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冬虫夏草中腺苷的检测腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。
腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。
腺苷是用于合成三磷酸腺苷（atp）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。
通过市场调查和实验结果，发现冬虫夏草造假现象严重。
冬虫夏草，是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效，是一种传统的名贵滋补中药材。
因其价格昂贵，市场上不断有有假冒伪劣产品涌现。
科标化工分析检测中心可以依照iso、astm、din、gb、hb等标准顺利完成食品、药品、保健品、饲料、纺织品、农业、高分子材料、生物产品、建筑材料以及微生物产品化学性能、力学性能、电气性能等测试。
中心通过了中国国家证书普遍认可监督管理委员会和中国合格测评国家认可委员会的二合一（cma、cnas）实验室证书普遍认可，能够出示权威的第三方检测报告。
冬虫夏草中腺苷的检测(高效液相色谱法)科标化工分析检测中心参考《中华人民共和国药典》第一部，2021年版冬虫夏草项下，试样经消灭、过筛后，使用90%甲醇溶剂超音波抽取，后高效率液相色谱法测量腺苷含量，再根据药典规定辨别其真假好坏。
二、仪器和试剂thermoscientific高效率液相色谱仪拎紫外检测器，as3120超声波发生器，hh-4lenses恒温水浴锅；甲醇为色谱氢铵试剂，实验用水为超纯水。
取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90％甲醇10ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用90％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱柱：thermoscientific-c18(250×4.6mm，粒径5μm);检测波长：260nm；流动二者：以磷酸盐缓冲液(ph6.5)～甲醇(85：15)为流动二者；流速：1.0ml/min进样量：10μl。
摘要目的：建立用HPLC法测定冬虫夏草及含片中腺苷的含量。
方法：C18(4.6mm×250mm,5um)色谱柱，0.05mol·L-1磷酸二氢钾+甲醇（90+10）为流动相，流速为1.0ml·min-1,检测波长260nm，柱温为35℃。
结果：腺苷含量在0.005～0.2ug(r=0.9998)范围内呈良好的线性关系。
平均回收率为99.49%，RSD=1.47%。
结论：方法准确可靠、、结果稳定、重现性好，分析速度快，可有效控制制剂的质量。
关键字：HPLC；冬虫夏草菌粉；含片；腺苷；DADAbstractObjective: to determine the content of adenosine Cordyceps powder andtablets by HPLC method. Methods: kromasil--C18 ( 4.6mm ×250mm , 5um) column, using methanol two hydrogen 0.5mol • L-1 phosphoric acid (90:10) as mobile phase, the flow rate was 1.0ml • min-1, the detection wavelength was 260nm, the column temperature was 35℃. Results: adenosine in 0.005 ~ 0.2ug (r=09998) showed a good linear relationship in the range of. The average recovery was 101.16%, RSD=1.47%. Conclusion: the method is Conclusion: the method is accurate and reliable, strong specificity, results stability, good reproducibility, which can effectively control the quality of the preparation. Keywords: Cordyceps sinensis powder; tablet; adenosine; HPLC目录摘要 (I)Abstract .................................................................................................................................... I I 1. 