配置Sf9细胞培养液方法

细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。

（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。

（3）提前做好复苏准备，预热培养基。

（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。

（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。

悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。

（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。

低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。

3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。

（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。

（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。

根据细胞数决定下游实验。

（4）细胞需计数两次求平均值。

（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。

以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。

要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。

（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。

sf9细胞冻存方法
SF9细胞是一种昆虫表达系统中常用的细胞系。

下面是一种常
见的SF9细胞冻存方法：
1. 在培养皿中培养SF9细胞至高密度（通常为培养皿80-90%
的细胞覆盖度）。

2. 用DPBS（无钙无镁的磷酸盐缓冲液）洗涤细胞一次，以去
除培养基和细胞碎片。

3. 使用酶解液（例如Trypsin-EDTA）将细胞从培养皿中解离。

根据细胞的密度，可以使用适当的溶菌酶/胰酶酶解细胞。

4. 加入同等体积的冻存培养基（通常为细胞培养基中含有20-50%的人血清、10%的二甲基亚砜（DMSO）和1-2%的低浓度抗生素的培养基）。

5. 轻轻混合并将混合液转移到冻存管中。

6. 使用-80℃冰箱或液氮罐冷却细胞冻存过程。

最好将细胞冻
存在气相中且不接触液氮。

7. 冻存细胞超过12小时后，将冻存管从液氮中转移到-150℃
以上的长期液氮储存罐中。

使用这种冻存方法，SF9细胞可以在-70℃至-80℃下保存6个
月至1年以上。

为了确保细胞质量，建议每6个月检查一次细胞的生长和表达能力。

请注意，在冻存细胞前，确保培养细
胞没有被细菌、真菌等污染，以避免污染的细胞冻存在长期储存中。

?
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存
? 简易程序：
?
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系
以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按
每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至 液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
细胞复苏方法
? （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ 38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
? （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
? （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
Sf9细胞的传代
? 判断分离（散）细胞培养物是否需要传代 的主要指标就是观察培养物是否已基本长 满培养瓶皿的底壁。
? 一般来说，原代培养物未达到生长基质的 80%表面面积，不要急于传代，对于拟行 首次传代的培养物更如此。
病毒重组，获得重组病毒（酶切酶连转化） 2、将重组的病毒纯化 3、感染昆虫细胞或虫体（转染） 4、外源基因随着病毒的复制而获得表达
*《人细小病毒B19-XA? 株VP1蛋白在Bac-to?-B?ac系统中的表达及其反应原性》 *《Bac-toBac? Baculovirus Expression System 实验流程》
Sf9传代的方法
? 3）接种在新的培养瓶皿内。一般接种两个或者多 个培养瓶皿内。
? 有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传 代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下， 传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。加入培养 液。（平时不做实验时，只需要传一瓶）。
? （以1：5或更多为宜，每 2-3天传代一次） 28℃培养（不用 CO2培养箱）。
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。

SHENTEK®Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）说明书货号：1301310在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意点和常见问题！版本：A/0仅供研究用湖州申科生物技术股份有限公司⏹产品名称通用名：Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）。

⏹包装规格96测试/盒。

⏹预期用途Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）适用于昆虫细胞Sf9来源的宿主蛋白残留定量检测，如基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的生物制品，包括但不限于重组蛋白、疫苗，基因治疗AAV载体等。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。

⏹检测原理本试剂盒基于固相酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的方式对样品中残留Sf9HCPs进行定量检测。

该试剂盒内的多克隆抗体是通过裂解sf9细胞所得HCPs作为抗原，免疫绵羊获得血清，进而通过亲合纯化方法得到高质量抗体。

抗体通过目前主流的覆盖率分析法规方法评估其覆盖率水平。

该分析方法通过在预包被抗Sf9HCPs多克隆抗体的酶标板中加入校准品或待测样品、HRP标记的抗Sf9HCPs多克隆抗体进行共孵育；洗涤后，利用加入的TMB底物进行显色反应，最后使用终止液终止酶催化反应。

