第四章 DNA的复制

第四章 DNA的复制DNA的生物合成（复制）（5学时）基本要求：1.掌握与DNA复制、DNA损伤与修复、逆转录过程有关的基本概念。

包括：半保留复制，半不连续复制，复制叉，复制子，岡崎片段，领头链，随从链，端粒，端粒酶等。

2.掌握复制的过程，以及复制过程中涉及到的各种酶、蛋白因子；并掌握原核生物与真核生物复制的相同点与不同点。

3.掌握逆转录过程，熟悉逆转录酶的应用。

4.了解引起地中海贫血和镰形红细胞贫血的分子机制。

重点：DNA分子在生物体内的合成有三种方式：（1）DNA指导的DNA合成，也称复制，是细胞内DNA最主要的合成方式。

遗传信息储存在DNA分子中，细胞增殖时，DNA通过复制使遗传信息从亲代传递到子代。

（2）修复合成，即DNA受到损伤（突变）后进行修复，需要进行局部的DNA的合成，用以保证遗传信息的稳定遗传。

（3）RNA指导的DNA合成，即反转录合成，是RNA病毒的复制形式，以RNA为模板，由逆转录酶催化合成DNA。

真核生物的DNA合成过程与原核生物基本相似，但机理尚不十分清楚，以原核生物为例介绍其复制过程。

难点：DNA的双螺旋结构是复制的结构基础。

DNA复制的实质为酶催化的脱氧核糖核苷酸的聚合反应。

复制开始时，亲代双链DNA分子解开，分别作为模板，在DNA依赖的DNA聚合酶催化下，按照碱基配对的原则，将四种脱氧核苷酸连接成DNA大分子，合成产物的碱基序列与模板DNA的碱基序列是互补的，子代DNA双链分子中，一条来自亲代的模板链，另一条为新合成的链，故称半保留复制，是生物体最主要的DNA合成方式；合成过程中，自5’→3’连续合成一条领头链，不连续地合成一些片断，而后连成一条随从链，所以DNA合成是半不连续合成。

反应过程复杂，首先螺旋松弛，双链打开，形成复制叉，然后复制的引发，包括合成引物，形成引发体，最后是DNA链的延长与终止。

每一阶段需要有许多酶和蛋白因子参与，包括拓扑异构酶，用于理顺解链过程中造成的链的盘绕、打结等现象；解螺旋酶在蛋白因子的辅助下结合于复制起始点，并打开双链，由单链结合蛋白稳定解开的两股单链；引物酶及其它辅助蛋白因子在打开的双链上催化合成引物，由引物提供3’-OH，与原料dNTP的5’-P形成磷酸二酯键，然后DNA聚合酶催化这一聚合反应的进行，而DNA连接酶将复制中的不连续片段连接成完整的链。

真核生物的复制与原核生物相比，为多个起始点、5种DNA聚合酶以及有端粒复制等特点。

一、DNA的复制基本要求：1.掌握复制叉、半不连续复制、岡崎片段、领头链、随从链等基本概念。

2.掌握拓扑异构酶、解螺旋酶、单链结合蛋白、引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶的特点及生物学作用。

3.熟悉DNA的合成过程。

4.了解半保留复制的实验依据。

基本概念：1.中心法则：遗传信息从DNA通过转录流向RNA，RNA通过翻译指导合成蛋白质，这种遗传信息的传递规律称之。

少数RNA也是遗传信息的贮存者，RNA能逆转录为DNA，是对中心法则的补充。

2.复制（replication）：即DNA的生物合成，以DNA为模板指导合成相同的DNA分子，使遗传信息从亲代传递到子代的过程。

RNA病毒的遗传信息储存于RNA分子中，可进行RNA复制并反转录合成DNA。

3.半保留复制（semiconservative replication）：DNA复制时，亲代DNA双螺旋结构解开，分别以解开的两股单链为模板，以dNTP(dATP、dGTP 、dTTP 、dCTP)为原料，按照碱基互补的原则，合成与模板链互补的新链，从而形成两个子代DNA双链，其结构与亲代DNA双链完全一致。

因子代DNA双链中的一股单链源自亲代，另一股单链为合成的新链，形成的双链与亲代双链的碱基序列完全一致，故称为半保留复制。

4.复制叉（replication fork）：原核生物DNA的复制从单一起点开始，双螺旋结构被打开，分开的两股单链分别作为新DNA合成的模板，DNA合成从起点开始向两个方向进行，与单一起点相连的局部结构形状呈“Y”型，称复制叉结构。

5.半不连续复制：复制过程中，催化DNA 合成的DNA聚合酶只能催化核苷酸从5’→3’方向合成，以3’→5’链为模板时，新生的DNA以5’→3’方向连续合成；而以5’→3’为模板只能合成若干反向互补的岡崎片段，这些片段再相连成完整的新链，故称半不连续复制。

6.岡崎片段（Okazaki fragments）：DNA双链是反向平行的，复制时，亲代双链DNA在复制叉处打开，由于新链的合成具有方向性，即从5’→3’，以5’→3’DNA链为模板合成反向互补的新链时，只能合成小片段DNA，这些片段根据发现者命名为岡崎片断。

7.领头链、随从链：DNA双链是反向的，复制时，两股链均作为模板，但新链的合成只能是5’→3’。

因此，顺着解链方向合成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链，另一股新链的复制方向与解链方向相反，复制是不连续进行的，这条不连续合成的链称为随从链。

8.引发体：是由DnaA蛋白、DnaB蛋白（解螺旋酶）、DnaC蛋白、引物酶和DNA的起始复制区域共同形成的一个复合结构。

DnaA蛋白辨认复制起始点，DnaB蛋白有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白组装到复制起始点，引物酶合成引物。