前言 (2)1.1 仪器与试药 (2)2. 实验条件 (2)2.1 供试品提取溶剂的选择 (2)2.2 检测波长的选择 (2)2.3 流动相的选择 (3)3.试验方法与结果 (3)3.1 分析溶液 (3)3.1.1 对照品溶液制备 (3)3.1.2 供试品溶液制备 (3)3.2 色谱条件 (3)3.3 分析方法学考察 (3)3.3.1 系统适应性试验 (3)3.3.2 标准曲线绘制及线型范围考察 (4)3.3.3 精密度试验 (4)3.3.4 重复性试验 (4)3.3.5 稳定性试验 (4)3.3.6 加样回收率试验 (4)3.3.7 样品测定 (5)4. 讨论 (5)4.1 (5)4.2 (5)4.3 (5)参考文献： (6)致谢 (7)1. 前言冬虫夏草，仅仅是我国190多种虫草中的一种，也是中药传统的滋补药材。
高效液相色谱法测定人工虫草中腺苷和腺嘌呤的含量摘要：目的：建立HPLC法测定虫草中的腺苷和腺嘌呤的方法。
方法:采用高效液相法，Kromasil C18色谱柱(4.6 x 150mm,5µm)，流动相为1%乙酸甲醇-乙腈(V/V)，流速0.9ml.min-1,检测波长为2600nm。
结果:腺嘌呤在0.59-1.18 mg/mL（r=0.9998）范围内峰面积与浓度呈良好线性关系，平均加样回收率为97.5%，RSD=2.32%（n=6），腺苷在1.47-2.94mg/mL（r=0.9998）范围内峰面积与浓度呈良好线性关系, 平均加样回收率为96.5%，RSD=1.37%（n=6）,结论:该方法操作简便、灵敏度高、重现性好、专属性强，适用于人工虫草腺苷及腺嘌呤含量的测定。
为人工虫草在临床医学应用及新药开发提供了基础研究数据。
关键词: 高效液相色谱法；虫草；腺苷；腺嘌呤；含量[中图分类号] R-33 [文献标识码] A 文章编号：冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌 Cordyceps sinensis (Berk) Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体[1],为我国传统名贵中药材,主产于西藏、青海的高寒草甸。
近年来,由于对野生冬虫夏草的过度采挖,导致虫草资源逐渐枯竭,人工虫草的培育研究应运而生。
人工北虫草又称北冬虫夏草、蛹虫草(Cordyceps militaris),是从天然北虫草分离得到的菌种拟青霉(Paecilomyces militaris)经人工培养所获得的子实体,与冬虫夏草同属异种。
据报道人工发酵的菌丝体产物，其化学成分与天然虫草基本相似[2]。
中国药典2005年版把腺苷作为冬虫夏草的定量指标[3].已有一些文献报道使用HPLC方法测定虫草中核苷类成分[4-6]。
为了考察人工虫草菌粉的质量，本实验应用HPLC，在相同色谱条件下测定人工虫草菌粉中腺苷和腺嘌呤的含量。
图4 不同倍体中华芦荟形态特征比较1.四倍体2.二倍体3 讨论3.1 芦荟繁殖一般用侧芽插条进行,但是生根时间长,出侧芽系数小,不能满足大面积栽培和推广。
如用组织培养快速繁殖法,1年内可培育出数以万计的植株。
3.2 利用快繁技术,不仅可缩短育种年限,而且可使新品种在短时期内得以推广应用。
3.3 中华芦荟、库拉索芦荟及其4倍体都可在MS +2.0mg・L-162BA+0.2mg・L-1NAA的培养基中分化成苗,并快速增殖。
3.4 利用秋水仙素作诱导剂,在无菌条件下采用浸泡处理可培育出多倍体。
其中以丛生芽浸入0.5%的秋水仙素溶液24h效果最好,不但诱导率高(50%),且获得的多倍体纯合体与嵌合体比为9∶1。
3.5 由于药用植物多倍体育种对增加产量和化学成分含量,对培育具有利生物学特性的新品种,具有极大的潜力。
而药用芦荟多倍体育种至今还属空白。
因此,我们希望对中华芦荟和库拉索芦荟进行多倍体诱导,获得多倍体植株,经过进一步的研究,选育优质、高产量的芦荟新品种。
[参考文献][1] 肖志艳.芦荟属植物的化学成分.国外医药・物药分册,1991,16(5):292.[2] 张镜清.芦荟.生物学通报,1999,34(11):44.[3] 谢启昆.药用植物组织培养.上海:上海科学出版社,1985.125.[4] 袁阿兴,康书华,覃 凌.斑纹芦荟中芦荟苦素的分离鉴定.中国中药杂志,1991,16(5):292.[责任编辑 王康正]不同产地冬虫夏草腺苷含量的测定夏文娟1,曾晓英2,袁海龙3,尹定华1,杨大坚1,秦松云1,肖小河3(1.重庆市中药研究院,重庆 400065;2.广东太阳神集团公司,广东广州 510620;3.中国人民解放军第302医院药学部,北京 100039)[摘要] 目的:评价不同产地冬虫夏草的药材内在质量。
方法:以腺苷含量作为评价冬虫夏草内在质量的主要指标,以高效液相法测定来源于13个产地的优质冬虫夏草的腺苷含量。
山东蚕业2009年第2期高效液相色谱法测定虫草中虫草素和腺苷含量的研究*施新琴 顾寅钰 张亚平 刘志斐 李化秀(山东省蚕业研究所)虫草历来为传统名贵中药,其中最著名的有冬虫夏草C.sinensis(Ber kely)Sacc和蛹虫草Cordyceps m ilitaris(L.exFr.)L i n k2种,虫草中所特有的虫草素、虫草腺苷和虫草多糖等活性物质一直是专家学者争相研究的热点。