利用酶标仪在450nm波长下测读吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的HCPs浓度成正相关，通过剂量-反应曲线可计算得出样品中Sf9HCPs的浓度。

本试剂盒对实际样品无需进行特殊处理，仅需通过合适的稀释比例进行适用性验证即可直接使用。

本试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。

图1检测原理示意图试剂盒组分表1.试剂盒组分组分产品号规格说明Sf9HCP 校准品PNB0112瓶冻干粉。

精确量取500μL复溶液，溶解，静置约5分钟，溶液应该澄清透明，无肉眼可见不溶物。

具体浓度见瓶身标注。

抗Sf9HCP 预包被酶标板PNA0128孔×12条已包被适量的绵羊抗Sf9HCPs多克隆抗体，铝箔袋密封包装，含干燥剂。

血清中含有: 血清中含有: 多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等) ①多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等) ②多种金属离子 激素; ③激素; 促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白, ④促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白,胶 原等. 原等. ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
血清质量好坏是实验成败的关键. 血清质量好坏是实验成败的关键. 常用血清有胎牛血清,新生牛血清,小牛血清, 常用血清有胎牛血清,新生牛血清,小牛血清, 兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好. 兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好. 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物, 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物, 无细菌,支原体,病毒污染. 无细菌,支原体,病毒污染. 血清的灭活(消除补体活性): ):56 血清的灭活(消除补体活性):56 ℃ ,30 min 血清的消毒: 血清的消毒:过滤除菌
实验要求: 实验要求:
进实验室先洗手,签到.进细胞培养室要换鞋. 进实验室先洗手,签到.进细胞培养室要换鞋. 洗手 必须保持显微镜,试验桌,超净台以及其它用具 的清洁和整齐,各种药品,试剂按照规定的用量 进行使用.用完后要恢复摆放位置 进行使用.用完后要恢复摆放位置. 恢复摆放位置. 严格遵守显微镜使用的注意事项,否则损坏物镜, 同时也影响试验的进行. 离开实验室前,必须检查水龙头和电开关,避免 发生事故.
培养皿和培养板等表面消毒
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒, 使空气得到净化. 净化空气徐徐通过工 作台面,使工作台内 构成无菌环境.
生化培养箱
生化培养箱设定的条件为28 ℃ . 使用生化培养箱培养细胞时应注 意的问题: 1)保持培养箱内空气干净.定 期消毒 (90 ℃ ,14 h). 2)箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度,避免培 养液蒸发.

RPMI1640培养液配制过程

准备物品 (1) 不锈钢过滤器, 滤膜(0.45μm,0.22μm),磁 力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶 (2) 培养粉,1N HCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎 牛血清,新5μm和0.22μm滤膜, 包装, 高压 蒸气消毒

培养液配制过程 （以RPMI1640为例）
1. 物品准备
(1）滤器、 微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、 量筒、pH计、贮液瓶等。
(2) 培养粉、 NaHCO3、
1N HCl、青霉素、链霉
素、血清、新鲜制备的
三蒸水
2. 滤器消毒准备
取孔径为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，浸入三蒸水中
(5) 按要求加血清 30min灭活）
（血清一般需经56℃，
例如: 10%胎牛血清
无血清培养液 900ml
灭活胎牛血清
100ml
(6) 正压过滤除菌 (气压适当, 防止滤膜破裂) (7) 分装,贮存于4℃，2周内用完。 (8) 无菌试验 : 取样 , 37℃放置 24－ 72h, 无细 菌、霉菌污染方可使用
细胞培养液的配制

培养基的选择
依据: 经验、文献、尝试 常用: RPMI1640、DMEM 培养基的来源 市售干粉培养基---自己配制 液体培养基---直接使用(注意有效期)



培养基的除菌方法 过滤除菌: (1) 正压过滤---效率高 (2) 负压过滤---效率低 高压蒸气灭菌: 不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加 培养基附加成分的添加 按使用说明或实验要求添加 配制时加: 碳酸氢钠、抗生素、血清等 临用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、 PDGF等
注意事项

