么体外培养的癌细胞能在悬浮条件下增殖生长，而正常细胞却只能在贴壁培养时增殖生长？(04武大)4. 分析细胞融合技术在人类基因组物理作图中的应用价值。
