Westernblot实验操作详细步骤
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Westernblot实验操作详细步骤
1.样本制备:
a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液,破碎细胞或组织以释放蛋白质。
b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本,使其彻底破碎。
c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
2.蛋白质分离:
a.将样本加入离心管中,并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。
b.收集上清液,其中包含溶解的蛋白质。
3.蛋白质浓度测定:
a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。
b.根据需要调整蛋白质浓度,以确保每个样本使用相同的蛋白质量。
4.准备SDS-凝胶:
a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。
b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。
c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。
5.蛋白质电泳:
a.将蛋白质样本加入加载缓冲液,并在煮沸过程中使其变性。
b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。
c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物,以便于蛋白质分子量的
确定。
d.以恒定电流进行电泳,直到预定分子量标记物到达所需位置。
6.蛋白质转膜:
a.选择合适的膜材料(例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素)。
b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
c.确保膜与凝胶完全贴合,并尽量避免气泡的产生。
7.阻塞和抗体孵育:
a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。
b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液,并使用适当的稀释倍数进行孵育。
c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中,在适当的温度下进行孵育。
8.洗涤:
a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。
b.进行3至5次洗涤,每次洗涤持续5到10分钟。
9.二次抗体孵育:
a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。
b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。
10.再洗涤:
a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。
b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。
11.信号检测:
a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。
b.按照探针供应商的说明进行操作。
c.使用成像设备捕获和记录蛋白质的信号。
12.数据分析:
a.使用成像软件分析和量化膜上的信号。
b.将每个样本的蛋白质浓度与内参蛋白质进行比较,以确定相对表达水平。
c.根据需要进行统计分析。
以上是Western blot实验的详细步骤,实验操作过程中需要注意无菌操作,保持实验环境的洁净,并根据实验材料和需求进行适当的调整。