2020年第8期 吉林畜牧兽医97·经验交流·JingYan JiaoLiuSF9细胞的建立及生物学特性的鉴定李来旭1，刘鑫莹1、潘添博2，李 睿31.重庆永健生物制品有限公司，重庆市 400000；2.重庆市合川区合阳城街道办事处畜牧兽医站，重庆市 400000；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150000摘 要：自菌种保藏中心引进1株SF9细胞系，扩大培养，保存于液氮，建立SF9细胞基础细胞库。

对细胞进行形态、生长曲线、纯净性、染色体分析及致瘤性等特性进行研究。

结果表明，细胞呈圆球形；细胞呈S 型生长曲线；无细菌、支原体及外源病毒污染；细胞的染色体数目主要分布在170～190之间；无致瘤性。

关键词：SF9细胞系；基础细胞库；生物学特性杆状病毒表达系统(BEVS)被广泛用于疫苗开发及外源蛋白表达。

BEVS 因其操作简便、安全性及适用于大规模生产等优势, 具有极大的应用前景。

杆状病毒表达的受体为昆虫细胞，目前应用较广的细胞系为SF9细胞。

目前兽用疫苗领域针对猪圆环病毒、禽流感病毒、猪瘟病毒及鸡新城疫病毒等多疫苗在SF9 细胞中表达，极大程度上缓解了畜牧业的养殖风险和生产成本。

本研究自菌种保藏中心引进SF9细胞系，进行细胞生物学特性研究，为开展SF9细胞系及及传染性法氏囊VP2疫苗的研究与开发提供细胞资源和理论依据。

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞SF9细胞，购自美国菌种保藏中心ATCC。

1.1.2 试验试剂：SF9无血清培养基，胎牛血清，DMSO 购自美国gibco 公司；无菌培养基，重庆永健生物制品有限公司制备。

1.2 方法1.2.1 细胞传代：取对数生长期的SF9细胞，以900 r/min 离心5 min，弃去上清，用SF9无血清培养基稀释细胞密度为0.8×106个/mL 分装到三角培养瓶中。

培养转速为150 r/min，置27 ℃培养箱中培养。

1.2.2 基础细胞库的建立 取生长状况良的好SF9细胞进行离心，加入冻存液，吹打混匀细，调节细胞密度为1.2×107个/m L ，每只冻存管分装1 mL。

超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
生化培养箱
• 生化培养箱设定的条件为28℃ 。 • 使用生化培养箱培养细胞时应注
意的问题：
• 1）保持培养箱内空气干净。定 期消毒（90 ℃ ，14 h)。
转染基本步骤
• 1、接种细胞并使其贴壁 • 2、制备重组Bacmid与Cellfectin Reagent
（ ）复合物 Invitrogen公司转染试剂 • 3、加入复合物 • 4、去掉复合物混合液，加入完全培养基，
培养细胞直到细胞出现病毒感染迹象 • 5、取上清液分离纯化得目的蛋白
• 4）送入培养箱中继续培养。
细胞培养－换液
• 对于像Sf9这样的半贴壁的培养物，可按如 下步骤操作：
• 吸去或倾出（部分或全部）旧培养液。 • 加入新鲜的培养液。加入的量与换液前的
量相同。 • 放回原来的培养箱中继续培养。
转染
• 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。
病毒重组，获得重组病毒（酶切酶连转化） 2、将重组的病毒纯化 3、感染昆虫细胞或虫体（转染） 4、外源基因随着病毒的复制而获得表达
*《人细小病毒B​1​9-​ X​A​株V​P​1蛋​ 白在B​a​c-​ t​o​-B​a​c系​ 统中的表达及其反应原性》 *《Bac-toBac® Baculovirus Expression System 实验流程》
• （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
• （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。

Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。

此细胞系适用于InsectSelect系统。

这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。

（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。

贴壁紧。

标准条件的定义：培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。

活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。

贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。

形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。

确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。

Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。

细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。

当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。

1. 用细胞计数板计数细胞。

需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。

细胞可是悬浮或贴壁培养；2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；3. 室温400-600×g离心10min。