（一）、原核生物DNA的复制1．与复制有关的酶及蛋白质：（1）拓扑异构酶：通过切断并连接DNA双链中的一股或双股，改变DNA分子拓扑构象，避免DNA分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。

其种类有：拓扑异构酶I和拓扑异构酶II，拓扑异构酶I能切断DNA双链中一股并再连接断端，反应不需ATP供能；拓扑异构酶II能使DNA双链同时发生断裂和再连接，需ATP供能，并使DNA分子进入负超螺旋。

（2）解螺旋酶：DNA进行复制时，需亲代DNA的双链分别作模板来指导子代DNA分子的合成，解螺旋酶可以将DNA双链解开成为单链。

大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。

（3）单链结合蛋白（SSB）：在复制中模板需处于单链状态，SSB可以模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解。

随着DNA双链的不断解开，SSB能不断的与之结合、解离。

（4）引物酶：是一种RNA聚合酶，在复制的起始点处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。

DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合反应，若没有引物就不能起始DNA合成。

引物酶能直接在单链DNA模板上催化游离的NTP合成一小段RNA，并由这一小段RNA引物提供3’-OH，经DNA聚合酶催化链的延伸。

（5）DNA聚合酶：是依赖DNA的DNA聚合酶，简称为DNA pol，以DNA 为模板，dNTP为原料，催化脱氧核苷酸加到引物或DNA链的3’-OH末端，合成互补的DNA新链，即5’→3’聚合活性。

原核生物的DNA聚合酶有DNA polI、DNA pol II和DNA pol III，DNA pol III是复制延长中真正起催化作用的，除具有5’→3’聚合活性，还有3’→5’ 核酸外切酶活性和碱基选择功能，能够识别错配的碱基并切除，起即时校读的作用；DNA pol I具有5’→3’聚合活性、3’→5’和5’→3’核酸外切酶活性，5’→3’核酸外切酶活性可用于切除引物以及突变片段，起切除、修复作用。

另外，klenow片断是DNA pol I体外经蛋白酶水解后产生的大片段，具有DNA 聚合酶和3’→5’外切酶活性，是分子生物学的常用工具酶。

DNA pol II 在无DNA pol I和DNA pol III时起作用，也具有5’→3’和3’→5’ 核酸外切酶活性。

（6）DNA连接酶：DNA连接酶用于连接双链中的单链缺口，使相邻两个DNA 片段的3’-OH末端和5’-P末端形成3’,5’磷酸二酯键。

DNA连接酶在DNA复制、修复、重组、剪接中用于缝合缺口，是基因工程的重要工具酶。

2．DNA的合成过程、复制的特点：可将复制过程分为起始、延长和终止三个阶段。

复制起始：（1）辨认起始点，合成引发体：在E.coli，复制起始点称为oriC，具有特定结构能够被DnaA蛋白辨认结合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白结合于起始点，DNA双链局部被打开，引物酶及其他蛋白加入，形成引发体。

（2）形成单链：DNA进行复制时，首先在拓扑异构酶作用下，使分子的超螺旋构象变化，然后在解链酶的作用下，解开双链，才能开始进行DNA的合成。

解螺旋酶在蛋白因子的辅助下打开DNA双链，单链结合蛋白SSB 结合于处于单链状态模板链上；拓扑异构酶使DNA分子避免打结、缠绕等，在复制全过程中起作用。

（3）合成引物：引发体中的引物酶催化合成RNA引物，由引物提供3’-OH基，使复制开始进行。

领头连和随从链均由引物酶合成引物，随从链在复制中需多次合成引物。

复制延长：（1）复制方向：原核生物如E.coli，只有一个起始点oriC，两个复制叉同时向两个方向进行复制，称为双向复制。

（2）链的延长：按照与模板链碱基配对的原则，在DNA聚合酶III的作用下，逐个加入脱氧核糖核酸，使链延长。

由于DNA双链走向相反，DNA聚合酶只能催化核苷酸从5’→3’方向合成，领头链的复制方向与解链方向一致，可以连续复制，而另一股模板链沿5’→3’方向解开，随从链的复制方向与解链方向相反，复制只能在模板链解开一定长度后进行，因此随从链的合成是不连续的，形成的是若干个岡崎片段。

DNA聚合酶I的即时校读，DNA聚合酶III的碱基选择功能，使复制具有保真性。

复制终止：原核生物如 E.coli，他的两个复制叉的汇合点就是复制的终点。

由RNA 酶切去领头链和随从链中的引物，引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化，四种脱氧核糖三磷酸为原料自5’→3’方向延长填补。

最后，DNA连接酶由ATP供能，将两个不连续片段相邻的5’-P和3’-OH连接起来，成为连续的子链，复制完成。

（二）、真核生物的复制：真核细胞的一生可以定义为一个细胞周期，细胞增殖时，DNA通过复制使其含量成倍增加，随后细胞分裂，成为两个子代细胞，DNA将亲代的特征传递到子代。

细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，DNA的复制只发生在S 期。

与原核生物相比，真核生物的复制具有以下特点：1.多复制子：真核生物的DNA复制也是半保留复制。

染色体线性分子的复制有多个起始点，每个起始点由两个反向运动的复制叉组成，进行双向复制。

由一个起始点控制的DNA复制称为一个复制子。

2.5种DNA聚合酶：与原核生物不同，真核细胞含有5种DNA聚合酶：α、β、γ、δ和ε。

除了γ外，所有DNA聚合酶存在于核内。

DNA聚合酶α和δ在复制延长中起催化作用，DNA聚合酶α延长随从链，DNA聚合酶δ延长领头链。

DNA聚合酶β和ε在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。