虫草素因其能干扰细胞RNA和DNA的合成,抑制不正常细胞(癌细胞)的分裂并能作为区别细胞中不同的RNA聚合酶的工具,具有抗肿瘤、抗病毒等方面的作用,由此引起医学界的高度重视。
虫草腺苷则在抗病毒,抗菌,预防治疗脑血栓、脑溢血,抑制血小板积聚,防止血栓形成,消除面斑和抗衰防皱等方面效果较佳。
虫草中虫草素和虫草腺苷含量均偏低,提纯其活性成分可以更好的开发利用虫草,因此快速、准确的检测虫草素和虫草腺苷含量至关重要。
陈千良、孙诗清、汪宇和张莉等人分别作了相关的研究,但普遍存在分离效果不佳、可靠性不够理想以及目标峰保留时间太长等缺点,故在应用普及方面受到了较大限制。
为此,我们在借鉴夏敏等方法的基础上进一步优化色谱条件,建立了新的反相高效液相色谱法测定虫草素和虫草腺苷,并用该方法测定了北虫草的虫草素和虫草腺苷的含量,取得了较为理想的效果。
1 材料与方法1.1 材料及主要试剂和仪器材料:本研究室培育的蚕虫草样品,经80 烘干,粉碎,过80目筛后,-20 冷冻保存待测。
试剂:虫草素标样(SI GMA),虫草腺苷(常州大康);四氢呋喃(色谱纯),甲醇(色谱纯); KH2PO4,K2H P O4、乙醇均为分析纯,试验用水为自制双蒸水。
仪器:高效液相色谱仪(大连依利特), WATERS NOVPAK-C18色谱柱(5 m 40c m);超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产);格兰仕微波炉;0.2 m滤膜,25 L 微量进样器。
1.2 方法1.2.1 虫草素和虫草腺苷的提取:准确称取虫草样品0.1g,加入双蒸水1mL,涡流1m i n,微波中高火提取1m i n,静置得虫草素、虫草腺8*资助项目:山东省农业科学院青年基金项目(编号2007YQN023)2009年第2期山东蚕业苷提取液,过0.2 m 滤膜得待测液。
HPLC法测定冬虫夏草菌粉及含片中腺苷的含量俞青芬【摘要】采用Kromasil-C18(4.6 min×250 mm,5 μm)色谱柱,以0.05 mol/L磷酸二氢钾-甲醇(90 : 10)为流动相,流速为1.0 mL·min-1,检测波长260 nm,柱温为35℃,建立HPLC法测定冬虫夏草菌粉及含片中腺苷的含量.实验结果表明,腺苷含量在0.005～0.2μg(r=0.999 3)范围内呈良好的线性关系,平均回收率为101.19%,RSD=1.45%(n=3).该方法准确可靠、结果稳定、重现性好,可有效控制制剂的质量.【期刊名称】《广西师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(028)002【总页数】4页(P65-68)【关键词】冬虫夏草菌粉;含片;腺苷;HPLC【作者】俞青芬【作者单位】青海民族大学,化学系,青海,西宁810007【正文语种】中文【中图分类】O652冬虫夏草［C o rdy cep s sinensic（Berk.）Sacc.］为麦角菌科真菌冬虫夏草菌在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是中国特有的虫生真菌，是传统的名贵药材，它能补肾壮阳、易肺平喘、止血化痰，可用于治疗多种疾病，如病后体虚、阳痿遗精、肾虚腰疼、健忘、肺虚咳喘等［1］。
现代医学研究也证实，虫草有祛痰平喘、改善肾功能、提高免疫能力、降血脂、调节性功能、抗衰老、抗癌［2-3］等作用。
冬虫夏草的主要成份为腺苷，2000版中国药典［4］及文献［5］均采用高效液相色谱法测定腺苷的含量。
但在实验中采用上述2种方法检测，峰形对称性不好，严重拖尾且有一干扰峰。
反相HPLC色谱法具有快速、准确、简单、精密度高、重复性好、检出限低等优点，在中药材及其制剂有效成份分析检测方面有一定的应用潜力［6-8］。
我们采用RP-HPLC［9-10］分离技术测定冬虫夏草菌粉及含片中腺苷的含量，方法具有快速、准确、重现性好及样品前处理方法简单易行、回收率高等优点［11］，为其质量鉴定和制剂质量控制提供了理论依据，并可为含上述藏药的制剂提供新的定量方法。
摘要目的：建立用HPLC法测定冬虫夏草及含片中腺苷的含量。
方法：C18(4.6mm×250mm,5um)色谱柱，0.05mol·L-1磷酸二氢钾+甲醇（90+10）为流动相，流速为1.0ml·min-1,检测波长260nm，柱温为35℃。
结果：腺苷含量在0.005～0.2ug(r=0.9998)范围内呈良好的线性关系。
平均回收率为99.49%，RSD=1.47%。
结论：方法准确可靠、、结果稳定、重现性好，分析速度快，可有效控制制剂的质量。