移除上清。

4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；7. 储存于液氮中。

sf9表达蛋白的操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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1 PBS液溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2 g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

用HCl或NaOH调PH到7.4。

消毒后即可使用2 胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。

搅拌混匀，置于4℃内过夜。

3.青、链霉素溶液：所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

具体操作均在超净台内完成。

青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。

链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。

分装于－20℃保存。

使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。

4 血清的灭活：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

5谷氨酰胺一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。

可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。

配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液6.肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ ml。

因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为??℃。

使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。

7.Hanks液：称取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2H PO4.H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hanks液可以高压灭菌。

sf9昆虫细胞货号基因名称规格货期huayueyang-531sf9昆虫细胞1ml 现货细胞描述：Sf9昆虫细胞，可以用来包装扩增杆状病毒并表达蛋白。

Sf9昆虫细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。

请按照正确的培养方法来复苏、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。

质量控制：本细胞经过严格的质量检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）和支原体等。

培养条件：27℃，PH值7.2~7.4，120–140rpm，无菌恒温培养。

用途：本产品仅供科研使用，不可用于治疗等其他用途。

细胞相关操作：sf9细胞复苏1.37°C水浴预热培养基；2.从液氮中取出细胞放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.在超净台中加入5ml的培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞，用血小球计数板进行细胞计数，按细胞密度3-5×105/ml接种到25ml无菌摇瓶中（带空气过滤通气孔的摇瓶）；5.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。

sf9细胞传代1.取细胞计数(详见sf9细胞冻存)，当细胞密度达到1–3×106/ml时，可传代；2.37°C水浴预热培养基；3.在超净台中，加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为3-5×105/ml接种细胞（也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为3-5×105/ml）；4.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。

注：昆虫细胞对氧的要求较高，因此，悬浮培养必须具有高表面积体积比，否则细胞的生长会受到抑制。

培养基的体积不能超过摇瓶的五分之二；即100毫升的摇瓶不能超过40ml培养基，250ml摇瓶不能超过100ml培养基。

Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺研究李伟;秦红刚;张萍;漆世华;朱薇;王威;谢红玲;温文生;吴玉石【摘要】对Sf9昆虫细胞在不同培养基、培养基中是否添加血清及不同生物反应器中的培养工艺进行了研究,发现Sf9细胞在Sf900Ⅱ无血清培养基中生长比在添加10％小牛血清的Grace培养基中更好,在Sf900Ⅱ无血清培养基14 L搅拌式生物反应器分批培养细胞密度可达1.4×107/mL.过程生化特性分析表明,总氨基酸的消耗及主要代谢副产物特别是乳酸及游离氨的积累是培养后期细胞密度降低及活性下降的重要原因.本研究为Sf9细胞生物反应器培养工艺优化及利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统高效表达重组蛋白生产亚单位疫苗奠定了良好基础.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)008【总页数】4页(P39-42)【关键词】Sf9细胞;生物反应器;生化分析【作者】李伟;秦红刚;张萍;漆世华;朱薇;王威;谢红玲;温文生;吴玉石【作者单位】武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】Q962昆虫细胞杆状病毒表达系统是20世纪80年代发展起来的新型表达载体系统，据报道现已成功应用于500多种外源蛋白的表达［1］。

相比贴壁依附型的哺乳动物细胞，昆虫细胞可直接进行悬浮培养而更具有优越性。

不同昆虫细胞系在不同培养基中的生长动力学及代谢参数已有文献报道［2］。

理论及实验表明，利用重组杆状病毒感染高密度的Sf9细胞可获得高水平的外源蛋白的表达［3］。

培养细胞所需的几种主要液体的配制方法：1．DMEM维持培养基DMEM基础培养基95ml 95ml胎牛血清5ml谷氨酰胺液2ml含有DMEM基础培养基95ml，胎牛血清5ml，谷氨酰胺液2ml。

