配置Sf9细胞培养液方法

细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。

（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。

（3）提前做好复苏准备，预热培养基。

（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。

（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。

悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。

（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。

低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。

3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。

（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。

（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。

根据细胞数决定下游实验。

（4）细胞需计数两次求平均值。

（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。

以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。

要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。

（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。

sf9细胞冻存方法
SF9细胞是一种昆虫表达系统中常用的细胞系。

下面是一种常
见的SF9细胞冻存方法：
1. 在培养皿中培养SF9细胞至高密度（通常为培养皿80-90%
的细胞覆盖度）。

2. 用DPBS（无钙无镁的磷酸盐缓冲液）洗涤细胞一次，以去
除培养基和细胞碎片。

3. 使用酶解液（例如Trypsin-EDTA）将细胞从培养皿中解离。

根据细胞的密度，可以使用适当的溶菌酶/胰酶酶解细胞。

4. 加入同等体积的冻存培养基（通常为细胞培养基中含有20-50%的人血清、10%的二甲基亚砜（DMSO）和1-2%的低浓度抗生素的培养基）。

5. 轻轻混合并将混合液转移到冻存管中。

6. 使用-80℃冰箱或液氮罐冷却细胞冻存过程。

最好将细胞冻
存在气相中且不接触液氮。

7. 冻存细胞超过12小时后，将冻存管从液氮中转移到-150℃
以上的长期液氮储存罐中。

使用这种冻存方法，SF9细胞可以在-70℃至-80℃下保存6个
月至1年以上。

为了确保细胞质量，建议每6个月检查一次细胞的生长和表达能力。

请注意，在冻存细胞前，确保培养细
胞没有被细菌、真菌等污染，以避免污染的细胞冻存在长期储存中。

SHENTEK®Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）说明书货号：1301310在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意点和常见问题！版本：A/0仅供研究用湖州申科生物技术股份有限公司⏹产品名称通用名：Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）。

⏹包装规格96测试/盒。

⏹预期用途Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）适用于昆虫细胞Sf9来源的宿主蛋白残留定量检测，如基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的生物制品，包括但不限于重组蛋白、疫苗，基因治疗AAV载体等。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。

⏹检测原理本试剂盒基于固相酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的方式对样品中残留Sf9HCPs进行定量检测。

该试剂盒内的多克隆抗体是通过裂解sf9细胞所得HCPs作为抗原，免疫绵羊获得血清，进而通过亲合纯化方法得到高质量抗体。

抗体通过目前主流的覆盖率分析法规方法评估其覆盖率水平。

该分析方法通过在预包被抗Sf9HCPs多克隆抗体的酶标板中加入校准品或待测样品、HRP标记的抗Sf9HCPs多克隆抗体进行共孵育；洗涤后，利用加入的TMB底物进行显色反应，最后使用终止液终止酶催化反应。

利用酶标仪在450nm波长下测读吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的HCPs浓度成正相关，通过剂量-反应曲线可计算得出样品中Sf9HCPs的浓度。

本试剂盒对实际样品无需进行特殊处理，仅需通过合适的稀释比例进行适用性验证即可直接使用。

本试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。

图1检测原理示意图试剂盒组分表1.试剂盒组分组分产品号规格说明Sf9HCP 校准品PNB0112瓶冻干粉。

精确量取500μL复溶液，溶解，静置约5分钟，溶液应该澄清透明，无肉眼可见不溶物。

具体浓度见瓶身标注。

抗Sf9HCP 预包被酶标板PNA0128孔×12条已包被适量的绵羊抗Sf9HCPs多克隆抗体，铝箔袋密封包装，含干燥剂。

2020年第8期 吉林畜牧兽医97·经验交流·JingYan JiaoLiuSF9细胞的建立及生物学特性的鉴定李来旭1，刘鑫莹1、潘添博2，李 睿31.重庆永健生物制品有限公司，重庆市 400000；2.重庆市合川区合阳城街道办事处畜牧兽医站，重庆市 400000；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150000摘 要：自菌种保藏中心引进1株SF9细胞系，扩大培养，保存于液氮，建立SF9细胞基础细胞库。

对细胞进行形态、生长曲线、纯净性、染色体分析及致瘤性等特性进行研究。

结果表明，细胞呈圆球形；细胞呈S 型生长曲线；无细菌、支原体及外源病毒污染；细胞的染色体数目主要分布在170～190之间；无致瘤性。

关键词：SF9细胞系；基础细胞库；生物学特性杆状病毒表达系统(BEVS)被广泛用于疫苗开发及外源蛋白表达。

BEVS 因其操作简便、安全性及适用于大规模生产等优势, 具有极大的应用前景。

杆状病毒表达的受体为昆虫细胞，目前应用较广的细胞系为SF9细胞。

目前兽用疫苗领域针对猪圆环病毒、禽流感病毒、猪瘟病毒及鸡新城疫病毒等多疫苗在SF9 细胞中表达，极大程度上缓解了畜牧业的养殖风险和生产成本。

本研究自菌种保藏中心引进SF9细胞系，进行细胞生物学特性研究，为开展SF9细胞系及及传染性法氏囊VP2疫苗的研究与开发提供细胞资源和理论依据。

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞SF9细胞，购自美国菌种保藏中心ATCC。

1.1.2 试验试剂：SF9无血清培养基，胎牛血清，DMSO 购自美国gibco 公司；无菌培养基，重庆永健生物制品有限公司制备。

1.2 方法1.2.1 细胞传代：取对数生长期的SF9细胞，以900 r/min 离心5 min，弃去上清，用SF9无血清培养基稀释细胞密度为0.8×106个/mL 分装到三角培养瓶中。

培养转速为150 r/min，置27 ℃培养箱中培养。

1.2.2 基础细胞库的建立 取生长状况良的好SF9细胞进行离心，加入冻存液，吹打混匀细，调节细胞密度为1.2×107个/m L ，每只冻存管分装1 mL。

Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。

此细胞系适用于InsectSelect系统。

这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。

（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。

贴壁紧。

标准条件的定义：培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。

活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。

贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。

形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。

确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。

Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。

细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。

当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。

1. 用细胞计数板计数细胞。

需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。

细胞可是悬浮或贴壁培养；2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；3. 室温400-600×g离心10min。

移除上清。

4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；7. 储存于液氮中。

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