关键字：HPLC；冬虫夏草菌粉；含片；腺苷；DADAbstractObjective: to determine the content of adenosine Cordyceps powder andtablets by HPLC method. Methods: kromasil--C18 ( 4.6mm ×250mm , 5um) column, using methanol two hydrogen 0.5mol • L-1 phosphoric acid (90:10) as mobile phase, the flow rate was 1.0ml • min-1, the detection wavelength was 260nm, the column temperature was 35℃. Results: adenosine in 0.005 ~ 0.2ug (r=09998) showed a good linear relationship in the range of. The average recovery was 101.16%, RSD=1.47%. Conclusion: the method is Conclusion: the method is accurate and reliable, strong specificity, results stability, good reproducibility, which can effectively control the quality of the preparation. Keywords: Cordyceps sinensis powder; tablet; adenosine; HPLC目录摘要 (I)Abstract .................................................................................................................................... I I 1. 前言 (2)1.1 仪器与试药 (2)2. 实验条件 (2)2.1 供试品提取溶剂的选择 (2)2.2 检测波长的选择 (2)2.3 流动相的选择 (3)3.试验方法与结果 (3)3.1 分析溶液 (3)3.1.1 对照品溶液制备 (3)3.1.2 供试品溶液制备 (3)3.2 色谱条件 (3)3.3 分析方法学考察 (3)3.3.1 系统适应性试验 (3)3.3.2 标准曲线绘制及线型范围考察 (4)3.3.3 精密度试验 (4)3.3.4 重复性试验 (4)3.3.5 稳定性试验 (4)3.3.6 加样回收率试验 (4)3.3.7 样品测定 (5)4. 讨论 (5)4.1 (5)4.2 (5)4.3 (5)参考文献： (6)致谢 (7)1. 前言冬虫夏草，仅仅是我国190多种虫草中的一种，也是中药传统的滋补药材。
冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，主要活性成分是虫草素，是中国特有的虫生真菌，其有调节免疫力功能、抗肿瘤、抗疲劳等功效。
在药理学现代研究结果中，青海冬虫夏草含有腺苷约7%，糖类28.9%，脂肪约8.4%，蛋白质约25%。
其中冬虫夏草中82.2%为不饱和脂肪酸[1]。
此外冬虫夏草中主要成分为腺苷，在2000版中国药典［2］和文献报道［3］中均采用高效液相色谱法测定虫草中腺苷的含量。
在实际分析检测中其两种方法检测时，峰形对称性不佳，有一干扰峰且干扰严重，为了改善它对样品提取条件进行改进，取得了较好的效果，对冬虫夏草的质量控制提供了一定的技术依据。
分析实验采用HPLC（高效液相色谱法）［4，5］分离技术，性能未定，能快速、准确测定其含量，样品的预先处理方法简单易行。
1.1 仪器与药品的选择（1）Agilent1100高效液相色谱仪，配置在线脱气机、高压泵及梯度洗脱装置、自动进样器、C18(4.6mm×250mm,5um)色谱柱、光电二极管阵列检测器（DAD）、Agilent色谱工作站、JD—500E超声波清洗器，优普超纯水机。
（2）腺苷标准品（上海永叶生物科技有限公司），水为UP水，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
（3）冬虫夏草、冬虫夏草含片在青海省格尔木市冬虫夏草雪域专卖店购买。
2. 分析测定前的准备2.1试验样品的预处理首先为了试验结果具有代表性，选择青海玉树品质优良的冬虫夏草。
冬虫夏草和含片通过研钵研成粉末，这样有利于30%乙醇提纯。
在样品预处理过程中应该防止引入其他杂质和腺苷含量的损失。
2.2 试验提取样品溶剂的选择由于腺苷的含量较低，干扰成分多，曾采用药典方法及文献报道［2,3］的方法，用90%甲醇和15%甲醇提取，均分离不好，拖尾严重，后经多次实验，采用30%乙醇超声提取后，蒸干，进行检测，峰形的对称性比较好，并消除了腺苷峰的拖尾现象及干扰峰，取得了较好的分离效果。
2.3 HPLC检测器波长的选择取腺苷标准品溶液适量，调节波长在200~400nm区间，在光电二极管阵列检测器中测出吸收光谱图，结果显示在260nm处有最大吸收，因此选择260nm为检测波长。