混合均匀，密封后与4摄氏度保存。

2．D-hank’sD-hank’s干粉g(1袋)NaHCO3超纯水1000ml取D-hank’s干粉加入超纯水500ml搅拌均匀，加入的NaHCO3搅拌至完全溶解，倒入1000ml容量瓶中，用1mol/l的HCL或者NaOH 溶液调整溶液的PH值为7.2,最后经过∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装后4摄氏度保存.3. DMEM完全培养基85ml,DMEM基础培养液85ml,, l-谷氨酰胺溶液, 2ml1000u/ml双抗液1ml胎牛血清15ml取DMEM基础培养基85ml, 胎牛血清15ml,l -谷氨酰胺溶液2ml,混合均匀,密封于4摄氏度保存.4. DMEM细胞基础培养基DMEM干粉(1袋)Na2HCO3超纯水1000 ml取DMEM干粉1袋()倒入烧杯中,取800ml 超纯水溶解培养基干粉,搅拌均匀,然后向溶液中加入的Na2HCO3,搅拌至完全溶解后倾入1000 ml容量瓶中,再用1mol/l 的HCL 或者1mol/l的NaOH溶液调整溶液的PH值为7.2,混合均匀后,定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装4摄氏度保存.5. l-谷氨酰胺溶液l-谷氨酰胺DMEM基础培养基100ml称取l-谷氨酰胺干粉g于烧杯中,加80 ml超纯水于烧杯中搅拌溶解,用100ml容量瓶定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中于-20摄氏度保存.使用添加量是1ml/50ml,使用浓度是2mmol/l.青霉素(注射用) 80万单位(1瓶)链霉素(注射用) 0.8 g％生理盐水80ml取注射用青霉素100万单位及注射用链霉素于80ml DMEM培养基中,搅拌混合均匀,用∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中-20℃％的胰酶溶液胰蛋白酶干粉 0.25 gDMEM基础培养基100ml称取胰蛋白酶干粉0.25 g于烧杯中,加入80ml DMEM基础培养基溶液,进行搅拌溶解,100 ml容量瓶定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中于-20℃条件下保存.8.mg/ml的内皮细胞生长添加物溶液(ECGS)ECGS干粉 15 g(1支)无菌超净水 6 ml取内皮细胞生长添加物15 g(1支),加入6 ml无菌超纯水完全溶解后,分装于-20℃条件下保存.在培养基中添加剂量为1ml/50ml,即培养基浓度为50微克/ ml.9.PBS 液KCLNaclNa2HPO4.12H2OKH2PO4分别取KCL, Nacl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4于烧杯中,加入适量的超纯水搅拌至所有药物完全溶解,然后倾入1000ml容量瓶中,最后定容并调节PH为7.20,分装于4℃保存,。

第19卷第3期1998年8月化　工　冶　金Engineering Chem istry &M etallu rgy V o l 119N o 13A ug 11998收稿日期:1997206209,修回日期:1997210216王晓迟:女,25岁,硕士,生物化学工程专业・研究简报・Sf 9细胞的培养工艺王晓迟 戚艺华 欧阳藩中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室　北京　100080)细胞进行环境pH 值由低到高的值为710的培养液中即不能其次进行了培养液血清浓度由高到低2◊时细胞仍可,104个 m l 数量级是其生长的临界接种密度.关键词　Sf 9细胞,培养工艺,pH 值,血清浓度,接种密度中图分类号　Q 281　前　言80年代以来,Sf 9昆虫细胞—杆状病毒系统被广泛用于各种重组蛋白的表达.该细胞有许多优点,如非贴壁依赖性、培养温度低、可在无血清体系中繁殖等,很适合高密度、大规模培养.与之相关的各种发酵设备也在不断被开发.对Sf 9细胞的研究既能为动物细胞大规模培养找到一个新的对象,又可使推广多种以该细胞为表达系统的基因工程产品成为可能.要利用这株细胞,首先要对其培养工艺有全面、深入的了解,然而目前Sf 9细胞培养工艺方面的研究成果大部分属于商业机密,文献报道很少.本文从静止培养入手,对几项关键性的工艺条件进行了研究.2　材料和方法211　细胞系Sf 9昆虫细胞,来自美国A TCC (160～220代).212　细胞培养液21211　pH 梯度实验培养液用二次蒸馏水溶解IPL 241昆虫细胞培养基干粉(G I BCO ,Inc .),加0135g LN aHCO 3,用215m o l LN aOH 调pH 至设定值,以0122Λm 滤膜过滤除菌,向滤后液中加入2◊胰蛋白肉汤(G I BCO ,Inc .),1◊制霉菌素,50单位 m l 庆大霉素以及10◊的热灭活小牛血清.21212　血清梯度实验培养液先将有血清培养液的pH 调至612,然后加入设定浓度的热灭活血清,除血清条件外其余同上;无血清培养液Sf 2900II SFM (G I BCO ,Inc .)中加入2◊胰蛋白肉汤.872化　工　冶　金19　卷21213　密度梯度实验培养液将pH调至612,加10◊血清,其余同21211.213　实验方法21311　pH梯度实验将在初始pH=612的培养液中生长到对数期的细胞传至pH=615的培养液中,适应生长1代;待细胞密度达到105个 m l以后稳定传代2次;然后依次传至初始pH=618和pH=710的培养液中驯化.观察细胞在每种条件下的生长规律.21312条件下生长到对数期的细胞传至含8◊血清的培养液中,适应生长1周,2次;然后依次传至含5◊和2◊血清的培养液中驯化观察细胞在每种条件下的生长规律.21313密度梯度实验分别以较高密度(5×105和1×105个 m l)、中等密度(5×104和1×104个 m l)及低密度(5×103和1×103个 m l)接种Sf9细胞进行培养,观察细胞在每种条件下的生长规律.3　结果与讨论311　pH梯度实验Sf9细胞在pH=615的环境中适应很快,1代以后就能良好生长,适应pH=618的环境比较困难,连续传代3次才得以稳定生长,在pH=710的环境中始终难以存活.Sf9细胞在不同pH环境中的生长状况如图1所示,以pH=612的培养液中的细胞为对照组.由图可知,Sf9细胞在初始pH=615的培养液中生长良好,与对照组相比差别不大,延迟期24h,最大细胞密度由接种时的104个 m l数量级增加到105个 m l数量级;培养液初始pH=618时,细胞的生长开始受到影响,生长速率缓慢,延迟期增加至48h,最大细胞密度远小于对照组;培养液初始pH值提高到710时,细胞已不能存活.Sf9细胞生长过程中,各组培养液pH值的变化情况见图2.Sf9细胞在初始pH值为612,615和618的3种培养液中生长时,培养液的pH值总体上均呈升高趋势,其pH增加值不超过0131在pH=710条件下细胞已不能正常生长,其培养液pH值的检测也随细胞的死亡而终止.Sf9细胞的最适pH值为612,略偏酸性,而中性条件更利于工业化生产和多种基因工程产品的稳定,因此进行了该细胞对高pH值环境的适应性实验.结果发现,培养液的pH值随着细胞的生长会略有增加,这可能是由于Sf9细胞在生长过程中产生乳酸的量较少,并且在乳酸积累时还会反过来利用它作为碳源;同时培养液中的许多酸性成份如精氨酸等在细胞生长旺盛时被大量消耗,所以引起了培养液pH值升高,但这种升高仍然是缓慢的和不显著的.初始pH=710时培养液pH值的上升可能是由于细胞死亡裂解,释放出胞内碱性成份的缘故.培养液初始pH值提高到615对细胞生长的影响不大,但继续升高至618时细胞的生长状况已明显不如对照组,在初始pH值为710的培养液中Sf9细胞已不能存活,说明此时的pH值已超出了该细胞的适应范围.因此,较大幅度地提高培养液的pH值在Sf9细胞的培养过程中极为困难.