2.4 流动相的选择利用药典方法中流动相：磷酸盐缓冲液（PH6.5）［取0.01mol·L-1磷酸二氢钠68.5ml 与0.01mol·L-1磷酸二氢钠31.5ml，搅拌均匀，调PH6.5］甲醇（17：3）及0.05mol·L-1磷酸二氢钾—甲醇为流动相，经过这两种流动相的试验，选择0.05mol·L-1磷酸二氢钾—甲醇为流动相，以不同与比例进行反复试验，确定比例为(90:10)时峰形及出峰时间适宜。
3.测定方法及测定结果3.1 分析溶液3.1.1 制备对照品的标准溶液准确称取腺苷标准品0.0160g（经五氧化二磷为干燥剂减压24h），再加入30%的乙醇溶液溶解，加入50ml容量瓶中稀释至刻度线，摇匀，作为标准品储备液。
3.1.2 样品溶液的制备准确称取冬虫夏草含片和菌粉各2.0000g，分别准确加入30%的乙醇溶液10ml，密塞，称定重量，超声30min，放至室温，再称定质量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤。
按同样方法连续3次，将所得的滤液置于100ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，作为试验溶液。
3.2 HPLC色谱条件色谱柱：C18,(4.6mm×250 mm，5um)；流动相：0.05mol·L-1磷酸二氢钾+甲醇（90+10）；检测波长260nm；流速1.0ml·min-1；柱温：35℃。
3.3 HPLC的试验过程及测定结果3.3.1 系统适应性的试验在上述色谱条件下，分别把试验溶液、标准品溶液放入自动进样器由计算机自动控制定量阀（进样量为10ul），按预先编制注射样品的操作程序工作。
取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的转动，全部按预定程序自动进行。
试验色谱图中，在与标准品色谱图相应保留时间上，有一相同的色谱峰。
（色谱图见图1）11(A)(B)图1样品（A）与标准品（B）HPLC色谱图Fig 1.HPLC Chromatograms of reference sample (A) and substance (B) 1-腺苷（adenosine）3.3.2 绘制标准、线型曲线的范围控制准确称取腺苷标准品，用甲醇稀释并制成每1ml含20ug的溶液。
分别进样7次（0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0）ul，按上述色谱条件测定，并以进样量为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。
得回归方程：Y=8155.3X-6.5954，r=0,9998。
腺苷在0.005～0.2ug范围内有良好的线性关系。
3.3.3 仪器精密度的试验准确吸取上述标准品溶液适宜，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录腺苷面积，计算RSD（标准偏差）为1.35%。
3.3.4 重复性试验精密称取同一批号样品5份，以供试品溶液制备及上述色谱条件，平行测定6次，测定腺苷的含量分别为0.07431、0.07534、0.07485、0.08127、0.07853（mg·ml-1）,平均含量为0.07686mg·ml-1,RSD为0.27%（n=5）。
3.3.5 稳定性试验取精密度试验的标准品溶液，在室温下放置12、48h后测定，记录峰面积，两次测定的RSD为1.03%，1.31%。
此方法稳定性较好。
3.3.6 加样回收率试验称取已知含量的同一批样品3份，准确加入腺苷标准品适量，按样品测定，并用甲醇稀释一定含量，计算回收率。
结果见表1.表1 加样回收率试验Table 1 sample recovery rate test批号原含量（ug）加入量（ug）测定值（ug）回收率（ug）平均回收率（ug）RSD(%)1 6.4590 0.5090 7.0024 101.762 6.4380 0.7635 7.2524 107.47 99.49 9.33 6.4470 0.9753 7.5025 89.253.3.7 样品测定取不同批号的样品，按[3.1.2]项下的方法制成试验溶液。
在选定的色谱条件下，对冬虫夏草菌粉及含片进行测定。
计算腺苷的含量，测定结果见表2。
表2 样品含量测定结果Table 2 results of sample determination编号（No ）含量（content）mg RSD(%)菌粉1 0.15734 0.98含片2 0.07618 1.054. 讨论4.1在与虫草药典和文献中相比，此实验在腺苷的提取方法上做了改进；由超声波提取法法跟同流提取法比较得出，选择超声波提取法工作30min效果最好。
其次对乙醇提取的浓度做出比较分析，结论是：30%的乙醇比95%乙醇提取的完全（结果可见表2）。
最后得出实验结论冬虫夏草菌粉中腺苷的含量高于含片中腺苷的含量。
4.2进行检测时用磷酸三钠溶液溶解样品，其流动相的浓度比例对虫草腺苷的分离峰形有一定的影响，由多次实验得出结论，0.05mol·L-1磷酸二氢钾-甲醇在流动相中的浓度比例应控制在（90:10）为佳。