图1　Sf 9细胞在各种pH 值条件下的生长曲线F ig 11　Sf 9cell grow th at vari ouspH 图2　各组实验中培养液的pH 值变化曲线F ig 12　V ariati on of pH of culture w ith different initial pH 图3　Sf 9细胞在不同血清浓度的培养液中的生长曲线F ig 13　Sf 9cell grow th in culture w ith different concentra 2ti on of serum312　血清梯度实验Sf 9细胞对于含8◊血清的培养液适应很快,1代之后即可良好生长;适应5◊的血清需传代2次,共12d ;适应2◊的血清较慢,共需3代18d ;由2◊的血清到无血清培养液适应较快,需2代10d .Sf 9细胞在不同血清浓度下的生长状况如图3所示.Sf 9细胞在含8◊血清的培养液中生长良好,延迟期24h ,最大细胞密度由接种时的104个 m l 数量级增加到105个 m l 数量级,与常用浓度10◊条件下基本相同;细胞在含5◊血清的培养液中延迟期增加至48h ,生长速度减慢,但仍属于正常生长状态;当血清浓度降至2◊时细胞仍可生长,出现72h 的延迟期,最大细胞密度值较低;该细胞在无血清培养液中生长良好,各项指标均接近在10◊常用浓度下的情况.因此该细胞具有较强的低血清适应性.同时,Sf 9细胞在已经过优化的市售无血清培养液中生长良好,如需尽可能地消除血清对实验造成的影响,可以考虑采用无血清培养系统.313　密度梯度实验不同接种密度时Sf 9细胞的生长状况如图4～6所示.105个 m l 数量级接种时,Sf 9细胞的生长十分迅速,不出现延迟期而直接进入对数生长阶段,最大细胞密度增加至106个 m l 数量级;104个 m l 数量级接种时,细胞处于正常生长状态,有24h 的延迟期,倍增迅速,最大细胞密度值增加至105个 m l 数量级;103个 m l 数量级接种时,细胞有4d 的延迟期,生长过于缓慢,已失去实际操作意义.当以较高密度接种时,细胞的启动生长极为迅速,这可能是由于细胞密度较高时,与之相关的各种激素、生长因子、酶及其它细胞因子的浓度也较高,同时细胞间的频繁接触有利于多种因子的分泌,从而增强了细胞活力的缘故;当以低密度接种时,细胞生长过于缓慢,说明此接种量限制了细胞的正常生长,因此初始接种密度对Sf 9细胞的生长影响很大,直接关系其延迟期的长短和最大细胞密度值的大小.9723期王晓迟等:Sf 9细胞的培养工艺图4　Sf 9细胞在较高密度接种时的生长曲线F ig 14　Sf 9cell grow th in culturew ith h igh density of inoc 2ulati on 图5　Sf 9细胞在中等密度接种时的生长曲线F ig 15　Sf 9cell grow th in culture w ith m edium density of inoculati on 图6　Sf 9细胞在低密度接种时的生长曲线F ig 16　Sf 9cell grow th in culture w ith low density of inocu 2lati on 另一方面,由图6可知,103个 m l 数量级接种时,细胞生长已不正常,所以104个 m l 数量级是Sf 9细胞的临界接种密度,低于这一密度会出现超长延迟甚至不生长.4　结　论根据上面的实验结果可以得出以下结论:(1)Sf 9细胞对于环境pH 值的适应能力十分有限;在生长过程中,培养液的pH 值是逐渐升高的,但总的变化幅度不大.(2)Sf 9细胞对于低血清环境的适应性很强.(3)初始接种密度对Sf 9细胞的生长影响很大,该细胞的临界密度约为104个 m l 数量级.本文对Sf 9细胞静止培养的几项关键性工艺条件进行了初步研究,其结果可作为进一步放大培养的理论依据.参考文献　1Caro l J .M arcus -Sekura et al .Confo r m ati on -dependent recogniti on of Baculovirus -exp ressed Ep stein -barr V irus gp 350by a Panel of M onoclonal A ntibody .Journal of General V iro logy ,1993,74:2171　2Summ ers M .D .,Sm ith G .E .Baculovirus Structural Po lypep tides .A M anual of M ethods fo r Baculovirus V ecto rs andInsect Cell Culture P rocedures .T exas ,U SA ,T exas A gricultural Experi m ent Stati on and T exas A &M U niversity Co l 2lege Stati on ,1987.10　3王国政等.动物细胞大量培养.生物工程进展,1988,8(4):11　4卢锦汉等.医学生物制品学.北京:人民卫生出版社,1995.528　5W ong et al ,R elati onsh i p betw een O xygen U p take R ate and T i m e of Infecti on of Sf 9Insect Cells Infected w ith a R ecom 2binant Baculovirus.Cyto techno logy ,1994,15:157　6Bertheussen K .Grow th of Cells in a N ew D efined P ro tein -free M edium .Cyto techno logy ,1993,11:219082化　工　冶　金19　卷THE CUL TURE TECHNOLOG Y OF Sf 9CELL SW AN G X iaoch i Q I Y ihua OU YAN G Fan(Inst .Che m .M eta ll .,Ch inese A cad e m y of S ciences ,B eij ing 100080,Ch ina )ABSTRACT Sf 9cells are cultured staticly w ith different pH ,serum concentrati on and inoculati on densi 2ty .It is found that the cell culture is sensitive to pH change and cells hardly grow in the m edium w ith an ini 2tial pH of 7.0,pH of the culture m edium increases sligh tly during the culture and Sf 9cells can grow w ell in the m edium w ith serum concentrati on as low as 2◊.A critical inoculati on density of 104cells m l is foundnecessary fo r the grow th of Sf 9cells.KEY WOR D S Sf 9cells ,Culture techno logy ,pH ,Serum concentrati on ,Inoculating density 化工冶金研究所学位论文简介有机硫代磷酸2有机铵协萃体系萃取分离镉锌的研究 选择有机硫代磷酸作为萃取剂,合成与提纯了二2(22乙基己基)二硫代磷酸(D 2EHD T PA ,简称二硫代磷酸)和二2(22乙基己基)单硫代磷酸(D 2EHM T PA ,简称单硫代磷酸).在分别考察了其萃取效果后,进一步系统研究了这两种有机硫代磷酸与3种有机胺(伯胺N 1923、仲胺DOA 和叔胺TOA )协同萃取体系的性能与机理.总的来说,二硫代磷酸2有机胺协萃体系的萃取能力较优.对各体系,一般萃镉的能力大于萃锌的能力.硫酸盐溶液中,镉、锌分离的综合性能的优良顺序如下:D 2EHD T PA -TOA >D 2EHD T PA -DOA >D 2EHM T PA -TOA >D 2EHD T PA -N 1923,D 2EHM T PA -DOA ,D 2EHM T PA -N 1923用恒界面池法对D 2EHD T PA 2TOA 萃取镉体系进行了动力学研究,该萃取过程属于界面反应模式,表观活化能为4412kJ m o l ,反应历程为BHA i =BH +i +A -i(1)BH i +=B i +H i +(2)Cd i 2++A -i k 1k -1CdA +i (3)CdA +i +A -i k 1k -2CdA 2i (4)CdA 2(O )+BHA (O )=CdA 2 BHA (O )(5)其中式(3)与(4)为速率控制步骤,CdA +为反应活性中间产物,下标i 表示在界面上,下标(O )表示有机相,B 为有机胺,BH +为胺阳离子,A -为有机硫代磷酸根阴离子.最后,用实际的含镉、铜和锌的浸出液进行新协萃体系检验,取得了较好的分离效果,从而提出了萃取分离无渣新工艺建议流程.(摘自化工冶金研究所1997年张大力的博士学位论文,导师:柯家骏,卢立柱)1823期王晓迟等:Sf 9细胞的培养工艺。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载昆虫sf9细胞培养地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。

此细胞系适用于InsectSelect系统。

这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。

（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。

贴壁紧。

标准条件的定义：培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。

活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。

贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。

形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。

确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。

Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。

细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。